rine scientifica, particolari og·

~. nel suo corpo zione dei prin· · le sue espres-

atteri e di virus a delle malattie e della biologia ttori puri sono tilizzano larga­; patogeni e di

re alla n cerca scenza e utilità lamente fonda­a scienza solo

me prima p er ;iva tra i cul­lee. Gli Annali p ubblicazione

3 questi scambi rova garantita ' . . zswnomta.

G. S.

ESPERIENZE E RICERCHE

Studio serologico delle leptospire appartenenti al tipo ballum

ANTONIO THOMAKOS (*) e BRENNO BAB UDI ERI

Laboratori di M icrobiotogia

Riassunto. - Nell'ambito del serotipo ballum delle leptospire viene identificato un nuovo subserotipo : quello arboreae (ceppo di referenza : :< Arborea '')· A questo subserotipo appartiene la maggior parte dei ceppi finora attribuiti al subserotipo ballum ballum.

Di conseguenza il serotipo ballum viene suddiviso m tre subserotipi : ballum, castellonis, arboreae.

Summary. - Within the leptospira serotype ballum a new subserot ype was identified: the subserotype arboreae (reference strain << Arborea n). The majority of the strains attributed so far t o the subserotype ballum ballum must b e enrolled in this subserotype. The results of t h e agglutinin absorp­tion t est made with all the strains of our collection belonging to t he serotype ballum, are reported.

Consequently the serotype ballum was divided in the following three subserotypes : ballum, castellonis, arboreae.

Il serotipo ballum fu creato da BoRG PETERSEN (1944) per una lepto­spira isolata da un esemplare di Mus musculus spicilegus risultata antige· nicamente differente da tutti gli altri serotipi allora conosciuti. Successiva­mente risultò che già nel 1941 W o)ff, Schueffner e Bohlander avevano isolato da un topo una leptospira che aveva le medesime caratteristiche antigeniche di quella di Borg P etersen (WoLFF, BoHLANDER & RuYs, 1949). Altri ceppi del t ipo ballum furono in seguito isolati in vari paesi europei ed an ch e in America.

Nel1955 uno di noi (BABUDIERI, 1955) dimostrò che 4 ceppi di leptospire isolate nella regione di Castell6n (Spagna) differivano dal ceppo di referenza

('•) Borsista dei Laboratori di Microbiologia.

Ann. I st. Super. Sa•vità (1965) 1, 407 ·4 11.

408 ESP E RIENZE E IHCERCRE

del tipo ballum (ceppo cc Mus 127 n) in maniera tale da giustificare la suddi­visione di tale serotipo in due subserotipi. La proposta fu accolta dal Sub­comitato delle leptospire dipendente dal Comitato internazionale della no­m enclatura batterica ed il serotipo ballum fu di conseguenza suddiviso in due subserotipi : ballum ballum (ceppo di referenza cc Mus 127 n) e ballum castellonis (ceppo di referenza cc Cast ell6n 3 »). Ceppi appartenenti a questo ultimo suhserotipo furono isolati anche nella Francia meridionale.

Lo stesso anno BABUDIERI & MoscOVICI (1955) hanno isolato ad Arbo­rea (Sardegna) da un esemplare di Apodemus sylvaticus un ceppo (ceppo c• Arborea n) che, saggiato con un siero anti-castellonis adsorbito con il ceppo cc Mus 127 » risultò attribuibile al subserotipo ballum castellonis. Alcune parti­

colarità del suo comportamento serologico ci hanno però indotti a studiare più a fondo la sua costituzione antigeni ca ed a confrontare fra di loro tutti i ceppi appartenenti al serotipo ballum conservati nella collezione dell' I sti­tuto Superiore di Sanità.

Questo studio fu condotto con i procedimenti delle agglutinazioni cro­ciate e degli adsorbimenti crociati eseguiti e valutati secondo le prescrizioni del gruppo di studio delle leptospire della WHO/FAO (1959).

Una prima ricerca ebbe per oggetto il confronto fra il ceppo cc Arborea 11

ed i due ceppi di referenza dei subserotipi del tipo ballum.

I sieri usati per le prove, ottenuti dai conigli, aYevano i seguenti t itoli agglutinanti per i ceppi omologhi :

Siero anti-Castell6n 3 = l : 10.000

Siero an ti-Arborea = l : 10.000-l : 20.000

Siero anti-Mus 127 = l : 2.000.

Tutte le prove di adsorbimento e di agglutinazione furono ripetute più volte. I risultati ottenuti sono espos ti n ella Tabella l.

Questi risultati e più specialmente quelli ottenuti dall'adsorbimento del siero anti-CasteH6n 3 con il ceppo cc Arborea » c del siero anti-Arborea con il ceppo cc Mus 127 » ci autorizzano ad affermare che il ceppo cc Arborea ,, appartiene ad un nuovo subserotipo del serotipo ballum. Proponiamo per esso il nome di ballum arboreae. P er quanto riguarda la ricch ezza di frazioni antigeniche, a l primo posto, nel serotipo ballum, viene il subserotipo castel­lonis, al secon do quello arboreae, al t erzo quello ballum.

Abbiamo voluto in seguito esamina re tutti i ceppi del serotipo ballum appartenenti alla nostra collezione per determinare con esattezza il subse­rotipo a cui essi appartengono. P er ques to scopo i ceppi sono stati prima saggiati con un siero anti-Arborea adsorbito con il ceppo cc Mus 127 » ; sue-

. lnn. Isl. S ttJJer. S anità (1965) 1, 407-411 .

cessivament< sono stati ~

« Arborea 11.

È stato appartengon

«Cast gn a), «Cast el

P re

Anti-Caste]

I dem adsot

Anti-Caste]

Idem adsot

Anti-Arbor• Idem adso•

Anti-Arbor• Idem adsor

Anti-Mus l

Idem adso•

Anti-Mus l I dem adso1

(*) I titoli il titolo di ciasc

Per con abbiamo alle sieri immuni

iustifìcare la suddi­fu accolta dal Suh­nazionale della no­uenza suddiviso in us 127 ») e ballum artenenti a questo teridionale.

o isolato ad Arbo-un ceppo (ceppo

orbito con il ceppo mis. Alcune parti­indotti a studiare ·e fra di loro tutti ollezione dell' l sti-

gglutinazioni cro­tdo le prescrizioni )59).

ceppo « Arborea »

> i seguenti titoli

furono ripetute

tll'adsorbimento ro anti-Arborea ·ppo << Arborea »

>roponiamo per ~zza di frazioni >serotipo castel-

;erotipo ballum :tezza il subse­no stati prima [us 127 >> 1 sue-

(1 965 ) 1, 407-Hl .

THOMAKOS E BABt:DIERI 409

cessivamente i ceppi che vemvano agglutinati da tale siero adsorbito sono stati saggiati con un siero anti-Castell6n 3 adsorbito con il ceppo << Arborea >> .

È stato così possibile stabilire che al subserotipo ballum castellonis appartengono i seguenti ceppi :

« Castell6n l >> (Spagna), « Castell6n 2 >> (Spagna), << Castell6n 3 >> (Spa­gna), « Castell6n 4 >> (Spagna), << Camarles >> (Spagna), « Rocamora » (Argentina).

TABELLA l.

Prove di adsorbimento con i sieri immuni preparati con ceppi di riferimento dei subserotipi del tipo « ballum ».

- - -l 'l':tolo (• ) del s ieo-n lll'ima

c dopo l ' adsoriJimcnto

s I E R o Ceppi di ri fe rim ento

Castl'll6n 31 A rbon ·a l Mus 12i

Anti-Cast ellòn 3 100 25- 100

l 20- 50

Idem adsorbito con « Arborea > 50- 100 < 2 < 2

l '

Anti-Castellòn 3 100 l 100 100 Idem adsorbito con «i.VIus 127» 50 l 20 < l

--An ti-Arborea

l 100 100 l 50- 100

Idem adsorbito con « Castellòn 3» < l < l l

1-2 -

An ti-Arborea

l 100 100 50

Idem adsorbito con «Mus 127 » 10- 20 10- 20 l-< l

Anti-Mus 127 l

200

l 200 l 100 l

l Idem adsorbito con « Cast ello n 3" < 2 < 2 l

< 5 l l

Anti-Mus 127 200

l 200

l 100

Idem adsorbito con «Arborea " < 2 < 2 < S

(*) I titoli delle agglutinazioni sono riportati in percentuali, considerando uguale a 100 il titolo di ciascun siero prima dell'adsorbimento, rispetto al ceppo omologo.

P er controllare, almeno parzialmente, l'omogeneità di questo gruppo, abbiamo a11estito una serie di adsorbimenti crociati, mettendo a contatto i sieri immuu\ per i 4 ceppi « Castellon >> e quello per il ceppo « Arborea », con

A nn. 1st. Super. Sanità (1965) 1, 407 ·411.

410 ESPERIENZE E RICERCHE

ciascuno di questi cinque ceppi e saggiando poi i sieri così adsorbiti con tutti i ceppi in quest ione. I risultati di quest e prove sono stati piuttosto uniformi e ci permettono di affermare che fra i 4 ceppi << Castellon n non esistano dif­ferenze antigeniche di particolare entità. L'unico rilievo che si può fare è quello che il siero anti-Castellon l adsorbito con il ceppo « Arborea '' perde una maggiore quota di anticorpi di quanto facciano i sieri immuni preparati con gli altri tre ceppi « Castellon ''·

l

I risultati di quest e prove sono riportati nella Tabella 2.

TABELLA 2.

Prove di adsorbimento crociato dei sieri immuni ad opera di ceppi appartenenti ai subserotipi ~ castellonis ,. ed • arborea "·

l Titoli (•) residui per i diversi ceppi

di riferimento

5 l E R o .-\.dsorbito con Castell6n e l l l l

o l 2 3 4 "' .;J

l l

Castellòn 2 < l < 5 2 2 l

Anti-Castellòn l

l )) 3 l < 5 < 2 l < l )) 4 l l 5 5 4

l Arborea 15 15 25 30 < l

Castellòn l 2 2 l 6 <I

.-\nti-Castellòn 2 )) 3 6 6 3 4 < l )) 4 l l 2 l l

l l Arbor ea

l 50 30 50 50 < I

Cast ellòn l < lO < 2 < 10 l < lO < lO

Anti-Castellòn 3 » 2 <2 < 2 < 2 l < 2 )) 4 <2 < 2 < 2 < l <2

Arborea 50 40 40 30 <2

Castellòn l < 2 < l < I <2 <l

Anti-Castellòn ..J. )) 2 2 < l < l < 2 < l )) 3 2 < l < I 2 < l

l Arborea l

50 30 40 100 < l

l Castello n l l l 5 4 2

An ti-Arborea )) 2 2 l l 2 l » 3 2 l l 2 2 )) 4 5 2 2 < l 2

(*) I ti toli d elle agglut inazioni sono riportati in percentuali , considerando uguale a 100 il titolo di ciascun siero prima dell'adsorbimento, rispetto al ceppo omologo .

.d nn. I st. Su11er. S anità (1965) l , 407-411.

Al subs

«Arb ref

« Mu~

uLT «LT « Ar « R 3 uR 4 « Ric « Ric « Ric « Ric

Tutti qu< con il ceppo residuo del si titolo, per qu

P er a' assegnati a

(Tit olo l : ! stato saggi; tolo < l : ~

Al sul: « Mus 127 '

13 magg

B ABUDIERI, l BABUDIERI, l Bonc PETER

WHO{FAO, g Rep. Se1

WOLFF, J. ~ Serol. 1!

>rbiti con tutti .t ost o uniformi n esistano dif-si può fare è rborea » perde nuni preparati

TABELLA 2.

i ceppi

'·

r i di vers i ceppi ncnto

-,-4 2 l l < l 5 4

30 < l

6 < l 4 < l l l

50 < l

l l < 10 : l : < l l 30

< 2 < 2

2 l 100

< l O < 2 < 2 < 2

< l < l < l < l

----!..--1

4 2

2 l

2 2 < l 2

tdo u gu ale a 100 ;o.

196.;) l , 4.0H,Il .

TllO)IAKOS E BABCDIERI 411

Al subserotipo ballum arboreae appartengono segu enti ceppi :

« Arborea >> (Italia : ceppo di referen za) (10-20)

<• Mus 29 >l (Danimarca) (12) ,, LT 2 » (Stati Unit i) (12-25) ,, LT 51 » (Stati Uniti) (12-25) << Ar A 52 >> (Francia) (25) << R 35 Farina » (Italia) (12-25) << R 43 >> (Italia) (12-25) << Riccio 21 >> (Italia) (12) 11 Riccio 31 >> (Italia ) (1 2-25) « Riccio 88 >> (Italia) (12-25) « Riccio 122 >> (Italia) (12-25)

'' S 102 » (Olanda) (lO) « W eisse Ma us >> ( Cecoslovac-

chia) (12) « LT 18 '' (Stati Uniti) (12-25) << Ba A 52 » (Francia) (12)

<< F rankfurt >> (Germania) (12-25)

<< R 42 >> (Italia) (12)

« Riccio 7 '' (Italia ) (12-25)

« Riccio 23 '' (Italia) (12) << Riccio 69 >> (Italia) (12-25)

<< R iccio 110 » (Italia) (12-25)

Tut ti questi ceppi sono sta ti saggia ti ripetutamente con sieri anti-Arborea adsorbiti con il ceppo uMus 127 , . Tra p arentesi v ien e riportato il valore percentuale d el titolo r esiduo del siero adsorbito, risp etto ad ogni singolo ceppo, con siderando u gu ale a l 00 il titolo, per quel determinato ceppo, del siero anti-Arborea n on adsorbito.

P er avere un' ulteriore conferma dell'omogeneità del gTnppo di ceppi assegnat i al subserotipo arboreae, abbiamo adsorbito siero anti-Arborea (Titolo l : 20.000) con il ceppo '' LT 51 ». Dopo l 'adsorbimento tale siero è stato saggiato, con esito negativo, con ll cepp i del subserotipo arborea.e (Ti­tolo < l : 5).

Al subserotipo ballmn ballum appartiene, oltre al ceppo di referenza << Mus 127 », soltanto quello << R at a 112 11 (Portogallo) .

13 maggio 1964.

BIBLIOGRAFI A

BABUDIE RI, B. , 1955. Rencl. ! st. Super. Sanità, 18, 57-64. B ADUDIE RI, B. & C. MoscoviCI, 1955. R end. ! st. S uper. Sanitcì , 18, 70-81. BoRG PETERSE N, C. , 1944. Acta Pathol. M icrobiol. Scat•d .. 21, 591k W HO/ FAO, 1959. ]oint W HOfFAO E xpert Ccmmittee on Zoonoses, econd R eport, Jf"H O Techn .

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Serol. 15, 1-13.

..olnn. I st. Supet . ::;o11 ilà (19G.; ) 1. 10 7· 41 1.

L'impiego dell'elaboratore elettronico nell'analisi statistica di dati relativi ad esperienze di psicofarmacologia

PAOLO LANCIANI (*) e GIORGIO BIGNAMI

Laboratori di Fisica e Laboratori di Chimica terapeutica

R iassunto. - Si descrive un programma generale per il trattamento statistico dei dati ottenuti in esperienze sull'acquisizione di un comporti'­m ento condizionato di evitamento n el ratto.

Questo programma calcola alcuni parametri statistici abituali (devianza, varianza, ecc.). Dopo, esso esegue il test di omogen eità di varian za di Bartlett e l'analisi di varianza che si adatta all'esperien za considerata (finora otto casi possibili). Questa elaborazione vien e fatta sui dati delle singole prove e sui dati di gruppi di prove . Inoltre essa può essere ripetuta dopo l 'appli­cazione di alcune t rasformazioni u suali ai dati.

Si riportano i risultati ottenuti con questo programma in un'esperienza di psicofarmacologia.

Summary.- A series of automatic programming and r ecording appa­ratuses for the study of escape-avoidance conditioning of the rat in a shuttle-box has p ermitted, during the last few years, the carrying out of pharmacologic, physiologic and gen etic experiments on a large number of subjects. A generai programme for the statistica! analysis of the data b y means of an IBM 7040 computer is described in the present paper. This programme p ermits:

l) The calculation of various usual statistica! measures (sums of squares, st an dard deviations, standard deviations of the mean, ... ) ;

2) The application of t he Bartlett test for homogeneity of variance ;

3) The use of severa! possible types of analysis of variance. At the present rime eight t ypes bave been included in the programme (randomized groups design , randomized blocks design with or without r eplications, two-factor experiments with any number of levels for each factor, with or without randomized blocks, 2 X 2 X 2 factorial experiment with or wi­thout randomized blocks, and 2 X 2 fac torial experiment using a model for disproportionate sub-class numbers). More complex cases can b e added at any time wit hout any modification of the already existing programme.

(*) Borsista dei Laboratori di F isica.

.A.nn. 1st. Super. Sanità (1965 ) 1, 41 2 ·423 .

The randomi is frequently conditioning portionate SI

on the effect data whene' conditions.

4) Ali be r epeat ed . of sessions.

5) All repeated aft• ficant hetero ral widely u

gramme ( ( Other transf•

Parts 4

in reducing t An exru

present papt riment on t conditioning

Un'app; sul condizi01 tivi risultati serie di ap attualmente mento cond sia per esp e. regolari per F RANK, Bov

In altra strazione di GHER, 1961) BovET et al. RoBUSTELLI 1965; BoVE A MORICO, 1ç

isi statistica acologia

a

il trattam ento -un comporta-

uali (devianza, nza di Bartlett ta (finora otto : singole prove a dopo l'appli-

un'esperienza

~cording appa-t he rat in a

arrying out of large number

s of the data tt paper. This

u es (sums of tl, •• • ) ;

f of variance ;

riance. At the e {randomized

replications, tctor, with or

with or wi­>ing a model can be added g programme.

1965) 1, 412-423 .

LANCIANI E BIGNAMI 413

The randomized blocks design - even in complex factorial experiments -is frequently used in studies on the rate of acquisition of escape-avoi.dance conditioning performed with the split-litter t echnique. Models for dispro­portionate sub-class numbers in factorial experiments are useful in studies on the effects of organismic factors (strain, sex, age, ... ) to avoid discarding data whenever unequal n 's are imposed b y the particular experimental conditions.

4) Ali the calculations indicat ed in paragraphs l) through 3) can be repeated after re-arrangement of the scores into blocks of trials or blocks of sessions.

5) Ali the calculations indicated in paragraphs l) through 4) can be repeated after transformation of the raw data, in case a statistically signi­ficant h et erogeneity of variance is demonstrated by the Bartlett test. Seve­ral widely used transformations have been already included in the pro-

gramme ( V x + 0,5; V x + Y x + l ; log (x + l ); l fx; Arcsin (x/100)). Other transformations can be added without changing the programme.

Parts 4 and 5 of the programme were particularly timc-saving and helpful in reducing the number of cases in which non-parametric tests had to be used.

An example of the application of this programme is also given in the present paper . For this purpose a detailed re-analysis of data from an expe­riment on the effects of Benactyzine on acquisition of escape-avoidance conditioning (BIGNAMI, 1964 b) is also presented.

l. I, TRODUZlO E

Un 'apparecchiatura p er la programmazione automatica di esperienze sul condizionamento di evitamento n el ratto e per la registrazione dei rela­tivi risultati è stata recent emente messa a punto in quest ? Istituto. Una serie di apparecchi identici (gabbie tipo Warner, shuttle-boxes) viene attualmente adoperata sia per esperimenti sull'acquisizione del comporta­mento condizionato da parte di animali privi di esperienza antecedente, sia p er esperimenti ch e richiedono una ripetizione delle prove ad interYalli regolari per un periodo di t empo assai lungo (BoVET, GATTI & FRANK, 1961; FRANK, BovET & GATTI, 1961).

In altra sede si è già riferito sui risultati ottenuti m ediante la sommini­strazione di sostanze dotate di azione antimonoamminoossidasica (ORSIN· GHER, 1961), di ormoni tiroidei e di sostanze antitiroidee {BIGNAMI, 1962 ; BovET et al., 1962 ; BovET & GATTI, 1965), di nicotina (BovET, BIGNAMI & RoBUSTELLI, 1963; BovET, 1965; BovET & GATTI, 1965 ; BIGNAMI et al., 1965; BovET, RoBUSTELLI & BIGNAMI, 1965), di amfetamina (BovET & AMORico, 1963; BIGNAMI et al. , 1965; BovET & GATTI, 1965; BovET, RoBu-

. !nn. ! st . Su7Jer. Sanità (1965) 1, 412-423.

414 ESPE RIENZE E RICERCHE

STELLI & BIGNAMI, 1965), di b enacti7:ina (BIGNAMI, 1964 b; BIGNAMI et al., 1965; BovET, RoBUSTELLI & BIGNAMI, 1965). e di cloropromazina (BovET

& GATTI, 1965 ; }ANKU, 1964). In tutte le prove condotte con le appat·ecchiature di cui sopra una massa

notevole di dati sull'attività incondizionata e condizionata e sulle rispost e addizionali (non-motivate) deve esser e trascritta dai grafici ed analizzata secondo i sist emi tradizionali . Inoltre, n el corso di esperienze di acquisizione del condizionamento, la variabilità individuale elevata, sia pure in parte compensata per mezzo della randomizzazione n ei gruppi sp erimentali a par­tire da covate di ratti allevate p er tale scopo, richiede l'utilizzazione di un numero considerevol e di soggetti. P er l ' analisi statistica dei risultati v iene generalmente usato lo schema più adatto di analisi di variamr.a ed uno dei t est s p er i confronti multipli fra più di due m edie.

Tali analisi, di p er sè abbastanza semplice, può richieder e m olto tempo p er il fatto che ogni esperienza è generalmente costituita da 5 o 6 sedute quot idiane successive di condizionamento, e che vari trattamenti possono a gire in diverse fasi dell ' acquisizione del comportamento condizionato. P er­tanto l ' analisi prescelta deve essere gen eralmente ripetuta più volte, sia p er le singole sedute di condizionamento, sia per gruppi di due o più sedute. Inoltre, qualora si verifichino casi di et erogeneità di varianza, le analisi di maggiore interesse vanno ripetute dopo ch e siano state applicate ai da ti diverse trasformazioni.

L'acquisto di un grande elaboratore elettronico (IBM 7040) da p arte del nostro I stituto h a p ermesso di preparare per tale analisi s tatistica un pro­gramma che prevede l 'esecuzione del t est di omogen eità di varianza (secondo Bartlett) e dell'analisi di varianza che volta per v olta si adatta all' esp e­rienza presa in considerazione (con una o più categorie d i fattori ; con o sen za blocchi randomizzati ; et c.).

Tali calcoli vengono ripetuti più volte sui dati di ciascuna seduta di condizionamento, c sui dati di gruppi di sedute v ariamente combinati fra

loro (l + 2 ; l + 2 + 3 ; . .. ; l + 2 +··· + 6; 4 + 5 + 6) . Inoltre tutte quest e analisi possono venire ripetute dopo l'applica zione di alcune appro­priate trasformazioni.

2. IMPOSTAZIONE STATISTICA DEL PROGRAMMA

P er ciascuna analisi di v arianza eseguita il calcolatore em ette una ta­b ella secondo uno sch ema scelto in base alle n ecessità sperimentali, conte­nente le varie somme di quadrati (devianze), il numero dei gr adi di libertà, i quadrati m edi (varianze) ed i vari valori di F (rapporti fra varianze). Gli schemi di analisi di varianza sinora previsti sono fra quelli più comune­m ente usati in biologia . Salvo il caso di cui al punto 2 . 5 essi sono st a ti

A n n . l st. Super. Sanità (1 905) 1, 412·423 .

programmati discusso l'appl

2 . l - A nali

Ciascun g1 non necessaria

eseguito sulla di F, corrisp on e varianza r eE

2 . 2 - A nali

a) Senza fornisce un ~o,

com e n el caso Ovviam ente si In casi particc un numero l im

formul e appro valori di F , l'1 ai blocchi (ge1

h) Con rt

più soggetti a< v alore di F , c< dat o il numer v iene ancora < dei gruppi sp piccoli sottog· tali esperienz<

2. 3 - Espe1

a) S empli d elle varianze m ero dei livell scuno d ei due

h) Con bi n el caso 2 . 3a p er i blocchi .

2. 4- E spe1 (2 x

a) Sempll degli 8 sottog1 tori ed uno p•

BIGNAMI et al., mazina (BovET

•pra una massa e sulle risposte

ed analizzata di acquisizione pure in parte mentali a par­zzazione di un r isultati viene tza ed uno dei

e molto t empo 1 5 o 6 sedute menti possono lizionato. P er­L volte, sia per o più sedute.

t , le analisi di olicatc ai dati

040) da parte tistica un pro­anza (secondo latta all'espe­

' ; con o senza

ma seduta di combinati fra Inoltre tutte

alcune appro-

mette una ta­tentali, conte­ldi di libertà, varianze). Gli più comune-. si sono stati

l 965) 1, 412·423.

LANCIANI E BIGNAMI 415

programmati secondo le modalità proposte da EowARDS (1960) , che ne ha discusso l 'applicazione alla psicologia sperimentale.

2 . l - Analisi per esperienze a gruppi randomizzati.

Ciascun gruppo può essere costituito da un numero variabile di soggetti , non n ecessariamente identico da un gruppo all 'altro. Il t est di Bartlett v iene eseguito sulla base delle v arianze di tali gruppi. Viene dato un solo valore di F , corrispondente al r apporto fra varianza attribuita ai diversi trattamenti e varianza residua .

2 . 2 - Analisi p er esperienze a blocchi randomizzati.

a) Senza replicazioni. - Ciascun blocco (in genere una covata di ratti) fornisce un soggetto ad ognuno dei gruppi sp~rimentali . Il t est di Bartlett, com e nel caso 2 . l , viene eseguito sulla base delle v arianze di tali gruppi. Ovviamente si richiede che il numero dei soggetti sia lo stesso in tutti i gruppi. In casi particolari, prima di fornire i d ati al calcolatore, è possibile eseguire un numero limitato di interpolazioni di eventuali punteggi mancanti secondo formul e appropriate (BuRN, FINNEY & GooowiN, 1952) . Vengono dati 2 valori di F, l 'uno corrispondente ai trattamenti (gruppi sperimentali) l'altro ai blocchi (generalmente covate).

b) Con replicazioni. - In questo caso ciascun blocco fornisce due o più soggetti ad ogui gruppo sperimentale. Ciò permette di calcolar e un terzo valore di F , corrispondente all 'interazione cctrattamenti x blocchi>>. Tuttavia, dato il numero generalmente limitato d elle r eplicazioni, il t est di Bartlett v iene ancora eseguito, com e nei casi 2 . l e 2 . 2a), sulla base delle varianze dei gruppi sperimentali. Vengono cioè ignorate le varianze dei numerosi piccoli sottogruppi che potrebbero t eoricamente essere costituiti qualora tali esperienze venissero trattate alla stregua degli esperimenti fattoriali.

2 . 3 - Esperimenti fattoriali con due fattori.

a) Semplice. - Il t est di Bartlett viene questa volta eseguito sulla b ase delle varianze di tutti i sottogruppi, il cui numero è pari al prodotto del nu­mero dei livelli dei due fattori . Vengono calcolati tre valori di F , uno per cia­scuno dei due fattori ed uno per l 'interazione.

b) Con blocchi randomizzati. - Il t est di Bartlett viene eseguito come n el caso 2 . 3a). Oltre ai tre valori di F già indicati compare un qua1·to valore per i blocchi.

2 . 4 - Esperimenti fattoriali con tre fattori e due livelli per ciascun fattore (2 x 2 x 2).

a) Semplice. - Il t est di Bartlett viene es<"guito sulla base delle varianze degli 8 sottogruppi. ~Vengono dati 7 valori di F , uno per ciascuno dei tre fat­tori ed uno per ciascuna delle quattro possibili interazioni .

Ann. 1st. Super. Sanitd (1965) 1, 412 ·423.

416 ESPERIE . ZE E RICER CH E

h) Con blocchi randomizzati. - Compare un ottavo valore di F per i blocchi.

2 . 5 - Esperimento fattoriale 2 x 2 con numero disuguale di soggetti nei sot­togruppi, secondo SNEDECOR {1956).

L'uso di questo schem a si è reso n ecessario p er l'analisi dei dati raccolti nel corso di una esperienza di psicogenetica (BIGNAMI, 1964; 1965; BIGNAMI & BovET, 1965). In tale esperienza si è ottenuta per selezione la separazione di due ceppi di ratti caratterizzati da una maggiore o minore rapidità di acquisizione del comportamento condizionato di evitamento. Considerando che i due fattori principali sono il ceppo ed il sesso degli animali, l 'utilizza­zione di tutte le osservazioni disponibili conduce necessariamente alla costi­tuzione di sottogruppi di consistenza numerica disuguale. Si r endono per­tanto necessarie delle correzioni sia per il calcolo delle due F dei due effetti principali, sia per il calcolo delle F dell'interazione. Tale programma potrà essere eventualmente modificato qualora si abbiano più di due livelli per uno dei fattori.

Dall'esempio più sopra riportato appar e tutta l 'importanza di tali schemi adattabili ad esperienze fattoriali con sottogruppi che presentano un numero disuguale di soggetti. Frequentemente, qualora uno od ambedue i fattori siano di carattere organismico (sesso, età, ceppo, et c.), lo sperimentatore non può prevedere se non approssimativamente il numero d ei soggetti nei vari gruppi sperimentali. Egli si trova allora davanti all'alternativa o di ricorrere ;'tecniche statistiche meno sensibili , o di sacrificare a caso una parte delle ~rvazioni per raggiungere la parità numerica n ei sottogruppi.

3. DESCRIZIONE DEL PROGRAMMA

D programma, scritto per l 'elaboratore elettronico 1BM 7040 in linguaggio simbolico Fortran IV, accetta i dati relativi a un numero illimitato di gruppi che possono essere formati, a seconda dei casi, da un numero di soggetti fisso o variabile da gruppo a gruppo e per degli esperimenti di durata variabile.

I dati possono essere raccolti automaticamente da una perforatrice IBM 26, e in questo caso l'elaboratore li trasforma direttamente n ella forma utile per i calcoli, oppure possono esser e forniti già su schede perforate da operatrici.

Un diagramma a blocchi molto generale di questo programma è mostrato nella Fig. l.

Esso permette attualmente di ottenere :

a) P er ciascun gruppo e per ciascun giorno : somma dei dati; m edia d ei dati; devianza (somma dei quadrati) ; varianza (quadrato medio); d evia­zione standard ; errore standard.

Ann. 1st. Super. Sanità (1965) l , 412·423.

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(1 965) 1, 412·423.

LANCIANI E BIGJ\"AM f 417

Fig. l. - Diagramma a blocchi del programma, indicante la successione logica delle opera­zioni. In alto a sinistra: ingresso dei dati, calcolo delle medie e delle misure di variabilità, test di Bartlett per l'omogeneità di varianza. Al centro a slll.l­stra : vari tipi di analisi di varianza (convenzionalmente indicati con i simboli da J = l a J = J o) fra cui occorre scegliere caso per caso. In basso (a sinistra e a destra): varie situazioni in cui l'analisi complet a può essere sistematicamente ripetuta dopo lettura dei dati registrati su pista magnetica (dati grezzi da gruppi di sedute; dati da singole sedute e da gruppi di sedute, previa applicazione di una serie di trasformazioni}.

.dnn. Ist. Super. Sanità (1965) 1, U2·423

418 ESPERI EI'I"ZE E RICER CHE

b) P er ciascun giorno:

l - Il test di omogeneità di Bartlett calcolato nel caso più gen erale di gruppi composti di numeri diversi di soggetti .

2 - I fattori di signifìcatività F ch e, come più sopra indicato, possono esser calcolati in modi diversi a seconda delle caratteristiche del­l'esperimento.

Oltre agli schemi di analisi già descritti, potranno essere considerati altri schemi di analisi di varianza in numero illimitato, qualora le necessità sperimentali lo richiedano.

c) Se lo si desidera si possono richiedere i risultati dei punti a) e b) ripetuti sulle medie dei dati di più giorni (l + 2, l + 2 + 3, ... , 4 + 5, ... ).

d) N el caso o ve ciò sia necessario, si possono richiedere tutti i risul­tati dei punti a), b), c) dopo la trasformazione dei dati iniziali, in modo da diminuirne la et erogeneità di varianza.

Le trasformazioni sinora adottate sono le più corr enti (EDWARDS, 1960) :

l ) v x + 0,5 ;

2) v-;; +v x + l ;

3) log (x ' T l) ;

4) l /x ;

5) Ar csin (x/100).

È sempre possibile aggiunger e qualsiasi trasformazione che possa risul­tare utile; d'altra parte è possibile eliminare una o più di quelle contenute nel programma se questo è desiderato .

4. ESEMPIO DI APPLICAZIONE DEL PROGRAMMA

Come esempio di applicazione del programma p er l 'analisi statistica saranno qui riesaminati i dati ottenuti nel corso di una esperienza di psico­farmacologia i cui risultati sono stati recentemente pubblicati (BIGNAMI, 1964 a). In tale esperienza del tipo 2 . 2a) erano stati costituiti 7 gruppi spe­rimentali di 12 ratti ciascuno a partire da 12 covate di 7 ratti ognuna. Un gruppo era servito come gruppo di controllo, mentre gli animali degli altri gruppi avevano ricevuto per via sottocutanea rispettivamente 0,5 ; 1,0 ; 2,0 ; 5,0 ; 10,0 e 20,0 mg/kg di una sostanza ad azione anticolinergica, la benactizina, prima di ciascuna delle 6 sedute quotidiane di condizionamento.

Ann. I st. Supr.r. San'ità (1965) 1, 412-~23.

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l (1965) l , 412·423.

LA:-ICIANI E BIGNAMI 419

Nei gruppi di animali trattati si era potuto mettere in evidenza un livello di prestazioni più elevato che nel gruppo di controllo, particolarmente n el corso delle sedute 3, 4 e 5. Per varie serie di dati tuttavja era stata riscon­trata una eterogeneità di varianza altamente significativa per cui si era in parte fatto ricorso a dei tests statistici non pa.rametrici.

I principali risultati dell'analisi ripetuta dal calcolatore sono riportati nelle Tabelle l e 2, che indicano i valori di chi quadro (x2) p er il test di Bart­lett ed i valori di F p er l 'effetto dei trattamenti e dei blocchi con il rispettivo grado di signifìcatività statistica.

La ripetizione dei calcoli sui dati trasformati ha permesso di eliminare tutte le limitazioni precedentemente incontrate. Infatt i il t est di Bartlett, ripetuto dopo l'applicazione della trasformazione Arcsin (x/ 100) solo in tre casi ha dato un valore di x2 corrispondente ad una probabilità compresa fra il 5 e l'l %· Ora molti Autori ammettono che i t ests di signifìcatività dell'a~alisi di varianza possano esser e applicati purchè il grado di signifìca­tività dell'eterogeneità di varianza non vada oltre l ' l %· Ciò può essere accettato a maggior ragione nel nostro caso, in quanto tutti i gruppi speri­mentali contengono un numero uguale di soggetti, ciò che accresce la cosid­detta (( robustezza » del t est.

È anche interessante notare che, nel caso particolare della presente espe­rienza, il numero dei casi di significativa eterogeneità di varianza tende piuttosto ad aumentare qualora si applichino le trasformazioni generalmente

più usate ( y' x + 0,5; Yx + jl x + l ; log (x + l) ; 1/x).

l risultati di circa 20 esperienze sinora analizzate hanno confermato l'utilità di ripetere sistematicamente i calcoli dopo l'applicazione delle varie trasformazioni. Accade spesso infatti che, p er la natura stessa delle medie e delle varianze (medie basse nelle prime sedute, sp esso elevat e o addirittura vicine al massimo t eoricamente possibile nelle sedute ulteriori, con riduzione delle varianze), l'eventuale et erogen eità di varianza ceda, a seconda dei casi, a trasformazioni diverse.

Nelle prime sedute si rivelano generalmente utili le trasformazioni di

u so più comune ( v x + 0,5; v-;-+ jl x + l ; log (x + l)), nelle ultime sedute invece tali trasformazioni t endono addirittura ad accentuare l'ete­rogeneità di varianza m entre risulta utile la trasformazione Arcsin (x/ 100) .

5. CONSIDERAZIONI CO CLUSIVE

Il programma di calcolo esposto sinor a rappresenta solo una parte delle possibilità offerte dall'elaboratore elettronico ai fini dell 'analisi di d ati otte­nuti nel corso di esperienze di p sicologia animale e di psicofarmacologia. La tecnica adottata per la registrazione automatica delle varie risposte dell'a-

2 Ann . 1st. Su11er. Sanitcì 11965) 1, 412·423.

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422 ESPERIENZE E RICERCHE

nimale permetterà di completare successivamente il programma secondo le necessità della sperimentazione. Ad esempio sarà considerata la possibilità di eseguire sist ematicamente delle analisi di andamento sia entro le singole sedute di condizionamento, sia tra sedute successive. In seguito potrà essere intrapreso lo studio dal punto di vista matematico delle curve di acquisi­zione del comportamento condizionato, e della loro modificazione in varie condizioni sperimentali.

Infine il calcolatore potrà permettere delle analisi fattoriali e delle ana­lisi di funzione discriminante, che t engano conto delle correlazioni fra i vari parametri simultaneamente r egistrati n el corso delle prove di condiziona­mento, e ne descrivano le modifìcazioni prodotte sia da fattori organismici (ceppo, sesso, età , ... ) sia da fattori imposti dallo sperimentatore (come ad esempio i trattamenti farmacologici) .

4 giugno 1964

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.A nn. I st. Super. Sanità (1966) 1, 412-423.

Esperimenti sul fenomeno della « suppressiveness » in mutanti citoplasmatici « petit » di Saccharomyces cerevisiae

CARM.ELA DE PALMA (*) e GIORGIO MORPURGO

Centro Internazionale di Chimica 1\ficrobiologica

Riassunto. - Il fenomeno della « suppressiveness )) è stato studiato n ei seguenti incroci : petit diploide X grande aploide ; grande diploide X

p etit aploide. Solo nel primo tipo di incrocio si è trovata « suppressiveness »

e cioè gli zigoti hanno prodotto cellule figlie petit e grandi, oltre ad un t erzo tipo di cellule ereditariamente instabile p er la deficienza respiratoria. Le cause della « suppressiveness )) sono discusse alla luce di questi risultati .

Summary. - The phenomenon of « suppressiveness » has been studied in r eciproca! crosses haploid petit X diploid big and haploid big X diploid p etit, in the yeast Saccharomy ces cerevisiae. The possible effect of ploidy of the conjugants on the incidence of « suppressiveness )) has b een investigated. Petit mutants were obtained b y treatment with acrifiavine ; diploids homo­zygous for mating type and nutritional markers were obtained b y somatic segregation from a prototrophic heterozygous diploid and crosses were studied, by selecting triploid zygotes as prototrophs on minimal m edium. In any case respiratory potentiality of the colonies has been t ested by their ability to grow on alcohol as sole carbon source.

The following results have been obtained : l) << Suppressiveness )) occurred only in crosses haploid big X diploid

petit. 2) When « suppressiveness » occurs it is possible to isolate a type of

hereditarity unstable colony which continuosly segr egates petit cells. The signifìcance of the data is discussed .

EPHRUSSI, MA:RGE RIE -HOTTINGUER & RoMAN (1955) hanno dimostrato che l'incrocio di ceppi mutanti respirat ori « petit n di origine citoplasmatica per ceppi « grandi n respiratoriamente normali non dava il 100 % di colonie

(*) Borsista del Centro Internazionale di Chimica Microbiologica.

Ann. Ist. Super. S anità. (196~) t , 424-4.30 .

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'· ani là (1965) 1, 424·430.

DE PALJIIA E i\10 RPU RGO 425

normali come atteso e come era stato precedentemente affermato, ma che una percentuale variabile fra O ed il 99 % degli zigoti dava origine a co­lonie petit. Il rapporto colonie petitfcolonie normali è det erminato unicamente dal particolare ceppo petit usato. Questo fenomeno è stato chiamato c< sup­pressiveness >> e r icerche successive (SHERMAN & EPHRUSSI, 1962) hanno di­mostrato ch e è dato solamente da petit citoplasmatich e, le p etit nucleari producendo constantemente nell' incrocio il fenotipo normale.

Il determinismo del fenomeno della suppressiveness non è stato chiarito ; se infatti si ammette che la mutazione petit si è originata per la scomparsa di una particella citoplasmatica autoriproducibile non è chiaro come questo fatto possa impedire alle particelle che lo zigot e riceve n ell'incrocio della colonia grande di riprodursi. Si è quindi fatta l ' ipotesi (EPHRUSSI, MARGERIE­HoTTINGUER & ROMAN, 1955) che nel ceppo mutante possa esist ere una se­conda particella forse derivata per mutazione della particella normale e competitiva con questa.

La presente ricerca prende in esame il carattere suppressiveness in incroci petit aploide X diploide grande, ed il suo reciproco petit diploide X grande aploide, per vedere se la ploidia del ceppo grande ha influenza sulla frequenza della suppressiveness.

MATERIALI E METODI

Ceppi. Tutti gli esperimenti sono stati condotti sui seguenti ceppi di Saccharomyces cerevisiae, o su ceppi petit da questi derivati per tratta ­mento con acriflavina.

Aploidi : 10187 a arg.-1 ur-1 ; FF-53 a thr-4.

Diploidi : DMR 7 ~ me~ ; a met

DMR 10 ~ arg ~ a arg met

Questi due ceppi sono derivati per segregazione somatica dal diploide

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Terreni di cultura. Sono stati usati un t erreno completo C già preceden­temente descritto (SERMONTI, 1957) ed il t erreno MM di Czapek Dox ; a questo ultimo terreno è stato costantemente aggiunta asparagina nella con­centrazione 0,1 % c 2 ml/ 1 di terreno di una soluzione di vitamine della se­guente composizione : lO mg di nicotinammide, r mg di acido p-ammino-ben­zoico, 5 mg di piridossina H Cl, 0,025 mg di biotina, 20 mg di pantotenato di Ca, 40 mg di inositolo, 5 mg di aneurina, l mg di acido folico , lO ml di H20.

Trattamento con acrijlavina. Le colonie p etit sono st at e ottenute in­cubando i ceppi in esame in t erreno MM per 48 h con acri.flavina 5 X I0- 50/ 0

A.nn. 1st. Super. Sanità (1965) 1, 424·4:!0.

426 ESPERIENZE E RICERCHE

(p/v). P er evitare di prendere colonie appartenenti allo stesso clone ogni colonia è stata prelevata da un diverso trattamento.

Esame delle capacità respiratorie. Le colonie sono state classificate come petit se erano incapaci di crescere su terreno MM o C supplementato con alcool nella concentrazione di l % vJv . Su tali terreni il mutante respiratorio è totalmente incapace di dare crescita mentre il ceppo grande può crescere. La tecnica del trifeniltetrazolio (OcuR, ST. JonN & NAGAI, 1957) non è stata impiegata perchè con i ceppi usati non dava risultati attendibili.

Tecnica degli incroci. Gli incroci sono stati compiuti semplicemente seminando il miscuglio di cellule di sesso opposto su terreno MM + glucosio, in numero tale che le colonie prototrofe derivanti dall'incrocio venissero ben separate. L e colonie venivano successivamente con una ansa trasportate su mezzo MM + glucosio e MM + alcool per l 'esame delle loro capacità respiratorie.

RISULTATI

Suppressiveness nell'incrocio grande aploide X petit diploide. Il ceppo gran­de 10187 aploide arg ur è stato incrociato con 6 ceppi petit ottenuti per muta­zione indipendente per mezzo di trattamento con acriflavina dal diploide DMR IO arg met. 50 colonie prototrofe da ciascun incrocio sono state trasfe-1·ite su MM + glucosio ed MM + alcool per determinare la frequenza di colonie petit e quindi il grado di suppressiveness del genitore. I dati sono nella Tabella l. Sul terreno con alcool alcuni degli strisci non hanno dato una crescita omogenea ma con notevole ritardo sono nate solamente delle colonie isolate. Questo fatto ha portato a pensare che dagli zigoti, oltre che colonie grandi e petit si potessero originare anche colonie o miste o ereditariamente instabili, e che quest'ultime su alcool dessero luogo a crescita di colonie isolate anzichè come patina. Per provare questa ipotesi, cellule che prove­nivano da strisci capaci di crescere su alcool, sia come patina che come co­lonie isolate, sono state prelevate dalla replica su MM + glucosio e seminate nuovamente su MM + glucosio ; la popolazione di colonie che ne è derivata è stata nuovamente esaminata per le capacità respiratorie. Gli strisci inca­paci di crescere su alcool non sono stati esaminati perchè evidentemente composti di un solo tipo di cellule petit.

Sono stati così esaminati 42 strisci di cui 12 crescevano su alcool a colonie separate (I tipo) e 30 con patina omogenea (II tipo). Tutte e 12 le semine da colonie del tipo I hanno dato tre tipi di colonie e cioè grandi, petit, e co­lonie a margine frastagliato ; 28 colonie su 30 del tipo II hanno invece dato soltanto colonie grandi (la presenza di meno del l O % di colonie petit non è stato considerato come prova che la colonia fosse mista). In seguito a questi

Ann. ! st. Super. Sanità (1965) t, 424·430.

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DE PALMA E ~IORPt;RGO 427

risultati tutte le colonie a crescita di tipo I sono state cla sificate come mist e, mentre tutte le altre sono s tate classificate come omogenee. Questo criterio di classificazione produce tuttavia un certo errore con una sicura sot tostima delle colonie mist e.

Esame della instabilità genetica. La presen za di colonie a mar gine fra ­stagliato è normalmente indice di una frequenza d i mut azione grande ~ petit fortemente aumentata . Quattro colonie « frast agliate '' derivate dai piastramenti precedenti di cellule da strisci di tipo I son o state nuovamente seminate e le colonie classificat e come grandi, p etit e « frastagliate '' · Questa operazione è stata ripetuta per tre volte sempre scegliendo nella nuova gene­razione le colonie di tipo « frastagliato », ottenendo sempre identici risultati e cioè la produzione di tre tipi di colonie, fatto che dimostra che nell' incrocio si è formato un tipo ereditariamente instabile per le capacità r espiratorie. I dati sono esposti nella Tabella 2.

Suppressiveness in incroci petit aploide x grande diploide. Il diploide DMR 7 è st ato incrociato con lO ceppi petit ottenuti per mutazione indipen­dente per trattamento con acriflavina n el ceppo 10187. 50 colonie nate da ciascun incrocio sono state esaminate con modalità identiche a quelle del caso precedente.

Nei dieci incroci non è stata trovata suppressiveness; i dati sono esposti n ella Tabella l. Dagli incroci DMR 7 X 10194 e DMR 7 X 10193 sono state prelevat e 14 colonie, da cui sono state seminate le cellule su mezzo C p er vedere una eventuale instabilità genetica. Tut t e e 14 le colonie sono risultate grandi e stabili.

DISCUSSIO E

Gli esperimenti che abbiamo riferito hanno messo in evidenza i seguenti punti: l) la frequenza di suppressiveness con i ceppi da noi usati (ceppi di origine differente da quelli di Ephrussi e Roman) è scarsa o nulla in incroci del tipo petit aploide X grande diploide ; 2) suppressiveness è presente soltanto negli incroci p etit diploide x grande diploide, ed oltre a cellule grandi e cellule petit si producono anche costantemente cellule ereditaria­mente inst abili per la deficien za r espiratoria.

In base a questi dati si può pensare che nei nostri ceppi la suppres­siveness si origini per un alterato rapporto fra la ploidia ed il numero delle particelle citoplasmatiche.

Se si ammette che normalmente la moltiplicazione delle particelle cito­plasmatich e sia sincronizzata con la moltiplicazione cellulare, si deve pensare che un diploide, derivando dalla fusione di due cellule aploidi, contenga un numero di partice1le doppio di quest 'ultime. Nell' incrocio fra un diploide

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430 ESPERIENZE E RICERCHE

petit ed un aploide grande lo zigote avrà quindi un terzo delle particelle che dovrebbe normalmente possedere. Alla successiva moltiplicazione dello zigote una ineguale divisione delle particelle fra le nuove gemme porterà alla produzione di cellule p etit, di cellule normali e di cellule che hanno con­servato la situazione iniziale e cioè ereditariamente instabili, come in effetti si troYa.

Questa spiegazione è tuttavia probabilmente valida solo con i ceppi che abbiamo usato, ceppi cioè che presentano suppressiveness solo nel caso particolare dell'incrocio petit diploide X grande aploide. ]Acon (comunica­zione personale) non ha trovato alcuna differenza in incroci a diversa ploidia, utilizzando ceppi di diversa origine con frequenza di suppressiveness molto più alta.

Questo lavoro è stato eseguito con il contributo finanziario del CNR. Gli autori desiderano anche ringraziare il Sig. G. Conti p er l'abile assistenza t ecnica.

22 giugno 1964.

BIBLIOGRAFIA

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