Sommario Lo spermiogramma rappresenta l’indagine dilaboratorio di primo livello nell’iter diagnostico del maschioinfertile. È un’analisi specialistica che necessita di un labo-ratorio dedicato e di una formazione specifica in seminolo-gia. È importante sottolineare che la valutazione seminaledeve essere basata su criteri scientifici e metodologici con-divisi. Questo è reso possibile dall’utilizzo dell’ultima edi-zione del Manuale WHO. In tal modo, l’esame del liquidoseminale potrà rappresentare uno strumento utile all’andro-logo per una corretta diagnosi e un’adeguata impostazioneterapeutica.
Parole chiave Infertilità maschile · Spermatozoo ·Spermiogramma
Introduzione
L’esame del liquido seminale costituisce l’indagine di labo-ratorio di primo livello che definisce la potenzialità fecon-dante del partner maschile di una coppia ed è indispensabileper la valutazione della salute del maschio, in relazione allapresenza di patologie andrologiche da prevenire o da tratta-re. Tale indagine, inserita in un iter diagnostico appropriato,
Proposta da Fabio Lanfranco.
Materiale elettronico supplementare La versione elettronicadi questo articolo (DOI:10.1007/s40619-014-0031-z) contienemateriale supplementare, disponibile per gli utenti autorizzati.
L. Gandini (B) · F. Lombardo · D. Paoli · A. LenziDipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di FisopatologiaMedica ed Endocrinologia, Università di Roma “La Sapienza”,Policlinico Umberto I, Viale del Policlinico 155, 00161 Roma,Italiae-mail: [email protected]
consente di impostare terapie mediche o chirurgiche o di in-dirizzare la coppia verso la fecondazione assistita. Infine, èl’indagine necessaria per realizzare un programma di crio-conservazione del seme in caso di patologie che necessitinodi terapie potenzialmente sterilizzanti. Tale esame trova lasua indicazione principale nell’inquadramento diagnosticodell’infertilità maschile.
L’infertilità maschile può essere definita, secondo i pa-rametri della WHO, come l’impossibilità di indurre gravi-danza dopo almeno dodici mesi di rapporti liberi e mirati alperiodo ovulatorio della partner in perfette condizioni clini-che. Questa definizione sottolinea che è necessario un tem-po piuttosto lungo perché il ritardo di concepimento divengastatisticamente significativo e deviante rispetto a un periododi tempo considerato normale per giungere alla fecondazio-ne, e che è importante considerare lo stato di fertilità dellapartner. Infatti, la potenzialità fecondante deriva dall’inte-grazione della potenzialità dei due componenti della cop-pia singolarmente intesi. In particolare, l’infertilità maschilerappresenta una condizione patologica a eziologia multipla ecomplessa, la cui azione patogenetica si sviluppa talora giàin età pediatrica o addirittura embrionale. Il momento dia-gnostico dell’infertilità maschile può avvenire a distanza dimolti anni dall’azione patogenetica. Frequentemente, quin-di, la diagnosi eziopatogenetica è difficile e l’alterazione delliquido seminale rappresenta l’unico elemento in grado diguidare la successiva decisione clinica.
Analisi seminale
L’esame del liquido seminale rappresenta il punto di parten-za e l’analisi guida per l’impostazione del successivo iterdiagnostico (Figg. 1, 2). Come in tutte le analisi di labora-torio, anche per lo spermiogramma dobbiamo distinguere:
(1) la fase pre-analitica; (2) la fase analitica; (3) la fase post-analitica. Tutte queste fasi richiedono una uguale attenzionedel laboratorista e del clinico che le interpreta, in quanto unerrore in una di queste fasi può alterare l’attendibilità delrisultato finale (Fig. 3) [1].
Fig. 1 Quadri citologici del liquido seminale a fresco (senzacolorazione 200×)
Percorso metodologico
La fase pre-analitica comprende le norme relative alla rac-colta del liquido seminale e la successiva processazione delcampione. Particolare importanza assume il periodo di asti-nenza da eiaculazioni prima della raccolta, indispensabileper poter standardizzare la quantità e qualità degli sperma-tozoi prodotti, per potere effettuare confronti con altri esa-mi precedenti o successivi e per l’interpretazione dell’esa-me seminale rispetto ai valori di riferimento. Tale periododeve essere compreso fra i 3 e i 5 giorni. Il liquido va rac-colto per masturbazione in un contenitore sterile; solo incasi eccezionali, quando il paziente non riesca a effettua-re la masturbazione o abbia prevenzioni di carattere mora-le, può essere consentita la raccolta in profilattici speciali,composti da materiali non spermicidi; assolutamente proibi-ta la raccolta mediante coito interrotto, in quanto può por-tare a piccole perdite di liquido durante la raccolta e puòinquinare il campione con materiale proveniente dalla vagi-na. È preferibile che il campione venga raccolto in labora-torio, specie se esistono motivi medico-legali (es. criocon-servazione del seme, cause di disconoscimento di paterni-tà) che impongono tale scelta. È, tuttavia, accettabile cheil campione venga raccolto in altra sede (es. ambiente do-
mestico) per motivi psicologici o organizzativi. Il campionedeve essere consegnato entro 30–60 minuti dall’eiaculazio-ne, se raccolto in sede diversa dal laboratorio, deve esse-re protetto dalle eccessive escursioni termiche e trasportatosenza capovolgere il contenitore per evitarne la fuoriusci-ta e per provocare il minor traumatismo cellulare possibile(Fig. 4).
È importante che il paziente non abbia effettuato terapiemediche o chirurgiche o abbia avuto febbre elevata nei tremesi precedenti l’esame.
La fase analitica va distinta in due momenti successivi:valutazione macroscopica e microscopica.
La valutazione macroscopica consente di determinare iseguenti parametri: volume, pH, aspetto, fluidificazione eviscosità. Tali variabili forniscono importanti informazionirelative alla pervietà delle vie genitali maschili e a eventualipatologie flogistiche delle ghiandole accessorie.
La valutazione microscopica analizza la componente ga-metica e non gametica presente nel liquido seminale. Per lavalutazione dei gameti maschili è necessario rilevare semprei seguenti tre parametri: numero, motilità e morfologia. Nondevono essere considerati validi i referti che non riportino letre voci con i dettagli, in quanto privi di valore clinico.
La concentrazione dei gameti deve essere valutata sia perml che per eiaculato totale. È importante ricordare che il nu-mero totale di spermatozoi per eiaculato fornisce la valuta-zione della funzionalità del testicolo, perché annulla la va-riabile confondente del volume plasmatico e indica la realeattività spermatogenetica testicolare e l’eventuale danno deitubuli seminiferi.
La motilità rappresenta senza dubbio una proprietà fon-damentale dello spermatozoo. Il movimento dello sperma-tozoo è di tipo flagellare e consiste in una serie di onde chesi originano alla base del flagello e si propagano lungo que-st’ultimo, per cui la testa viene spinta in avanti passivamentecon oscillazioni ritmiche di ampiezza regolare. La progres-sione dello spermatozoo nello spazio è in realtà dovuta al-la sommazione di due tipi di movimento, uno oscillatorio euno rotatorio intorno all’asse longitudinale che attraversa lacellula nella sua lunghezza. La propagazione dell’onda pro-duce una spinta idrodinamica che assicura la progressione
dello spermatozoo attraverso il tratto genitale femminile ela penetrazione dell’ovocita. Una motilità ridotta o assente èuna causa frequente di infertilità maschile e rappresenta unsegno clinico piuttosto che una vera e propria diagnosi. L’al-terazione della motilità è correlata a quasi tutte le patologieandrologiche, non è pertanto un sintomo patognomonico disingole patologie.
La morfologia nemaspermica è un parametro particolar-mente complesso da valutare, in quanto la spermatogenesiumana è certamente la più fallimentare dal punto di vistaqualitativo. Lo spermatozoo è costituito da una testa, un col-lo e una coda. La testa è costituita, a sua volta, dal nucleoe dall’acrosoma. Il nucleo, compatto e condensato, contie-ne DNA con assetto cromosomico aploide ed è rivestito perdue terzi dal complesso acrosomiale. Il collo, rappresentatoda un tratto molto breve che si estende dalla parte poste-riore della membrana nucleare fino al punto di unione del-la testa con il segmento intermedio della coda. La coda sidivide in un “segmento intermedio”, un “segmento princi-pale” e un “segmento finale”. Per considerare normale unospermatozoo, sia la testa che la coda devono essere normali.La testa dovrebbe essere di forma ovale con contorni rego-lari. Il tratto intermedio dovrebbe essere sottile e regolaree allineato con l’asse maggiore della testa dello spermato-zoo. Il tratto principale dovrebbe avere un calibro unifor-me lungo tutto la sua lunghezza, essere più sottile rispet-to al tratto intermedio. Ma nell’eiaculato la maggior partedi gameti presenta differenti tipi di alterazioni; tali difettimorfologici possono coinvolgere uno o più domini cellulari(Fig. 5) [2].
La valutazione della componente non gametica consen-te di definire la presenza di leucociti, emazie, elementidella linea germinativa (spermatogoni, spermatociti, sper-matidi) (Fig. 6), cellule epiteliali di sfaldamento, zone dispermioagglutinazione, corpuscoli prostatici.
La fase post-analitica consiste nella definizione di un re-ferto chiaro e dettagliato. La refertazione dell’esame semi-nale deve essere la più completa possibile, anche in fun-zione della sua valenza medico-legale, e deve prevedere ladescrizione di tutti i parametri esaminati (Fig. 7).
Molto spesso, l’esame del liquido seminale viene effet-tuato con scarsa competenza specifica, come se si trattassedi un’analisi non specialistica. Da anni sia la WHO che leSocietà Scientifiche nazionali e internazionali hanno predi-sposto protocolli condivisi di standardizzazione delle proce-dure dell’esame del liquido seminale e proposto standard diriferimento. Tali protocolli hanno un ruolo fondamentale inquanto tentano di uniformare, quanto più possibile, i criteridi valutazione del liquido seminale. Chiunque sia coinvol-to nel campo della Seminologia sa quanto sia difficile ave-re dei criteri comuni di analisi, poiché la valutazione dellacellula nemaspermica dipende prevalentemente dal sapere edall’esperienza del seminologo.
L’Endocrinologo
Fig. 5 Quadri morfologicinemaspermici dopo colorazione(May-Grünwald-Giemsa1000×). (A) Forme normali;(B, C) forme atipiche
Fig. 6 Quadri morfologicicellule germinali
Manuale della WHO 2010
Il Manuale della WHO, pubblicato la prima volta nel 1980e aggiornato tre volte successivamente, ha avuto lo scopodi definire una standardizzazione delle procedure necessa-rie per l’esecuzione dell’esame del liquido seminale umano.Nel 2010 [3, 4] è stata pubblicata la quinta edizione che, ri-spetto alle precedenti, appare arricchita di nuovi argomentie notevolmente ampliata nella descrizione metodologica, alfine di migliorare la qualità e la comparabilità dei risultati.Quest’ultima edizione è costituita da tre parti: analisi del li-quido seminale, preparazione degli spermatozoi, controllo diqualità. La prima parte ricalca le edizioni precedenti ed è de-dicata alla corretta esecuzione della fase pre-analitica, ana-litica e post-analitica dello spermiogramma e alle indagini
ad esso correlate come la ricerca degli anticorpi antisperma-tozoo, i dosaggi biochimici del plasma seminale e l’anali-si computerizzata della cinetica nemaspermica. Tali capitoliappaiono molto dettagliati per quanto riguarda procedure einterpretazioni e sono arricchiti di numerosi esempi. La se-conda parte è divisa in due capitoli, dedicati il primo allaselezione degli spermatozoi sia dal liquido seminale che daltesticolo e dall’epididimo, e il secondo alla crioconserva-zione degli spermatozoi. Infine, la terza parte ribadisce che,data la complessità dell’analisi seminale, è opportuno cheil laboratorio di seminologia sia dotato di un programma dicontrollo di qualità basato su metodi e procedure standardiz-zati, per garantire accuratezza e precisione dei risultati semi-nali. Non dobbiamo dimenticare che la distribuzione casualedegli spermatozoi nel liquido seminale è la fonte principa-
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Fig. 7 Referto esame delliquido seminale
le della mancanza di precisione nei risultati dello spermio-gramma e che la valutazione di concentrazione, motilità emorfologia degli spermatozoi si esegue contando un numerolimitato di spermatozoi, che si presume essere rappresentati-vo della totalità del campione. Per tale motivo, il controllo diqualità interno ed esterno diventa essenziale non solo per ri-levare e correggere gli errori casuali e sistematici, ma ancheper comprendere l’elevata variabilità di risultati.
Nella prima sezione, per quanto riguarda la valutazionedel numero degli spermatozoi, viene ribadita l’importanzadi porre estrema attenzione agli errori di campionamento ealla certezza dei risultati numerici ottenuti. Il comitato diredazione ha ritenuto, finalmente, di sottolineare che il nu-mero totale di spermatozoi per eiaculato fornisca una valuta-zione più accurata della funzionalità testicolare rispetto allaconcentrazione degli spermatozoi per ml, mettendo in risalto
l’importanza di un calcolo estremamente preciso del volumeseminale.
Un cambiamento rilevante rispetto alle precedenti edizio-ni è la valutazione della motilità nemaspermica; alla luce delfatto che il parametro velocità è difficilmente valutabile equantizzabile dall’occhio umano e, quindi, fonte di in accu-ratezza, è stata, finalmente, eliminata la distinzione tra mo-tilità rapida e lenta. Attualmente viene consigliato di utiliz-zare la seguente classificazione: motilità progressiva (PR):lo spermatozoo si muove attivamente, in modo lineare o nonlineare; motilità non-progressiva (NP): lo spermatozoo nonè in grado di progredire nello spazio, per esempio quando lacellula nemaspermica descrive piccoli circoli oppure agita latesta o la coda rimanendo in situ; immobilità (IM): assenzadi movimento.
Nel nuovo Manuale, la valutazione della morfologia ne-
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Tabella 1 Valori minimi diriferimento dei parametriseminali secondo il ManualeWHO 2010 [3] (5° percentile eintervallo di confidenza del95%)
maspermica non è sostanzialmente mutata, ma viene sotto-lineato come tale parametro sia difficile da standardizzare acausa di numerosi fattori confondenti, quali le molteplici ca-ratteristiche di testa e coda degli spermatozoi, la mancanzadi oggettività e la variazione nell’interpretazione. Al fine dimigliorare la classificazione delle atipie sono state aggiun-te numerose tavole costituite da fotografie di migliore qua-lità, corredate da interpretazioni delle cellule presentate. Ilmetodo raccomandato dal Manuale WHO 2010 è la clas-sificazione tipico/atipico, con il conteggio opzionale dellalocalizzazione delle atipie negli spermatozoi.
Ovviamente, il dato più atteso e che suscita da semprele maggiori controversie ad ogni edizione del Manuale, è ladefinizione dei valori di riferimento dei parametri nemasper-mici. Tali valori derivano dai dati seminali di uomini fertiliche entro 12 mesi dalla gravidanza hanno effettuato l’esameseminale in laboratori di 8 paesi e 3 continenti, in cui sonostati impiegati protocolli standardizzati.
Nelle precedenti edizioni venivano utilizzati come valoridi riferimento media e deviazione standard, mentre nell’edi-zione del 2010 tali valori sono stati sostituiti con i percenti-li, perché i parametri seminali non seguono una distribuzio-ne gaussiana normale, ma seguono una curva asimmetricaa sinistra o a destra. Il 5° percentile viene dato come limi-te inferiore di riferimento, per cui un individuo può essereancora potenzialmente fertile anche se con probabilità ridot-te. Tali valori devono essere considerati come valori minimidi potenzialità fecondante per vie naturali e non valori dinormalità. È importante ricordare che vengono generalmen-te considerati normali i valori più frequenti (e quindi pro-babili) rilevati in una popolazione apparentemente sana, inquanto si suppone che ogni specie tenda a contenere le va-riazioni delle grandezze biologiche entro certi limiti. Comesempre, il dato più difficile da determinare è cosa si inten-de per normalità quando si ha a che fare con un fluido bio-logico come il liquido seminale. Infatti, poiché le variabililaboratoristiche si riferiscono allo stato di salute di un indi-viduo, ci attenderemmo di avere a disposizione valori nor-mali derivanti dall’osservazione di individui sani. Un primoproblema, strettamente clinico, è proprio insito nel concet-to di “sano”, che non coincide necessariamente con fertile
e, viceversa, un individuo affetto da patologie severe cometumori testicolari o linfomi può avere una buona spermato-genesi ed essere fertile; inoltre, essendo la fertilità un eventobiologico probabilistico che coinvolge due individui i termi-ni di normalità e probabilità, non hanno lo stesso significatodal punto di vista statistico e biologico-clinico.
Questo dato, peraltro, si dimostra estremamente infido seviene utilizzato per definire la fertilità dell’individuo. Infatti,molto diverso sarà il risultato se lo stesso parametro concen-trazione degli spermatozoi viene studiato in una popolazio-ne selezionata di soggetti fertili quali, ad esempio, soggettiche si sottopongono a vasectomia per scopi antifecondativi,o soggetti con prole o partner di donne gravide. In questigruppi riterremmo, teoricamente, di trovare tutti individuicompresi nel nostro range di normalità mentre, al contrario,incontreremo numerose eccezioni. Infatti, non esiste un ve-ro limite minimo di concentrazione di spermatozoi in gradodi fecondare, dato che si può ottenere una gravidanza anchecon valori inferiori a un milione di spermatozoi, a condizio-ne che si tratti di spermatozoi mobili, normoconformati edotati di buona capacità fecondante.
Un punto cruciale dei parametri di riferimento del Ma-nuale WHO 2010 è certamente quello relativo alla morfo-logia nemaspermica (Tabella 1). Infatti, il limite inferioreindicato per le forme normali è il 4% (5° percentile, 95% CI3,0–4,0); questo significa che un individuo viene considera-to ancora potenzialmente fertile se ha più del 95% di gametialterati. La variabilità morfologica degli spermatozoi umanirende la valutazione della morfologia difficoltosa, anche al-la luce del dato biologico innegabile che non esiste lo sper-matozoo perfetto. Infatti, la specie umana è caratterizzatada una spermatogenesi altamente imperfetta, il cui prodot-to finale è rappresentato da gameti con assetto morfologicoestremamente variabile; tale polimorfismo non necessaria-mente è associato ad alterata capacità fecondante e, quindi,a una struttura cellulare patologica. Infine, è biologicamentecorretto definire uno spermatozoo come anomalo se è pro-fondamente alterato, cioè diverso dalla forma attesa tipicadella specie; è, invece, opinabile considerare come anomaliepiccole differenze di dimensioni rispetto al fenotipo nema-spermico. Tali forme, se considerate anomale, contribuisco-
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Tabella 2 Distribuzione deivalori seminali relativi a uominile cui partner hanno ottenutouna gravidanza entro 12 mesidalla sospensione di metodicontraccettivi [3]
no inevitabilmente a elevare la quota di spermatozoi morfo-logicamente alterata. Inoltre, molto diverso sarà il risultatoin termini di probabilità di ottenere gravidanza se si conside-rano separatamente i tre parametri seminali (numero totale,motilità e percentuale di forme tipiche). Infatti, la reale capa-cità fecondante deriva strettamente dall’integrazione di talicaratteristiche, e un individuo sarà tanto più fertile quantomaggiore sarà il numero di spermatozoi mobili e normocon-formati. Di conseguenza, il limite inferiore del 4% di formenormali viene ad assumere un peso differente se riferito auna normozoospermia o a una severa oligozoospermia.
Se, quindi, si utilizza come limite di riferimento solo il 5°percentile, sarà estremamente difficile l’interpretazione cli-nica dei parametri seminali, in particolare la morfologia, inquanto il confine tra fisiologia e patologia è talmente flebileda ridurre al minimo la potenzialità diagnostica dell’esameseminale e il successivo iter terapeutico [5–11].
Alla luce di tali considerazioni, per un inquadramento cli-nico dell’esame seminale sarà importante utilizzare anche il50° e il 95° percentile; questo consentirà, da un lato, di capi-re come in realtà sia diversa la spermatogenesi di uomini fer-tili dai valori minimi del 5° percentile e, dall’altro, di avereuna visione della potenzialità fecondante più probabile delpaziente (Tabella 2).
È importante, infine, ricordare che una corretta e comple-ta valutazione seminale è il presupposto per una corretta dia-gnostica dell’infertilità maschile la quale, a sua volta, con-sente all’andrologo un’adeguata impostazione terapeutica eun’eventuale indicazione alla fecondazione assistita, utile asuperare l’infertilità maschile nei soli casi incurabili. Inol-tre, è necessario sottolineare che lo spermiogramma, esegui-to secondo le norme indicate dal Manuale della WHO, nonè un’analisi routinaria di comune esecuzione né può esse-re improvvisata, ma presuppone un laboratorio dedicato conattrezzature ottiche di ultima generazione e una formazionespecifica in seminologia che dovrebbe essere certificata da
un adeguato numero di analisi eseguite sotto la guida di unesperto seminologo.
Conflitto di interesse Gli autori Loredana Gandini, Francesco Lom-bardo, Donatella Paoli e Andrea Lenzi dichiarano di non avere conflittidi interessi.
Consenso informato Lo studio presentato in questo articolo non harichiesto sperimentazione umana.
Studi sugli animali L’autrice di questo articolo non ha eseguito studisugli animali.
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