CONTROLLO EPIGENETICO

La perdita della membrana nucleare, da parte dello spermatozoo, determina la liberazione del

corredo genetico nell’oocita (le membrane nucleari della cellula uovo e spermatozoo sono atipiche,

perché non ancorate al citoscheletro). Il nuovo genoma mantiene le informazioni sia materne che

paterne.

La blastocisti (2°-3° giorno) è una formazione cava con all’interno cellule in attiva proliferazione; le

cellule dell’amnios (che circondano le cellule pluripotenti che daranno origine ai tre foglietti)

formeranno la placenta e hanno un elevato rate di mutazioni; ciò può causare diagnosi errata di

malattia cromosomica con l’analisi del cariotipo del liquido amniotico, poiché il programma

differenziativo dell’amnios e dell’embrione è differente. L’informazione genetica dello zigote è già

definitiva, cioè possiede tutte le informazioni che definiscono quello specifico individuo; ma al

contempo è presente un programma differenziativo (cascata lineare e progressiva di specializzazione

delle cellule in tessuti ed organi differenti; quindi l’embriogenesi è una cascata progressiva di

specializzazione delle cellule staminali). Lo sviluppo fetale dipende dal programma differenziativo.

La differenziazione origina dai tre foglietti (endoderma, ectoderma, mesoderma) e durante la

specializzazione si ha il mantenimento delle cellule non-committed (che sono precursori in grado di

riformare il tessuto) e delle cellule committed (cellule specifiche delle differenti linee tissutali). Fino

allo stadio di morula, le cellule sono tutte non-committed (ognuna può potenzialmente dare origine

a un individuo completo). Durante la differenziazione si assiste ad una restrizione del programma

differenziativo (vengono spenti i geni che porterebbero la cellula verso un altro committment).

Le cellule staminali si classificano (in maniera dinamica, non statica) in:

- totipotenti (non-committed, possono dare origine all’intero individuo)

- pluripotenti (danno origine a tutti i tipi cellulari di un tessuto)

- multi potenti (danno origine a tutte le cellule di una linea differenziativa di un tessuto)

- progenitrici (committed, cellule differenziate specifiche)

L’embriogenesi è anche una cascata progressiva di accensione e spegnimento di geni secondo un

piano prestabilito. Il programma differenziativo dipende dall’attivazione dei fattori di trascrizione,

che avviene in acuto, in cronico e in accumulo. Il processo di differenziazione è irreversibile: una

volta che la cellula diventa parzialmente committed, continuerà lo sviluppo e non potrà ritornare

staminale.

TIPOLOGIE DI DIVISIONE CELLULARE NELLE CELLULE STAMINALI

Interazione tra informazione genetica e programma epigenetico.

Il controllo dell’espressione genica si attua mediante le seguenti modificazioni epigenetiche:

Tra i fattori che regolano la cromatina troviamo i cromatine binding factors (trithorax, polycomb) che

legano la cromatina e partecipano alla sua modificazione.

Le cellule staminali sono le stesse nel corso della vita, ma vengono mutate a seconda dell’ambiente

in cui io vivo. Inoltre, negli anziani viene persa l’attività telomerasica (che è valida nelle cellule

tumorali e nelle staminali “giovani”).

Le modificazioni epigenetiche fanno rilassare o condensare la cromatina, rendendola più o meno

esprimibile; quindi le modificazioni epigenetiche sono:

- stabili, perché mantenute tra i cicli di replicazione

- modulabili, perché si attua il rimodellamento della cromatina

Il programma differenziativo porta al silenziamento genico (spengo le porzioni geniche che non

interessano a quella specifica linea differenziativa) tramite deacetilazione degli istoni e metilazione

del DNA. Il silenziamento genico è quindi in bilancio tra l’attività di vari enzimi:

DNMT (DNA methyl transferase),

HDAC (histone deacethylase),

HMT (histone methyl transferase),

NURF (nucleosomal remodelling factors).

Questi processi causano uno stato repressivo ereditabile sul

promotore o sulle sequenze codificanti di alcuni geni,

causando silenziamento genico. Il silenziamento serve allo

sviluppo e la differenziazione. Patologicamente, può essere

una delle cause dello sviluppo del cancro.

1) METILAZIONE DEL DNA

La metilazione del DNA causa il silenziamento genico.

Dnmt1 mantiene la metilazione del DNA nel tempo (serve quindi a mantenere il programma

epigenetico). Dnmt1 mantiene la metilazione utilizzando come stampo il filamento parentale di DNA

(metila il filamento figlio in base al filamento padre). Viene ereditato in toto.

Dnmt3a/b causano la nuova metilazione (de novo). Metilano il filamento di DNA senza utilizzare un

filamento stampo. Viene regolato da fattori trascrizionali.

Il DNA all’origine è demetilato. Dnmt3a/b metilano de novo solo quando è necessario il

silenziamento, quindi formano un doppio filamento metilato. Con la successiva divisione cellulare, il

filamento parentale rimane metilato, mentre quello di nuova sintesi non è metilato. Qui interviene

Dnmt1, che metila il filamento figlio utilizzando come stampo il filamento parentale (riportando così

il DNA dallo stato emimetilato allo stato totalmente metilato).

La metilazione del genoma avviene su due livelli:

- genome wide metilation (metilazione aspecifica di tutta la cromatina)

- isole CpG di metilazione (aree del genoma ipermetilate, ricche in CG, chiamate “CpG Island”)

I tumori hanno un basso livello di metilazione genome wide (metilazione aspecifica), invece hanno

una alta metilazione nelle CpG Island (metilazione specifica). Il tumore è ipermetilato (inibito) in

regioni specifiche che guidano il differenziamento; invece è ipometilato (non inibito) nelle regioni

che guidano la staminalità.

La metilazione comprende sia sequenze codificanti che sequenze non codificanti. Quindi la cellula

differenziata è ipermetilata, mentre la cellula staminale è ipometilata. Inoltre il grado di metilazione

influisce sulla cinetica di trascrizione; la metilazione del solo promotore non è sufficiente a bloccare

totalmente la trascrizione, poichè occorre anche la metilazione di CpG Island a monte.

Lo spegnimento genico può avvenire tramite: metilazione del promotore (CpG Island, agisce in cis) o

metilazione di una regione enhancer (lontana dal promotore, agisce in trans).

PATTERN DI METILAZIONE DEL DNA

2) CODICE ISTONICO

Gli istoni, le proteine che compongono

il nucleosoma, hanno due domini

funzionali:

- dominio che lega il DNA, permet-

tendone il compattamento

- dominio che lega gli altri istoni,

permettendo la formazione del nucleo-

soma. Questa regione responsabile del

compattamento è a livello delle code, e

quindi agendo su di esse (acetilazione,

metilazione, fosforilazion) causo una

variazione di conformazione che per-

mette di compattare o aprire il nucleo-

soma, modificando l’espressione geni-

ca di quel tratto.

Il nucleosoma è quindi formato da otto

istoni (2 x H2A, 2 x H2B, 2 x H3, 2 x H4),

e a cause delle modifiche sulla coda

può assumere una conformazione più compatta (DNA non attaccabile dai fattori di trascrizione) o

più rilassata (DNA attaccabile dai fattori di trascrizione).

Gli aminoacidi terminali degli istoni, soprattutto quelli localizzati nella coda aminica, sono soggetti a

varie modifiche post-traduzionali (tra cui metilazione, acetilazione, fosforilazione, ubiquitinazione,

sumorilazione, citrullinazione e ADP-ribosilazione).

Il controllo epigenetico viene ereditato, e permette l’espressione solo dei geni necessari in quel

luogo e in quel momento (il controllo epigenetico determina le differenziazioni tissutali, tramite la

regolazione sui fattori di trascrizione). Ad esempio, le Dnmt per la metilazione richiedono altre

proteine che mantengano o alterino il controllo epigenetico.

Meccanismo molecolare per il rilassamento della cromatina (metilation switch).

Silenziamento genico tramite metilazione del DNA e modificazioni istoniche.

3) ORGANIZZAZIONE DEI NUCLEOSOMI E CROMATINA

4) TELOMERI

I telomeri sono sistemi di protezione, specie-specifici. Una cellula differenziata perde la sua attività

telomerasica, mentre una cellula staminale conserva attività telomerasica.

I tumori si comportano in parte come cellule staminali, perché proliferano, e in parte come cellule

differenziate, perché la proliferazione è specifica per una linea differenziativa, comportandosi come

dei neo-organi. L’attività telomerasica varia durante la vita.

5) MICRO RNA

Meccanismi di espressione di miRNA intronici ed esonici.

Attività dei miRNA.

I miRNA sono modulatori epigenetici: regolano funzioni complesse ed hanno molti target.

Generalmente hanno un effetto inibitorio in trans (degradazione dell’mRNA o inibizione della sintesi

proteina), che si manifesta fenotipicamente come l’inibizione di una funzione (gene suppressors) o

l’attivazione di una funzione (gene activators) (per inibizione di un inibitore).

I miRNA sono importanti anche nella cancerogenesi (la loro attività può essere simile a quella di un

oncogene o di un oncosoppressore).

QUADRO RIASSUNTIVO DELLE MODIFICAZIONI EPIGENETICHE

QUADRO PROSPETTICO DELLE PRINCIPALI MODIFICAZIONI EPIGENETICHE

INDIVIDUALITA’ E SVILUPPO

L’espressione genica dipende dal rapporto tra cromatina aperta (non metilata, esprimibile) e

cromatina compattata (metilata, non esprimibile). Il programma epigenetico dura per tutta la vita

del soggetto. Il grado di metilazione (cioè la capacità di non trascrivere quel gene) determina la

progressione verso lo sviluppo embrionale (le cellule durante lo sviluppo sono sempre più metilate e

esprimono sempre meno genoma).

Prima della fecondazione, sia la cellula uovo che lo spermatozoo sono ipermetilati, perché il genoma

deve solo essere trasportato e non espresso (il grado di metilazione nello spermatozoo è maggiore).

Con la fecondazione, si ha la fusione del pronucleo maschile con il pronucleo femminile; l’mRNA

della cellula uovo innesca la replicazione, poiché lo spermatozoo non ha citoplasma né mitocondri.

Nel momento della fusione dei due pronuclei, ognuno ha la propria individualità, e si forma un

nuovo individuo (nuovo equilibrio) dalla fusione di due individualità.

Dopo la fecondazione si verifica, quantitativamente, un’ondata di demetilazione (si ha un minore

quantitativo di nucleotidi metilati); ma la demetilazione è un processo passivo, e avviene perché non

sono presenti enzimi che mantengono lo stato di metilazione (cioè non sono presenti Dnmt1, che

metilano il filamento figlio partendo dallo stampo del filamento parentale). Quindi, con la fusione del

genoma, entrambi i filamenti sono metilati; dopo la prima mitosi, i filamenti figli non acquisiscono lo

stato di metilazione, e quindi la quantità totale di filamenti metilati si dimezza; e così via per i

successivi cicli mitotici (gli unici filamenti metilati sono quelli originari dello spermatozoo e della

cellula uovo). Questi fenomeni corrispondono all’onda di demetilazione, che si verifica dallo stadio di

zigote (1 cellula) allo stadio di morula (8 cellule, 1-3 giorni). Successivamente, la morula esprime

Dnmt1, e quindi si ha una ondata di rimetilazione verso la blastocisti. Ciò ha due importanti

correlazioni funzionali:

- tra zigote e morula, non è espressa Dnmt1, le cellule si demetilano, quindi staminali totipotenti

- tra morula e blastocisti, è espressa Dnmt1, le cellule si rimetilano, quindi staminali pluripotenti

All’interno della blastocisti, ci sono due tipologie cellulari differenti (con programmi epigenetici

differenti): cellule esterne del blastocele (daranno origine a placenta e annessi) e cellule interne del

cumulus (daranno origine all’embrione). All’interno del cumulus, le cellule prenderanno il

commitment per uno dei tre foglietti embrionali di sviluppo tissutale. Il differente programma

epigenetico (differente grado di metilazione) è correlato alla funzione: le cellule del blastocele che

danno vita all’amnios e ai villi coriali necessitano di alto rate proliferativo, e quindi sono soggette a

scarso controllo genetico. Quindi l’amniocentesi è puramente un’analisi statistica: la linea cellulare è

diversa da quella del feto, e quindi eventuali anomalie dell’amnios non sono necessariamente

correlate ad anomalie del feto.

Zigote => (demetilazione) => morula => (rimetilazione) => blastocisti

L’onda di demetilazione (replicazione cellulare verso la morula) è stimolata dallo spermatozoo. Il

DNA dello spermatozoo non è legato ad istoni, ma a protammine, che bloccano il DNA dello

spermatozoo. Dopo la formazione del nuovo nucleo si ha (per attività proteasica) la degradazione

delle protammine. Ciò lascia libero il DNA dello spermatozoo, che si riassembla con istoni; inizia la

duplicazione cellulare, e quindi inizia l’onda di demetilazione (il genoma paterno trascina il genoma

materno). Nell’onda di demetilazione, il DNA paterno è demetilato subito, mentre quello materno

successivamente e più lentamente. Quando, appena prima dello stadio di morula (la morula

rappresenta il picco di demetilazione), si riattivano Dnmt1 e Dnmt3a/b, ricomincia la metilazione.

IMPRINTING GENOMICO

espressione genetica dipndente dall’origine gametica

Quando avviene la fusione dei due pronuclei avvengono il crossing over e la cancellazione dei geni

imprinted dello spermatozoo e della cellula uovo. Durante la gametogenesi, i marcatori di imprinting

sono cancellati; altri marcatori agiranno dopo la fecondazione. Quindi all’individualità genetica

(crossing over) si aggiunge l’individualità epigenetica (nella gametogenesi c’è cancellazione

dell’imprinting materno e paterno, con formazione di un nuovo imprinting individuo-specifico).

Dall’unione dei gameti, dopo qualche ora ho la cancellazione dell’assetto di imprinting paterno e poi

di quello materno; viene mantenuta una qualche differenza paterno/materno (posso sempre

distinguere il gene paterno dal gene materno), ma il nuovo imprinting dell’embrione è differente da

quello dei genitori, e viene mantenuto per tutta la vita. Ci sono molti parallelismi tra l’epigenetica

dell’imprinting e l’inattivazione del cromosoma X.

Ci sono 100 geni imprinted, raggruppati in cluster, ognuno dei quali è controllato da ICR (regione di

controllo sull’imprinting), tramite azione in cis. Le malattie da imprinting si possono manifestare in

base all’origine dell’allele mutato (s. di Angelman VS s. di Prader-Willi).

Patologie correlate ad imprinting: s. di Beckwith-Wiedemann (ipercrescita, macroglossia, difetti della

parete addominale, emi-ipertrofia, ipoglicemia, tumori), s. di Prader-Willi, s. di Angelman, s. di Silver-

Russell (ritardo di crescita, asimmetria corporea, dismorfismo), m. di Wilms (nefroblastoma), diabete

mellito parossistico neonatale, paraganglioma familiare, (s. di Turner).

Malattie complesse con manifestazioni dipendenti dai genitori: asma, autismo, s. di Tourette,

psoriasi, diabete tipo1, diabete tipo2, alcolismo, m. di Alzheimer, bipolarismo, schizofrenia.

ICR (regioni di controllo dell’imprinting)

Le ICR sono regioni di DNA di 1-2 kb, ricche in CG. Le ICR esibiscono modificazioni istoniche e

metilazione del DNA allele-specifico. Si dividono in:

- ICR metilati durante l’oogenesi, sul cromosoma di origine materna. La maggioranza delle ICR

vengono metilate nella linea germinativa materna, e sono spesso promotori per trascritti il cui

prodotto è associato alla repressione locale

- ICR metilati durante la spermatogenesi, sul cromosoma di origine paterna.

Il programma epigenetico è attivo dalle prime fasi della fecondazione: ogni cellula della morula ha un

suo programma specifico e definito. Nella morula, infatti, viene espressa Dnmt (traslocata dal

citoplasma al nucleo). L’orientamento spaziale delle cellula è responsabile dei differenti pattern di

metilazione del DNA, che condurrà a specificità tissutali diverse.

MODELLI DI PROGRAMMAZIONE EPIGENETICA

Il programma epigenetico si esplica a partire dallo zigote, e da qui si passa a genomi sempre più

ristretti nell’espressione (tramite metilazione, acetilazione,...); le modifiche epigenetiche sono

fondamentali per la differenziazione. Il programma epigenetico deve sia permettere il

differenziamento (embriogenesi) sia mantenere un reservoir di cellule staminali nell’adulto. Ci sono

tre modelli di funzionamento (nessuno esclude l’altro, sono evoluzioni dello stesso concetto):

1) MODELLO DI ATTIVAZIONE GERARCHICA

Ogni fase dipende da fattori a monte che inducono quella fase. I segnali sono interni (accensione di

geni) o esterni (fattori di crescita paracrini). Secondo questo tipo di controllo, non tutti i geni sono

sotto crontrollo epigenetico.

2) MODELLO DELL’ACCESSIVITA’ GLOBALE

Il genoma inizialmente è demetilato, poi va incontro a metilazione. Ma questo modello non tiene

conto dell’esistenza dei geni strutturali (che non possono essere metilati in modo specifico, poichè

non contengono CpG Island). I geni strutturali non vengono metilati perchè le ICR e le CpG Island

permettono di distinguere quali geni vanno metilati e quali non vanno metilati: i geni strutturali

mancano di CpG Island e hanno poche binding protein nel promotore; sono quindi geni

housekeeping (vengono sempre trascritti, perchè sono strutturali, e quindi non devono essere

downregolati).

3) MODELLO “MARKING LOCALISED”

Le modificazioni epigenetiche sono considerate in modo regionale; vi sono regioni “marcatori”

controllate dal programma epigenetico. Il programma epigenetico controlla quindi regioni, non

singoli geni, tramite gli ETCM (early transcription competence marks).

COMPLESSO POLYCOMB (controllore del controllore)

Le proteine del complesso Polycomb (PRC) permettono l’aggancio dei fattori epigenetici (Dnmt). La

metilazione controlla l’espressione, e il complesso Polycomb controlla (permette) la metilazione.

Quindi il complesso Polycomb controlla il legame alla cromatina delle proteine che modificano la

cromatina; permette l’ingresso nel committment, regolando l’ingresso nelle varie linee

differenziative.

Silenziamento genico tramite il complesso Polycomb.

Polycomb permette di modificare l’espressione genica durante la differenziazione.

Il programma epigenetico è continuo (da pochi minuti dopo la fecondazione alla morte). Con l’età, il

numero di cellule staminali midollari diminuisce, poichè queste si evolvono con l’individuo (il

numero di cellule staminali in proliferazione asimmetrica è maggiore di quelle in proliferazione

simmetrica; inoltre nell’adulto diminuisce l’attività telomerasica).

Le modifiche epigenetiche permettono l’adattamento all’ambiente (perchè sono influenzate

dall’ambiente). L’adattamento all’ambiente si attua quindi in due modi:

- modificazioni a livello organico (immediate,) (vasodilatazione o vasocostrizione)

- modificazioni epigenetiche (ereditate, mantenute nel tempo)

Genotipo => (sviluppo embriogenico: fattori ambientali uterini vs fattori intrinseci) => Epigenotipo1

=> (mantenimento dell’epigenoma: fattori ambientali esterni vs fattori intrinseci) => Epigenotipo2 =>

Epigenotipo3 => Epigenotipo4. Il fenotipo cambia in modo continuo (i fattori ambientali, uterini o

postnatali, danno la possibilità di modificare il fenotipo, modificando tramite modifiche epigenetiche

le cellule staminali dell’individuo).

SVILUPPO E INVECCHIAMENTO

La metilazione della cromatina è correlata alla conservazione della memoria. Nell’Alzheimer si hanno

aree modificate di metilazione sull’ippocampo, che modificano la via di trasmissione della LTP (long

term potentiation). L’ac. valproico è un demetilante, e viene utilizzato per il trattamento della

schizofrenia. Quindi anche la plasticità sinaptica, la formazione della memoria e l’allenamento

dipendono da modificazioni epigenetiche.

L’invecchiamento è un processo passivo che accade per il completamento naturale del programma

attivo epigenetico. I cambiamenti epigenetici modificano lo sviluppo embrionale e morfologico

dell’organismo. L’invecchiamento delle cellule staminali è associato ad una riduzione nell’attività

telomerasica (anche le sindromi da invecchiamento precoce sono associate a riduzione dell’attività

telomerasica), mentre il cancro è associato a un aumento dell’attività telomerasica. Lo stress, il fumo

e l’obesità contribuiscono a una riduzione dell’attività.

L’invecchiamento dell’individuo non è determinato dall’invecchiamento fisico del tessuto, ma è

dovuto alla deplezione delle cellule staminali.

CORRELAZIONI TRA STAMINALI, STRESS, INVECCHIAMENTO E CANCRO

STRESS

Topine gravide furono sottoposte a stress, e quindi dopo la nascita i topini furono sottoposti a deficit

di cure materne. I topolini della prima generazione, stressati dalla nascita, avevano ipermetilazione

del promotore del gene per i glucocorticoidi nell’ipotalamo (minore produzione di cortisolo, per

diminuire la reazione di lotta-fuga, che altrimenti sarebbe costante e mortale). I topolini della

seconda generazione, non sottoposti a stress, mantengono il programma epigenetico di metilazione

del promotore, e hanno quindi una maggiore soglia allo stress (non sanno rispondere normalmente

a stress normali, perchè i genitori sono stati abituati a vivere a livelli di stress più elevati).

In un altro esperimento, la madre fu sottoposta a malnutrizione, e i figli andavano incontro a obesità

e diabete con maggiore frequenza.

Visto che il silenziamento epigenetico (metilazione) dipende dalla disponibilità di metili, è

influenzato dalla presenza di donatori di metili (ac. folico, metionina, serina, colina). Somministrando

folati in gravidanza riduco l’incidenza della spina bifida nel nascituro, ma dopo 10-15 anni

aumentano i rischi di carcinoma per la madre. L’esistenza di questi “epialleli metastabili” (alleli il cui

fenotipo dipende dallo stato di metilazione del genotipo) è stata dimostrata nei topi, in cui

un’alimentazione privata o supplemetata di metili influisce sul colore della pelliccia.

I gemelli monoclonali condividono lo stesso genotipo (derivano dallo stesso zigote), ma il loro

fenotipo (ad es: incidenza di malattia) è differente poichè hanno diverse modifiche epigenetiche.