FilmArray system versus RT-PCR method in meningitidis and sepsis management: an example
of routine-emergency integration
Relatore: D.ssa Loria Bianchi, PhD
U.O. Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche- Sezione Microbiologia, Ospedale S.Jacopo, Pistoia
14 ottobre, 2014
Elenco dei microrganismi responsabili di meningiti acute
Rapidità della diagnosi di meningite e prognosi del paziente
Meno gravi delle forme batteriche, di regola a decorso acuto, con risoluzione completa della sintomatologia
Meningite virale
Sono a liquor limpide, asettiche, iniziano con una pleiocitosi con presenza di PMN, seguita poi da aumento di linfociti
Più alta incidenza nei bambini e giovani adulti. Diagnosi: importante per escludere una meningite batterica
Meningite batterica
Postumi come sordità, cecità, paresi, ritardo mentale sono caratteristici delle forme batteriche ed assenti in quelle virali
•Haemophilus influenzae tipo b: bassa mortalità (3%) ma causa di deficit intellettivi in oltre il 30% dei bambini colpiti
•Meningite pneumococcica: alto tasso di letalità (12%), ma solo raramente lascia esiti nei sopravvissuti
Meningite batterica • Aspetto: torbido • Globuli bianchi 1000-5000/µl • Neutrofili % > 80% • Glucosio < 34 mg/dl • R gluliquor/glusiero ≤ 0.23l
Meningite virale • Aspetto: limpido
• Linfomonociti 100-1000/ µl • Glucosio 40-80 mg/dl •R gluliquor/glusiero >0.4
In presenza di cellularità liquorale > 6-200 Leucociti/mm3 le caratteristiche dell’esame chimico-fisico hanno un VPP di meningite infettiva maggiore dell’ 80% ( 3% dei casi)
ALGORITMO DIAGNOSTICO BASATO SUL RISULTATO DELL’ESAME CHIMICO FISICO
In presenza di un liquor : • Limpido • Incolore • Lieve e moderata pleiocitosi: 6-200 Leucociti/mm3 : 27% dei casi
totali (65/240) Prevalenza di PMN (> 60%) si esegue pannello batterico e successivamente pannello virale (12% dei casi) Prevalenza di cellule mononucleate (> 80%) si esegue il pannello virale (15% dei casi ) Presenza di pleiocitosi con PMN < 60% e cellule mononu- cleate < 80%) viene eseguito si il pannello virale che quello batterico (73% dei casi)
VPP DELL’ESAME CHIMICO-FISICO IN PRESENZA DI LIEVE E MODERATA PLEIOCITOSI
Obiettivi
Valutare: 1. sensibilità e specificità della tecnologia FilmArray (TFA:
applicazione “off label” della metodica) su LCR rispetto alle metodiche «tradizionali» e all’RT-PCR
2. il valore predittivo negativo (VPN) della RT-PCR e della
tecnologia TFA su campioni di liquor, sangue e liquidi cavitari (pleurico, peritoneale, pericardico, articolare) con validazione clinica della metodica
3. l’efficacia nella gestione della sepsi calcolando il Turn Around
Time (TAT) rispetto alle metodiche tradizionali
Casistica
Metodologia impiegata
240 campioni di LCR raccolti dal 2009-2014 180 campioni di sangue raccolti dal 2012-2014 9 liquidi cavitari
• Esame chimico fisico LCR : valutazione macroscopica: volume, aspetto, colore valutazione microscopica: conta delle cellule e differenziazione
• Esami biochimici (liquor/siero) ed ematologici: glicemia, elettroliti (Na, K, Cl), enzimi epatici (transaminasi, gamma-GT, etc), proteine totali, albumina, emocromo, PT, PTT;
• Esami microbiologici: estrazione degli antigeni solubili, esame colturale (piastre di agar cioccolato e sangue, etc in CO2), emocoltura (Becton Dikinson)
• Esami molecolari: Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCT) Tecnologia FilmArray (TFA)
Tecnologia FilmArray
Microrganismi e fattori di resistenza valutati con TFA e RT-PCR su LCR e sangue
0
2
4
6
8
10
12
N. meningitidis L. monocytogenes E. coli S. pneumoniae H. influenzae K. pnuemoniae Streptococcogruppo B
N°
pat
oge
ni r
ileva
ti
CONFRONTO TRA METODICHE: NUMERO DI PATOGENI RILEVATI NEI LIQUOR
Antigeni solubili Batterioscopico Gram Colturale liquor Emocoltura RT-PCR TFA
LIQUOR Antigeni solubili Batterioscopico
Gram Colturale liquor Emocoltura RT-PCR TFA
N. casi
Sensibilità
N. casi
Sensibilità N.
casi Sensibilit
à N.
casi Sensibilit
à N.
casi Sensibilit
à N.
casi Sensibilit
à N. meningitidis 1 33,33% 1 33,33% 1 33,33% 1 33,33% 3 100,00% 1 33,33%
L. monocytogenes - - 5 71,43% 4 57,14% 5 71,43% 7 100,00% 4 57,14% E. coli 0 0,00% 1 25,00% 1 14,29% 2 28,57% 4 100,00% 3 75,00%
S. pneumoniae 5 45,45% 5 45,45% 5 71,43% 5 71,43% 11 100,00% 8 72,73% H. influenzae 1 20,00% 1 20,00% 2 28,57% 1 14,29% 5 100,00% 3 60,00%
K. pneumoniae - - 0 0,00% 0 0,00% 1 100,00% 1 100,00% 1 100,00% Streptococco gruppo
B 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 1 100,00% 0 0,00%
Totale positivi 7 29,17% 13 40,63% 13 40,63% 15 46,88% 32 100% 20 62,50% VPP 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% VPN 89,27% 91,63% 91,63% 92,44% 100,00% -
CONFRONTO FRA METODICHE: NUMERO DI PATOGENI RILEVATI NEL SANGUE
SENSIBILITÀ E VPN DELLE METODICHE PER LA RICERCA DI PATOGENI NEL SANGUE
RISULTATI SANGUE Emocoltura RT-PCR TFA
Patogeno N. casi Sensibilità N. casi Sensibilità N. casi Sensibilità
N. meningitidis 1 50,00% 2 100,00% 1 50,00%
S. pneumoniae 7 87,50% 8 100,00% 3 37,50%
H. influenzae 4 80,00% 4 80,00% 1 20,00%
E. coli 6 85,71% 5 71,43% 2 28,57%
K. pneumoniae 2 100,00% 1 50,00% 1 50,00%
S. agalactiae 3 100,00% 3 100,00% 1 33,33%
C. albicans 2 100,00% - - 2 100,00%
C. parapsilosis 1 100,00% - - 1 100,00%
Enterococco 5 100,00% - - 2 40,00%
S. aureus 8 100,00% 8 100,00% 4 50,00%
S. marcences 1 100,00% - - 0 0,00%
P. aeruginosa 7 100,00% 7 100,00% 4 57,14%
A. baumannii 1 100,00% - - 1 100,00%
S. capitis 1 100,00% - - - -
P. mirabilis 2 100,00% - - 1 50,00%
Salmonella spp. 1 100,00% - - - -
Totale positivi 52 92,86% 38 67,86% 24 42,86%
Totale germi rilevabili 56 92,86% 42 90,48% 54 44,44%
VPN 96,88% 87,32% 79,49%
CONCLUSIONI (1)
Su LCR, la RT-PCR è la metodica più sensibile (sensibilità e VPN del 100%); inoltre, rilevando il patogeno nella matrice primaria (LCR/sangue) si riduce il TAT (2h e 20’) rispetto all’esame colturale e all’emocoltura.
Su sangue, l’emocoltura è la metodica più sensibile (92,86%) con il più elevato VPN (96.88%) e rimane il «gold» standard nella gestione della sepsi. L’RT-PCR è di grande aiuto per la rapidità di risposta (TAT= 2h e 20 min) anche se ha il limite del ridotto numero di patogeni rilevabili
Su sangue, la TFA deve incrementare la resa estrattiva per aumentare sensibilità (42.66%) e VPN (44.44%) non adeguati per il management della sepsi.
CONCLUSIONI (2)
Su LCR la TFA ha sensibilità più elevata (65%) rispetto al batterioscopico Gram ed estrazione degli antigeni solubili. La facilità di allestimento (2-4 min operatore), di interpretazione del test e il suo TAT di 1h la rendono, quindi, la tecnica più efficace nella gestione del liquor in urgenza
ESAME CHIMICO-FISICO LCR
PERCORSO DIAGNOSTICO NEL SOSPETTO MENINGITE INFETTIVA
Negativo
* in flaconi da emocoltura e processati in automatico nelle ore di chiusura della microbiologia **colorato e refertato entro le ore 12 del 1°gg feriale dal microbiologo RT-PCR pannello batterico e virale (vedere richiesta clinica ed esame chimico-fisico)
Approfondimento diagnostico con metodica RT-PCR in regime di urgenza – routine rapida (entro ore 12 del 1° gg feriale)
• Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)* • Gram**
Positivo
Pannello batterico
• FilmArray (Pannello BCDI)
• Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)* • Gram**
• FilmArray (Pannello BCDI)
Negativo
Pannello virale:
HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-7 CMV EBV Parechovirus Enterovirus Varicella zoster
???
Positivo
Collaboratori Dr. Roberto Giannecchini Dr. Fabiano Santoni Dr. Roberto Toscano Dr. Leonardo Rizzi D.ssa Rosalba Gori D.ssa Cappelli Donatella D.ssa Margherita Niccolai D.ssa Patrizia Lencioni Un grazie particolare a: D.ssa Zaleida Napoli Dr. Swan Donati Dr. Riccardo Lari: Responsabile Area Diagnostica di Laboratorio
Grazie anche a tutto il personale tecnico della microbiologia e
non solo!!
???
ESAME CHIMICO-FISICO LCR
Positivo Negativo
*RT-PCR batterico se LCR arrivato festivo/notturno ** in flaconi da emocoltura e processati in automatico nelle ore di chiusura della microbiolobia ***colorato e refertato entro le ore 12 del 1°gg feriale dal microbiologo RT-PCR pannello batterico e virale (vedere richiesta clinica ed esame chimico-fisico)
Approfondimento diagnostico con metodica RT-PCR in regime di urgenza – routine rapida (entro ore 12 del 1° gg feriale)
se LCR festivo/notturno
• Estrazione degli antigeni solubili* • Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)** • Gram***
• Estrazione degli antigeni solubili* • Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37°C; CO2)** • Gram***
Pannello batterico
Pannello virale:
HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-7 CMV EBV Parechovirus Enterovirus Varicella zoster
PERCORSO DIAGNOSTICO NEL SOSPETTO MENINGITE INFETTIVA
N.meningitidis S.pneumoniae L. monocytogenes E.Coli S-agalactiae H.Influenzae K.pneumoniae
Pannello batterico:
Sensibilità delle metodiche colturali e molecolari per la ricerca di patogeni nei liquidi cavitari
LIQUIDI CAVITARI Casi positivi rilevati con:
ESAME
COLTURALE RT-PCR TFA
Liquidi peritoneali (n=4)
E. coli 2 2 1
K. pneumoniae 1 1 1
P. aeruginosa 1 1 1
Liquidi pleurici (n=4)
S. pneumoniae 1 2 1
K. pneumoniae (KPC) 1 1 1
H. influenzae 0 1 0
Liquidi articolari (n=1)
S. aureus 1 1 1
Totale positivi 7 9 6
Sensibilità 77,78% 100% 66,67%
Kit Produttore Patogeno Target bp
EusepScreen
Adulti Eurospital
N. meningitidis ctrA (capsule polysaccharide
export outer membrane
protein) -
S. pneumoniae lytA (N-acetomuramoyl-L-
alanine amidase) -
H. influenzae
bexA (involved in the
synthesis of the
polysaccharide capsule
structure)
-
Adenovirus L4 (hexon assembly protein) -
EusepScreen
Lattanti Eurospital
K. pneumoniae phoE (outer membrane
phospoporin protein E) -
E. coli uidB (glucuronide transporter) -
S. agalactiae sip (streptococcal surface
immunogenic protein) -
L. monocytogenes iap (invasion associated
protein) -
HSV1 HSV2 VZV R-
gene Argene
HSV1 US7 116
HSV2 US2 123
VZV gp19 114
ENTEROVIRUS R-
gene Argene Enterovirus 5' UTR 146
CMV HHV6,7,8 R-
gene Argene
CMV ppUL83 283
HHV6 U57 116
HHV7 U42 123
HHV8 ORF26 146
EBV R-gene Argene EBV BXLF1 (thymidine kinase) 169