Dopo aver determinato la presenza di microrganismi patogeni o loro tossine negli alimenti,occorre stabilire se tali microrganismi o tossine sono biologicamente attivi. A tale scopo, sepossibile, sono utilizzati animali da laboratorio. Per i casi in cui non possono essere impie-gati animali o sistemi animali, sono stati sviluppati diversi sistemi di colture tissutali che for-niscono informazioni sull’attività biologica dei patogeni o dei loro prodotti tossici. Questisaggi biologici e i test correlati sono i metodi elettivi per alcuni patogeni; alcuni dei piùimportanti sono presentati nella tabella 12.1.

12.1 Test su animali

12.1.1 Letalità del topo

Questo metodo è stato impiegato per la prima volta per i patogeni di origine alimentare intor-no al 1920 ed è tuttora un importante strumento di analisi biologica. Per valutare la presen-za di tossina botulinica negli alimenti, parti di estratti adeguatamente preparati vengono trat-tate con tripsina (per le tossine dei ceppi non proteolitici di Clostridium botulinum). Quindi0,5 mL di estratto trattato con tripsina e un pari volume di estratto non trattato vengono iniet-tati nel peritoneo (IP, injected intraperitoneally) di una coppia di topi. Preparazioni non trat-tate con l’enzima, riscaldate per 10 minuti a 100 °C, vengono iniettate in un’altra coppia ditopi. Tutti i topi iniettati vengono osservati per 72 ore per la comparsa dei sintomi di botuli-smo o per la morte. I topi iniettati con le preparazioni trattate termicamente non dovrebberomorire, poiché la tossina botulinica è termolabile. Questo test può essere reso specifico pro-teggendo i topi con antitossina botulinica nota; analogamente può essere determinato il tiposierologico specifico di tossina botulinica (vedi il capitolo 24 per i tipi di tossina).

Il metodo basato sulla letalità del topo può essere impiegato anche per altre tossine; Starke Duncan45 lo hanno utilizzato per determinare la presenza dell’enterotossina di Clostridiumperfringens. I topi venivano iniettati IP con preparazioni di enterotossina e osservati fino a72 ore per il decesso; la dose letale era espressa come reciproco della diluizione più elevatain grado di determinare la morte dei topi entro 72 ore. Genigeorgis e colleghi18 hanno impie-gato questo metodo ricorrendo però a iniezioni intravenose (IV). In questo caso, le prepara-zioni di enterotossina di C. perfringens sono state diluite in tampone fosfato a pH 6,7 perottenere concentrazioni comprese tra 5 e 12 μg/mL; quindi 0,25 mL di ciascuna diluizionesono stati iniettati in sei topi maschi del peso di 12-20 g, registrando poi il numero di mortie calcolando il valore di LD50 (cioè la dose di tossina in grado di provocare la morte del 50%

Capitolo 12

Saggi e metodi biologici

309J.M. Jay et al., Microbiologia degli alimenti© Springer-Verlag Italia 2009

Tabella 12.1 Alcuni test utilizzati per valutare l’attività biologica di diversi patogeni di originealimentare e/o di loro prodotti (dati ricavati dalla letteratura)

Organismo Tossina/Prodotto Saggio biologico Sensibilità

A. hydrophila Enterotossina citotossica Intestino di topo neonato ~30 ngB. cereus Tossina diarrogena Somministrazione a scimmie

Tossina diarrogena Legatura di ileo di coniglioTossina diarrogena Pelle di coniglioTossina diarrogena Pelle di porcellino d’IndiaTossina diarrogena Letalità del topoTossina emetica Emesi in Macaca mulattaTossina emetica Suncus murinus ED50 12,9 μg/kg

C. jejuni Cellule vitali Topi adulti 104 celluleCellule vitali Polli 90 celluleCellule vitali Topi neonatiSurnatanti colturali Legatura di digiuno

di ratto adultoEnterotossine Legatura di ileo di ratto

C. botulinum Tossine A, B, E, F, G Letalità del topoC. perfringens A Enterotossina Letalità del topo, LD50 1,8 μg

Enterotossina Legatura di ileo di topo, 1,0 μgtest di 90 minuti

Enterotossina Legatura di ileo di coniglio, 6,25 μgtest di 90 minuti

Enterotossina Pelle di porcellino d’India 0,06-0,125 mg/mL(eritema)

Endospore Ratti di 7-12 giorni 1.500 sporeEndospore Topi di 9 giorni 700 sporeEndospore Topi adulti germ-free 10 spore

E. coli LT Legatura di ileo di coniglio,test di 18 ore

ST Topo neonato(accumulo di liquido)

ST Legatura di ileo di coniglio,test di 6 ore

STa Topo neonatoSTa Suinetti di 1 o 3 giorniSTb Legatura di digiuno di maialeSTb Suinetti svezzati,

di 7-9 settimaneE. coli O157:H7 ETEC Colonizzazione del topoSalmonella spp. Citotossina termolabile Legatura di ileo di coniglio

(inibizione sintesi proteica)S. enterica Gastroenteriti Coniglio bianco New Zeland >105 celluleStaphylococcus SEB Pelle di porcellino d’india 0,1-1,0 pgaureus Tutte le enterotossine Vomito in scimmia rhesus 5 μg/2-3 kg

di peso corporeoSEA, SEB Vomito in gattino neonato 0,1-0,5 μg/kg

di peso corporeoV. parahaemolyticus Brodi di coltura Legatura di ileo di coniglio 102 cellule

(risposta nel 50% dei trattati)

segue

Microbiologia degli alimenti310

dei topi iniettati). Il topo è l’animale più utilizzato per valutare la virulenza di Listeria spp.Nei topi normali adulti LD50 per L. monocytogenes è pari a 105-106 cellule; nei topi giovanidi 15 g possono essere letali anche sole 50 cellule (vedi capitolo 25).

Suncus murinusQuesto piccolo animale, simile a un topo, è stato utilizzato in Giappone come modello speri-mentale per studiare l’azione emetica di una grande varietà di farmaci48; inoltre si è dimostra-to sensibile alla cereulide, la tossina emetica di Bacillus cereus1. Il peso degli adulti di Sun-cus murinus non supera i 100 grammi; per scopi sperimentali sono impiegati individui di 50-80 grammi. Nel loro studio sugli effetti della tossina emetica di B. cereus su Suncus, Agata ecolleghi1 hanno ricavato un valore di ED50 (quantità di tossina necessaria per causare emesinella metà degli animali esposti) di 12,9 μg/kg per somministrazione orale e di 9,8 μg/kg periniezione intraperitoneale. Non è chiaro se Suncus possa rappresentare un modello animaleadatto per le enterotossine stafilococciche o di altre specie.

FurettiLa femmina adulta del furetto (peso corporeo medio 735 g) è risultata sensibile all’enterotos-sina stafilococcica B (SEB); la tossina è stata introdotta mediante sondino dosatore oralenello stomaco di animali tenuti a digiuno per 24 ore ma liberi di bere acqua. Sono state som-ministrate dosi di 1, 2 o 5 mg di SEB aggiunte a soluzioni saline sterili: gli animali trattatisono stati osservati per 3 ore, rilevando ogni 5 minuti temperatura corporea, pressione, inci-denza di conati, vomito e defecazione 52. Rispetto ai controlli, cui era stata somministratasolo soluzione salina, gli animali trattati con 5 mg di SEB hanno mostrato dopo 75 minuti un

Capitolo 12 - Saggi e metodi biologici 311

segue Tabella 12.1

Organismo Tossina/Prodotto Saggio biologico Sensibilità

V. parahaemolyticus Cellule vitali Legatura di ileo di coniglio adulto (invasività)

Tossina diretta termostabile Letalità del topo, 5 μg/topomorte in 1 minuto

Tossina diretta termostabile Letalità del topo, LD50 IP 1,5 μgTossina diretta termostabile Legatura di ileo di coniglio 250 μgTossina diretta termostabile Skin test in porcellino d’india 2,5 μg

V. vulnificus Filtrati colturali Skin test in coniglioV. cholerae (non-O1) Enterotossina Topo neonatoY. enterocolitica Tossina termostabile Sereny test

Tossina termostabile Topi neonati (orale) 110 ngEnterotossina Legatura di ileo di coniglio,

test da 6 a 18 oreCellule vitali Diarrea in coniglio Dose infettiva

50% = 2,9 ×108

Cellule vitali Letalità del gattino lattante, 14 celluleper iniezione IP

Cellule vitali Mortalità di gerbillo, 100 celluleper iniezione IP

LT= Tossina termolabile; ST= Tossina termostabile; SEA = enterotossina stafilococcica A; ED50 = vedi testo;ETEC= E. coli enterotossigeno.

significativo aumento della temperatura sottocutanea. Tutti gli animali trattati con 5 mg diSEB hanno avuto conati di vomito (dopo circa 105 minuti, per 18 volte) e vomitato (dopocirca 106 minuti, per 2 volte). Il furetto si era dimostrato precedentemente sensibile alla SEBiniettata per via intravenosa.

12.1.2 Suckling mouse (topo neonato)

Questo modello animale è stato introdotto inizialmente da Dean e colleghi12 per le enterotos-sine di Escherichia coli ed è ora utilizzato per alcuni altri patogeni di origine alimentare.Dopo essere stati separati dalle madri, ai topi neonati vengono somministrati per via orale0,05-0,1 mL del materiale da testare, con l’aiuto di un ago ipodermico smussato di calibro23. Per determinare la presenza nell’intestino tenue del materiale in esame, questo può esse-re colorato con una goccia di blu Evans al 5% per millilitro. Gli animali vengono solitamen-te mantenuti a 25 °C per 2 ore e poi uccisi. Dopo rimozione completa dell’intestino tenue, sidetermina l’attività biologica relativa del materiale testato, calcolando il rapporto peso del-l’intestino/peso corporeo (GW/BW). Per le enterotossine di E. coli Giannella19 aveva trova-to i seguenti rapporti GW/BW: < 0,074 = test negativo; 0,075-0,082 = intermedio (dovrebbeessere ripetuto); > 0,083 = test positivo. L’autore ha osservato una variabilità di giorno ingiorno compresa tra 10,5 e 15,7% tra i diversi ceppi di E. coli e del 9% circa tra le replicheeffettuate sullo stesso ceppo. Per E. coli STa, Mullan e colleghi32 hanno considerato negati-vo un valore di GW/BW pari a 0,060; per lo stesso microrganismo, Wood e colleghi51 hannoconsiderato positivi valori di GW/BW > 0,083. Boyce e colleghi6, mantenendo a temperatu-ra ambiente per 4 ore i topi trattati con enterotossine termostabili di Yersinia enterocolitica,hanno giudicato positivi valori di GW/BW uguali o superiori a 0,083. Negli studi su Y. ente-rocolitica, Okamoto e colleghi36 hanno tenuto i topi per 3 ore a 25 °C e hanno consideratopositivo un valore di 0,083.

Utilizzando come modello il topo neonato, il materiale da testare può anche essere iniet-tato direttamente nello stomaco dell’animale per via percutanea, attraverso la pelle trasluci-da, o somministrato per via orogastrica o intraperitoneale. Per lo screening di un elevatonumero di colture, gli intestini possono essere ispezionati visivamente per valutarne la dila-tazione e l’accumulo di liquidi 38. Topi neonati e suinetti di 1-3 giorni sono gli animali di scel-ta per valutare la presenza di enterotossina STa di E. coli; STb è inattiva nei topi neonati maattiva nei suinetti e nei suinetti svezzati 7,27. Il saggio del topo neonato non risponde all’ente-rotossina colerica o alla tossina termolabile (LT) di E. coli; per la tossina STa di E. coli, èben correlato con il test di 6 ore della legatura di ileo di coniglio.

I topi neonati sono stati impiegati in studi di letalità impiegando iniezioni intraperitoneali.Ausilio e colleghi3 hanno utilizzato topi Swiss di 1-3 giorni, iniettandoli con 0,1 mL di coltu-ra diluita. I topi sono stati osservati per 7 giorni: i decessi verificatisi entro 24 ore sono staticonsiderati non specifici, mentre quelli occorsi tra i giorni 2 e 7 sono stati considerati speci-fici per Y. enterocolitica. Con questo metodo può essere calcolato un valore LD50 relativo alnumero di cellule per inoculo; nel caso di Y. enterocolitica, Ausilio e colleghi hanno calcola-to un LD50 pari a 14 cellule e registrato un tempo medio per la morte dei topi di 3 giorni.

12.1.3 Induzione di diarrea in coniglio e topo

Conigli e topi sono stati impiegati per testare l’azione diarrogena di alcuni patogeni di origi-ne alimentare. Pai e colleghi37 hanno utilizzato giovani conigli di 500-800 grammi, ai qualihanno somministrato per via orogastrica circa 1010 cellule di Y. enterocolitica sospese in

Microbiologia degli alimenti312

soluzione di bicarbonato di sodio al 10%; la diarrea si è manifestata nell’87% dei 47 conigliesaminati, dopo un tempo medio di 5,4 giorni. Si è osservata colonizzazione batterica in tuttigli animali, indipendentemente dalla dose di cellule somministrata.

Per testare l’azione diarrogena di Y. enteorcolitica, Schiemann41 ha utilizzato topi privatidi acqua per 24 ore, mettendo a loro disposizione acqua peptonata contenente 109

cellule/mL; dopo 24 ore l’acqua inoculata è stata sostituita con acqua potabile fresca. Dopo2 giorni le feci dei topi sono state esaminate per cercare segni di diarrea. Per le enterotossi-ne di E. coli e di Vibrio cholerae Smith 42 ha impiegato conigli di 6-9 giorni, somministran-dogli mediante sondino gastrico 1-5 mL di filtrato colturale. Gli animali sono stati lasciatitornare dalla propria madre e sottoposti a osservazione per la comparsa di diarrea; la rispo-sta è stata considerata positiva se il sintomo si manifestava dopo 6-8 ore. Negli animali dece-duti è stata riscontrata la presenza di grandi quantità di liquido giallo sia nel piccolo sia nelgrande intestino. L’enterotossina è stata quantificata indirettamente calcolando il rapporto trapeso dell’intestino e peso corporeo. Con un metodo simile sono stati impiegati giovani maia-li per testare l’attività dell’enterotossina di ceppi suini di E. coli. Conigli neonati sono statiutilizzati anche per rilevare le tossine Shiga-like di E. coli 34.

12.1.4 Monkey feeding (somministrazione alla scimmia)

L’impiego di scimmie rhesus (Macaca mulatta) per testare le enterotossine stafilococcichefu sviluppato nel 1931 da Jordan e McBroom 26. Dopo l’uomo, questo è forse l’animale piùsensibile alle enterotossine degli stafilococchi. Per determinare le enterotossine con questometodo, si selezionano giovani macachi di 2-3 kg, ai quali vengono somministrati, median-te sondino gastrico, 50 mL di una soluzione contenente l’alimento omogenato. Gli animalisono poi osservati ininterrottamente per 5 ore. La comparsa di vomito in almeno due anima-li su sei denota una risposta positiva. La scimmia rhesus si è dimostrata sensibile a livelli dienterotossine A e B di soli 5 μg per 2-3 kg circa di peso corporeo 31.

12.1.5 Kitten test (test del gattino)

Questo metodo è stato sviluppato da Dolman e colleghi15 per le enterotossine di origine sta-filococcica. Il test originale prevedeva l’iniezione di filtrati all’interno della cavità addomi-nale di gattini molto giovani (250-500 grammi di peso), ma tale procedura dava luogo a risul-tati falsi positivi. Il metodo più comunemente utilizzato consiste nella somministrazioneintravenosa dei filtrati e nell’osservazione continua degli animali per la comparsa di vomito.Quando si utilizzano gatti adulti di 2-4 kg, si hanno risposte positive in 2 o 6 ore10. La com-parsa di vomito è stata riportata per 0,1 e 0,5 μg, rispettivamente, di enterotossina stafilococ-cica A (SEA) e B (SEB) per chilogrammo di peso corporeo4. Questo saggio non possiede lastessa specificità del test sulle scimmie, poiché i filtrati di colture stafilococciche contengo-no altri prodotti metabolici che possono indurre emesi; il vantaggio è tuttavia rappresentatodal fatto che, rispetto alle scimmie, i gattini possono essere procurati e mantenuti con mag-giore facilità.

12.1.6 Skin test su coniglio e porcellino d’india

La cute di questi due animali è utilizzata per saggiare almeno due proprietà delle tossine. Iltest della permeabilità vascolare è generalmente condotto utilizzando conigli albini di 1,5-2,0 kg. Di norma, 0,05-0,1 mL di filtrato colturale vengono iniettati per via intradermica (ID)

Capitolo 12 - Saggi e metodi biologici 313

in un’area rasata della schiena e dei fianchi del coniglio. Da 2 a 18 ore più tardi viene som-ministrata per via intravenosa una soluzione di blu Evans, lasciando poi permeare il coloran-te per 1-2 ore; trascorso tale tempo si misurano i diametri delle due aree blu e si approssimal’area elevando al quadrato i loro valori medi. Sono considerate positive aree di 25 cm2. Latossina termolabile (LT) di E. coli fornisce una risposta positiva in questo saggio16. Con que-sto metodo si è dimostrato che la permeabilità del colorante è funzione della concentrazionedi enterotossina diarrogena di E. coli.

Simile al precedente è un test dell’attività eritematosa che impiega porcellini d’india. Ilmetodo è stato impiegato da Stark e Duncan45 per valutare l’attività eritematosa delle ente-rotossine di C. perfringens. Porcellini d’india di 300-400 grammi vengono depilati (suldorso e sui fianchi) e si contrassegnano aree di cute di 2,5 cm2, nel centro delle quali vengo-no iniettati campioni di 0,05 mL di preparazione di tossina; ogni cavia viene iniettata in duearee diverse. Dopo 18-24 ore gli animali vengono osservati per la comparsa di eritema nelsito di iniezione.

L’enterotossina di C. perfringens produce un eritema concentrico senza necrosi. Vienedefinita unità di attività eritematosa la quantità di enterotossina in grado di provocare un eri-tema di 0,8 cm di diametro; la preparazione di enterotossina impiegata da Stark e Duncanconteneva 1.000 unità eritematose/mL. Per favorire la lettura del risultato, dopo 10 minutidall’iniezione di enterotossina può essere iniettato per via intracardiaca (IC) 1 mL di bluEvans allo 0,5%, misurando il diametro dell’eritema dopo 80 minuti18. La specificità dellereazioni cutanee può essere determinata neutralizzando l’enterotossina con antisieri specifi-ci prima dell’iniezione. Per le enterotossine di C. perfringens il test dell’eritema si è dimo-strato 1000 volte più sensibile della legatura delle anse intestinali di coniglio 23.

12.1.7 Test di Sereny e test di Anton

Il metodo di Sereny, proposto nel 1955, è utilizzato per valutare la virulenza di colture bat-teriche vitali; l’animale più frequentemente utilizzato è il porcellino d’india. Il test vienecondotto su cavie di 400 grammi circa; servendosi di un’ansa, nella congiuntiva dell’anima-le viene applicata una goccia di sospensione cellulare in tampone fosfato contenente da1,5 ×1010 a 2,3 ×1010 cellule/mL. Gli occhi degli animali trattati vengono esaminati quotidia-namente, per 5 giorni, per la comparsa di segni di cheratocongiuntivite. Nella valutazione diceppi di virulenza sconosciuta, è importante testare anche ceppi conosciuti, sia positivi sianegativi.

È stato sviluppato un test di Sereny che impiega topi Swiss ai quali viene somministratala metà della dose riportata sopra. Si è dimostrato molto utile un test di Sereny messo a puntoper ceppi di Shigella e di E. coli enteroinvasivo (EIEC)33.

Il test di Anton è simile al metodo di Sereny ed è utilizzato per valutare la virulenza diListeria spp; viene condotto applicando negli occhi di conigli o porcellini d’india circa 106

cellule di L. monocytogenes e osservando gli animali per la comparsa di congiuntivite 2.

12.2 Modelli animali che richiedono procedure chirurgiche

12.2.1 Tecniche di legatura delle anse intestinali

Queste tecniche si basano sul fatto che alcune enterotossine provocano un accumulo diliquido nell’intestino tenue di animali suscettibili; sebbene possano essere condotte su

Microbiologia degli alimenti314

diversi animali, i conigli sono impiegati più frequentemente. Prima dell’intervento chirurgi-co, i giovani conigli selezionati (7-20 settimane di età e 1,2-2,0 kg di peso) sono tenuti adigiuno e senza acqua per 24 ore oppure a digiuno per 48-72 ore, ma liberi di bere acqua avolontà. Sotto anestesia locale viene effettuata un’incisione di circa 5 cm di lunghezza appe-na al di sotto della linea mediana dell’addome, attraverso i muscoli e il peritoneo, per espor-re l’intestino tenue11. Una sezione di intestino – compresa tra le estremità superiore e infe-riore o appena al di sopra dell’appendice – viene legata con un filo di seta o con altro mate-riale adatto, formando segmenti (loop) di 8-12 cm, distanziati da segmenti di almeno 1 cm.Possono essere preparate fino a 6 sezioni mediante nodi singoli o doppi. Il campione (o lacoltura) da testare, preparato e sospeso in soluzione salina sterile, viene quindi iniettato nellume dei segmenti intestinali legati. Solitamente si utilizza un inoculo di 1 mL, ma si pos-sono impiegare dosi minori o maggiori. Dosi differenti del materiale da testare possonoessere iniettate in sezioni adiacenti o separate da un segmento non trattato o iniettato solocon soluzione salina; l’addome viene quindi chiuso mediante sutura e si lascia che l’anima-le si riprenda dall’anestesia. Dopo l’intervento, l’animale può essere privato di cibo e acquaper altre 18-24 ore, oppure lo si può lasciare libero di assumere solo cibo o sola acqua oentrambi. Con le legature intatte, l’animale non può sopravvivere più di 30-36 ore8.

Per valutare l’effetto dei materiali iniettati, l’animale viene sacrificato per esaminare leanse intestinali e aspirare e misurare il liquido accumulato. La reazione biologica può esserequantificata misurando il rapporto tra volume di fluido accumulatosi nell’ansa e la lunghezzadi quest’ultima 8, oppure calcolando il volume di fluido secreto per milligrammo di pesosecco di intestino 30. Sono stati riportati valori variabili per la quantità minima di enterotos-sina di C. perfringens necessaria per produrre una reazione positiva nell’ansa intestinale: da28-40 μg fino a 125 μg utilizzando la tecnica standard; con un metodo più rapido (90 minu-ti) la reazione enteropatogena si è verificata con soli 6,25 μg di tossina18.

Questa tecnica è stata sviluppata per studiare la modalità di azione patogena dell’agenteeziologico del colera11. È stata in seguito impiegata largamente in studi sulla virulenza e sulmeccanismo patogenetico di microrganismi di origine alimentare, tra i quali Bacillus cereus,C. perfringens, E. coli e Vibrio parahaemolyticus.

Sebbene il coniglio sia il modello animale più utilizzato nei metodi basati sulla legaturadell’intestino, sono impiegate anche altre specie. Per esempio, per le enterotossine di E. colipuò essere usata l’ansa intestinale di topo, come nello studio condotto da Punyashthiti e Fin-kelstein40. Topi Swiss (18-22 grammi) sono stati tenuti a digiuno per 8 ore prima del test.Dopo l’apertura dell’addome sotto leggera anestesia, sono state preparate due sezioni inte-stinali di 6 cm, separate da una regione intermedia di 1 cm; le sezioni di intestino sono statequindi inoculate con 0,2 mL del materiale in esame e l’addome è stato richiuso. Gli anima-li sono stati tenuti a digiuno e senza acqua e uccisi 8 dopo ore. Sono state misurate la quan-tità di liquido accumulato e la lunghezza delle anse. I risultati sono considerati positiviquando il rapporto tra volume di fluido e lunghezza dell’ansa è almeno pari a 50 mg/cm. Inquesto studio, per le reazioni positive il rapporto era generalmente compreso tra 50 e 100,occasionalmente vicino a 200 o superiore.

In alternativa, per misurare l’intensità di una reazione tossica, può essere utilizzato l’in-cremento netto del peso dell’ansa, espresso in milligrammi 53. Con la legatura dell’ansa inte-stinale di topo è possibile rilevare 1 μg di enterotossina 53. Per la determinazione dell’ente-rotossina STb di E. coli, è stato proposto un saggio basato sull’impiego di ansa del digiunodi ratto; con questa tecnica la risposta è risultata linearmente correlata alla dose impiegan-do ratti di 250-350 grammi, ma solo dopo aver bloccato l’attività delle proteasi endogenecon l’inibitore della tripsina di soia49.

Capitolo 12 - Saggi e metodi biologici 315

12.2.2 Il modello RITARD

Il metodo RITARD (intestinal tie-adult-rabbit diarrhea), sviluppato da Spira e colleghi44, pre-vede l’impiego di conigli di 1,6-2,7 kg di peso, tenuti a digiuno per 24 ore ma lasciati libe-ri di bere acqua. Previa anestesia locale, l’intestino cieco viene esposto e legato a livellodella giunzione ileo-cecale; si espone quindi l’intestino tenue che, mediante un nodo, vienelegato in prossimità della mesoappendice. Il materiale test, preparato in 10 mL di soluzio-ne tampone fosfato, viene iniettato nel lume del digiuno anteriore. Dopo l’iniezione, i trat-ti intestinali vengono riposti nella cavità peritoneale e l’incisione viene richiusa. L’animaleviene tenuto in un box e dopo 2-4 ore dalla somministrazione della dose test si rimuovonole legature e si rilascia il nodo scorsoio nel tratto intestinale. Se necessario, vengono appli-cati dei punti di sutura. L’animale viene rimesso in gabbia, mettendogli a disposizione ciboe acqua. Gli animali sono osservati per la comparsa di diarrea o per il decesso ogni 2 ore,fino a 124 ore dall’intervento.

Nel corso dell’autopsia, l’intestino tenue e le sezioni adiacenti vengono legati e rimossiper la misurazione del fluido accumulato. I ceppi enterotossigeni di E. coli provocano diar-rea profusa e acquosa; la suscettibilità degli animali alle infezioni di V. cholerae in questometodo è simile a quella osservata nel modello del coniglio neonato.

Il modello RITARD si caratterizza per la legatura del cieco, per evitare il passaggio difluido proveniente dall’intestino tenue, e per la temporanea ostruzione reversibile, mantenu-ta a livello dell’ileo per un tempo sufficiente per consentire al microrganismo inoculato diiniziare a colonizzare l’intestino tenue. Il metodo è stato impiegato con successo comemodello animale per le infezioni di Campylobacter jejuni 9 e per testare la virulenza di ceppidi Aeromonas 39.

12.3 Sistemi di colture cellulari

Per valutare determinate proprietà patogene delle cellule vitali, sono impiegati numerosimetodi di coltura cellulare. Le proprietà più frequentemente valutate sono l’invasività, lapermeabilità, la citotossicità, l’aderenza/adesione/capacità di legare e altre attività biologi-che più generali. Alcune colture cellulari sono impiegate per valutare diverse proprietà delletossine e delle enterotossine. Alcuni esempi di questi modelli sono riportati nella tabella 12.2e descritti brevemente di seguito.

12.3.1 Cellule di mucosa umana

Nel metodo di Ofek e Beachey35 cellule di mucosa orale umana (circa 2 ×10 5 in tamponefosfato) vengono miscelate con 0,5 mL di cellule lavate di E. coli (2 ×108 cellule/mL). Lamiscela viene incubata in agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Le cellule epite-liali vengono separate dai batteri per centrifugazione differenziale, quindi essiccate e colora-te con violetto di genziana. L’aderenza è determinata mediante conta microscopica dei bat-teri per cellula epiteliale. Thorne e colleghi47 hanno utilizzato cellule di E. coli marcate con3H-amminoacidi (alanina e leucina) o isotiocianato di fluoresceina. In un’altra applicazionecellule di V. parahaemolyticus sono state miscelate con cellule di mucosa epiteliale, incuba-te a 37 °C per 5 minuti e poi filtrate. Dopo aver allontanato mediante lavaggio le cellule nonlegate, la coltura è stata essiccata, fissata e colorata con Giemsa. L’aderenza è stata quanti-ficata contando il numero totale di cellule di V. parahaemolyticus adese a 50 cellule buccali

Microbiologia degli alimenti316

Capitolo 12 - Saggi e metodi biologici 317

Tabella 12.2 Alcuni tessuti e sistemi di coltura cellulare impiegati per studiare l’attivitàbiologica di microrganismi o loro prodotti che causano gastroenterite (dati dalla letteratura)

Sistema di coltura Patogeno/Tossina Dimostrazione/impiego

Monostrato di cellule CHO E. coli LT; tossina di V. cholerae Attività biologicaV. parahaemolyticus Attività biologica Tossina di Salmonella Attività biologica Enterotossina di C. jejuni Attività biologica

Cellule CHO flottanti Tossina di Salmonella Attività biologicaCellule HeLa E. coli Invasività

Y. enterocolitica InvasivitàV. parahaemolyticus AderenzaC. jejuni Invasività

Cellule Vero E. coli O157:H7 Recettori di tossina Shiga-likeCellule Vero Enterotossina di C. perfringens Modalità di azione

E. coli LT Attività biologia, analisiTossina di A. hydrophila CitotossicitàEnterotossina di C. perfringens Capacità di legareEnterotossina di C. perfringens Attività biologicaCitotossina di Salmonella Inibizione sintesi di proteineV. vulnificus Citotossicità

Cellule surrenali Y-1 E. coli LT Attività biologica, testTossina di V. cholerae Attività biologica, testV. mimicus Attività biologica

Cellule epiteliali Enterotossina di C. perfringens Capacità di legaredi intestino di coniglio

Citotossina di Salmonella Inibizione sintesi di proteineCellule di milza murine Enterotossine stafilococciche Capacità di legare

A, B ed EMacrofagi Y. enterocolitica FagocitosiLinfociti periferici umani Enterotossina stafil. A Effetti biologiciCarcinoma laringeo umano E. coli; Shigella InvasivitàHenle 407 intestino umano E. coli; Shigella InvasivitàHenle 407 L. monocytogenes Invasività

E. coli O157:H7 AderenzaCaco-2 V. cholerae non-O1 Aderenza

ETEC AdesioneHT29.74 C. parvum Modello di infezione

C. perfringens Mortalità cellulareMacrofagi peritoneali L. monocytogenes Sopravvivenza intracellulareFibroblasti embrionali L. monocytogenes Produzione di interleuchinamurini primariCellule intestinali fetali umane V. parahaemolyticus Aderenza

E. coli enteropatogeno AderenzaTossine di B. cereus Attività biologica

Cellule intestinali umane V. parahaemolyticus AderenzaCellule ileali umane E. coli enterotossigeno AderenzaCellule mucosali umane E. coli Aderenza

V. parahaemolyticus AderenzaCellule uroepiteliali umane E. coli AdesioneBiopsie vitali di duodeno umano E. coli AderenzaEpatociti di ratto Enterotossina di C. perfringens Trasporto di amminoacidi

Enterotossina di C. perfringens Permeabilità di membranaCellule intestinali di cavia V. parahaemolyticus AderenzaCellule HEp-2 Cereulide di B. cereus Formazione di vacuoli

(rigonfiamento mitocondriale)

LT = tossina termolabile; ETEC = E. coli enteropatogeno.

rispetto al controllo. I migliori risultati sono stati ottenuti sospendendo circa 109 cellule bat-teriche e 10 5 cellule epiteliali in tampone fosfato a pH 7,2 per 5 minuti. Tutti e 12 i ceppitestati hanno mostrato capacità di aderenza. Tale proprietà non sembra correlata con la pato-genicità di V. parahaemolyticus.

12.3.2 Intestino fetale umano

In questo modello per l’aderenza viene utilizzato un monostrato di cellule intestinali di fetoumano (HFI, human fetal intestine). Dopo lavaggio accurato, le cellule vengono inoculatecon una sospensione di V. parahaemolyticus e incubate a 37 °C fino a 30 minuti. L’aderenzaè valutata mediante esame microscopico delle cellule colorate, dopo l’allontanamento deibatteri non adesi. Tutti i ceppi di V. parahaemolyticus testati hanno mostrato aderenza, maquelli isolati da casi di intossicazione alimentare hanno mostrato una maggiore capacità ade-siva di quelli isolati dagli alimenti22. Utilizzando questo metodo si è osservato che l’aderen-za di un ceppo enteropatogeno di E. coli isolato dall’uomo era mediata da plasmidi 50.

12.3.3 Cellule intestinali umane

Per studiare l’aderenza di ceppi enterotossigeni di E. coli (ETEC), Deneke e colleghi13

hanno utilizzato un filter-binding test con cellule di ileo provenienti da individui adulti. Lecellule sono state miscelate con batteri sviluppati su terreno contenente 3H-alanina e 3H-leu-cina. L’entità del legame è stata determinata con uno scintillatore per isotopi. Rispetto ai con-trolli, i ceppi ETEC di origine umana hanno mostrato maggiore capacità di legarsi. La capa-cità di legarsi alle cellule ileali umane è risultata da 10 a 100 volte maggiore rispetto a quel-la mostrata con le cellule del cavo orale umano.

Monostrati di cellule intestinali sono stati utilizzati da Gingras e Howard 20 per studiarel’aderenza di V. parahaemolyticus. Il batterio è stato fatto crescere in presenza di valina mar-cata con 14C; le cellule marcate sono state aggiunte ai monostrati e incubate fino a 60 minu-ti. Dopo incubazione le cellule non adese sono state rimosse e quelle adese sono state deter-minate mediante conteggio della radioattività dei monostrati. Le cellule adese sono state enu-merate anche con un microscopio. I microrganismi Kanagawa-positivi e Kanagawa-negativihanno mostrato capacità di aderenza simile. Non è stata riscontrata correlazione tra produ-zione di emolisi e aderenza.

12.3.4 Cellule intestinali di porcellino d’india

Per studiare l’aderenza di V. parahaemolyticus, Iijima e colleghi25 hanno impiegato porcelli-ni d’india adulti di circa 300 grammi a digiuno da 2 giorni. Sotto anestesia, l’addome è statoaperto e l’intestino tenue legato a circa 3 cm di distanza dallo stomaco. È stato iniettato nel-l’intestino 1 mL di una sospensione contenente 2 ×10 8 cellule di ceppi adesivi e non adesivi;quindi l’addome è stato richiuso. Sei ore dopo gli animali sono stati uccisi e l’intestino tenueè stato rimosso e sezionati in quattro parti. Dopo omogeneizzazione con il 3% di NaCl, èstato determinato il numero di microrganismi presenti nell’omogenato mediante conta in pia-stra. È stato riscontrato un numero elevato di cellule aderenza-positive, soprattutto nell’omo-genato della sezione superiore dell’intestino.

Un altro modello per la valutazione dell’aderenza consiste nell’immobilizzazione sumatrici di polistirene28 delle glicoproteine solubili presenti nella mucosa intestinale del topo.Utilizzando questo modello è stato dimostrato che due ceppi di E. coli portatori di plasmidi

Microbiologia degli alimenti318

(K88 e K99) aderivano facilmente, analogamenti ad altri ceppi di questo microrganismodotati di capacità di aderenza.

12.3.5 Cellule HeLa

Questa linea cellulare è stata utilizzata per determinare sia il potenziale invasivo dei patoge-ni intestinali sia la loro aderenza. Sebbene si preferisca utilizzare cellule HeLa, possonoessere impiegate altre linee cellulari, come quelle del carcinoma laringeo umano e le Henle407 dell’intestino umano. In generale, monostrati cellulari, preparati con tecniche di colturastandard su vetrini a camera, vengono inoculati con 0,2 mL della sospensione opportunamen-te preparata di cellule da esaminare. Dopo incubazione per 3 ore a 35 °C, per consentire lacrescita batterica, il monostrato cellulare viene lavato, fissato e colorato per l’esame micro-scopico. Nel caso di E. coli invasivo, il batterio è presente nel citoplasma delle cellule delmonostrato, ma non nel nucleo. Inoltre, i ceppi invasivi sono fagocitati in misura maggiorerispetto ai non invasivi e solitamente il rapporto batteri/cellule è superiore a 5. Secondo ilBacterial Analytical Manual17, almeno lo 0,5% delle cellule HeLa dovrebbe contenere nonmeno di cinque batteri. Le risposte positive a questo test vengono generalmente confermatemediante Sereny test17.

Una variante di questo metodo viene utilizzata per Yersinia invasiva: 0,2 mL di sospen-sione batterica opportunamente preparata vengono inoculati in vetrini a camera (chamberslide) contenenti il monostrato di cellule HeLa. Dopo incubazione per 1,5 ore a 35 °C, le cel-lule vengono lavate, fissate e colorate per l’esame microscopico. Y. enterocolitica è presen-te all’interno del citoplasma, solitamente nei fagolisosomi. Il tasso di infettività è general-mente superiore al 10%. A differenza di quanto avviene per E. coli invasivo, il Sereny testnon consente di confermare la presenza di Y. enterocolitica, in quanto questo microrganismo– benché invasivo – può non rispondere al test.

Le cellule HeLa sono state usate per testare l’aderenza di V. parhaemolyticus e per studia-re la penetrazione di Y. enterocolitica; ceppi di quest’ultimo batterio che presentavano unindice infettività pari a 3,7-5,0 erano considerati in grado di penetrare le cellule umane14.L’infezione di cellule HeLa da parte di Y. enterocolitica è stata studiata usando monostraticellulari in tubi roller. L’entità dell’infezione è stata determinata contando, nell’arco di 24ore, il numero di batteri intracellulari presenti in 100 cellule HeLa selezionate casualmentedal monostrato colorato14.

12.3.6 Cellule ovariche di criceto cinese

Questo metodo, sviluppato da Guerrant e colleghi21 per le enterotossine di E. coli, impiegacellule ovariche di criceto cinese (CHO) cresciute in un mezzo contenente siero fetale divitello. Durante lo sviluppo di una coltura cellulare vengono aggiunte le enterotossine.Dopo 24-30 ore le cellule sono esaminate al microscopio per verificare se sono diventatebipolari, se hanno almeno triplicato la loro lunghezza e se hanno perso le naturali protube-ranze. Le variazioni morfologiche causate nelle cellule CHO, sia dalle tossine del colera siadalle enterotossine di E. coli, si sono manifestate parallelamente all’aumento di AMP cicli-co. È stato dimostrato che, nello studio delle enterotossine di E. coli, tale metodo è 100-10.000 volte più sensibile del test della permeabilità vascolare e dei saggi che impieganoanse ileali. Per le tossine LT di E. coli, il metodo basato sulle cellule CHO si è dimostrato5-100 volte più sensibile del test della permeabilità vascolare e dei saggi che impieganoanse ileali di coniglio 21.

Capitolo 12 - Saggi e metodi biologici 319

12.3.7 Cellule Vero

Questo monostrato cellulare consiste di una linea cellulare continua ottenuta da reni di cer-copiteco verde (Cercopithecus aethiops) ed è stato impiegato da Speirs e colleghi43 per ana-lizzare le tossine LT di E. coli.

I risultati ottenuti con questo metodo sembrano migliori di quelli ottenuti con il test dellecellule surrenali Y-1 (vedi paragrafo successivo); inoltre, tra i due, il test con cellule Vero èstato considerato più semplice ed economico da mantenere in laboratorio. Ceppi tossigenisono in grado di produrre nelle cellule Vero una risposta morfologica simile a quella indottanelle cellule Y-1. L’impiego di cellule Vero nello studio delle tossine di E. coli è discusso nelcapitolo 27.

Un saggio biologico riproducibile e molto sensibile per l’enterotossina di C. perfringens,basato sull’impiego di cellule Vero, è stato sviluppato da McDonel e McClane29. Il saggio èbasato sull’inibizione, provocata dall’enterotossina, dell’efficienza di piastramento di coltu-re di cellule Vero. Con questo metodo, che ha permesso di rilevare concentrazioni di soli 0,1ng di enterotossina, è stata ottenuta una curva dose-risposta lineare con dosi comprese tra 0,5e 5 ng (pari a 5-50 ng/mL). Gli autori di questo studio hanno proposto una nuova unità dimisura dell’attività biologica (PEU, plating efficiency unit), che corrisponde alla quantità dienterotossina in grado di inibire il 25% di 200 cellule inoculate in 100 μL di terreno.

12.3.8 Saggio con cellule surrenali (Y-1)

In questo saggio, largamente impiegato, vengono utilizzate cellule surrenali di topo (Y-1)sviluppate in monostrato con tecniche di coltura standard. Gli estratti o i filtrati del materia-le da testare vengono aggiunti alle cellule monostrato poste in pozzetti per microtitolazione,con successiva incubazione a 37 °C. Per determinare la tossina LT di E. coli, filtrati coltura-li riscaldati e non riscaldati di ceppi conosciuti come LT produttori o non produttori vengo-no aggiunti ai monostrati cellulari all’interno dei pozzetti; i risultati sono ottenuti medianteesame microscopico. La risposta è considerata positiva quando la percentuale di cellulerotonde è almeno del 50% nei monostrati addizionati di filtrato non riscaldato e non superio-re al 10% nei monostrati addizionati di filtrato riscaldati. La specificità della risposta puòessere determinata aggiungendo specifici anticorpi ai filtrati contenenti la tossina. Maggioridettagli sull’applicazione del metodo ai patogeni di origine alimentare sono presentati nelBacterial Analytical Manual17.

12.3.9 Altri saggi

Boutin e colleghi5 hanno utilizzato un metodo basato sull’immunofluorescenza, che preve-de l’impiego di legature di ileo di coniglio di circa 6 settimane, inoculate con V. parhaemo-lyticus. Dalle legature, rimosse dopo 12-18 ore dall’inoculo, sono stati ottenuti campioniistologici, puliti mediante agitazione. Per la determinazione di V. parhaemolyticus, i cam-pioni di tessuto sono stati fissati e colorati con agglutinine trattate con isotiocianato di fluo-resceina. La reazione dell’anticorpo marcato con le cellule di V. parhaemolyticus nel tessu-to è stata valutata mediante esame microscopico. Sfruttando l’immunofluorescenza, è statopossibile dimostrare la penetrazione del microrganismo all’interno della mucosa dell’ileo e,quindi, la capacità del patogeno di invadere il tessuto. Sulla base dei risultati ottenuti inquesto studio, la lamina è stata penetrata sia dalle cellule Kanagawa-positive sia da quelleKanagawa-negative.

Microbiologia degli alimenti320

La membrana corio-allantoidea di embrioni di pollo di 10 giorni è stata utilizzata per valu-tare la patogenicità di Listeria. La morte dell’embrione è stata causata entro 2-5 giorni dasole 100 cellule per uovo di L. monocytogenes; L. ivanovii è risultata letale entro 72 ore conun numero di cellule per uovo variabile da 100 a 30.000 46. Filtrati colturali di L. monocyto-genes e di L. ivanovii rilasciano lattato deidrogenasi (LDH) in monostrati di epatociti di rattodopo 3 ore di esposizione, mentre altre specie di Listeria non mostrano alcun effetto 24.

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