[Food] Microbiologia degli alimenti Volume 186 || Tecniche di coltura, di microscopia e di...

L’analisi degli alimenti condotta per determinare presenza, tipologia e numero dei microrgani-smi e/o dei loro metaboliti è di fondamentale importanza per la microbiologia degli alimenti.Ciò nonostante, nessuna delle metodiche di uso comune consente di determinare con esattez-za il numero di microrganismi presenti in un prodotto alimentare. Sebbene alcuni metodi dianalisi siano migliori di altri, tutti presentano limitazioni intrinseche associate al loro impiego.

I quattro metodi base utilizzati per determinare il numero “totale” sono i seguenti.

1. Conta convenzionale su piastra (SCP, standard plate count), o conta aerobia in piastra(APC, aerobic plate count), per la determinazione delle cellule vitali o delle unità forman-ti colonia (ufc).

2. Tecnica del numero più probabile (MPN, most probable number), metodo statistico per ladeterminazione delle cellule vitali.

3. Tecnica di riduzione del colorante, per la stima del numero di cellule vitali che possiedo-no capacità riducente.

4. Conta diretta al microscopio (DMC, direct microscopic count) per la conta delle cellulevitali e non vitali.

Nel capitolo sono descritte queste tecniche e fornite indicazioni sul loro impiego nelladeterminazione dei microrganismi a seconda del substrato di provenienza. Per le proceduredettagliate di ciascun metodo si rimanda ai riferimenti bibliografici riportati in tabella 10.1.Oltre a una descrizione dei metodi e degli sforzi per migliorarne l’efficienza complessiva,sono anche riportate alcune varianti impiegate per l’esame microbiologico delle superfici.

Capitolo 10

Tecniche di coltura, di microscopiae di campionamento

Tabella 10.1 Alcuni riferimenti bibliografici per i metodi di analisi microbiologica degli alimenti

Riferimenti bibliografici

72 12 79 73 31 80 36 89

Conta diretta al microscopio x x x x xConta in piastra convenzionale x x x x xMost probable number (MPN) x x x x xRiduzione del colorante xColiformi x x x x xFunghi x x x xAnticorpi fluorescenti x x xPiani di campionamento x x x xParassiti x

231J.M. Jay et al., Microbiologia degli alimenti© Springer-Verlag Italia 2009

10.1 Conta in piastra standard (SPC)

Con questo metodo, porzioni dei campioni alimentari vengono miscelate o omogeneizzate,per consentire l’allestimento di diluizioni seriali che sono successivamente piastrate sullasuperficie o all’interno di uno specifico terreno agarizzato; una volta effettuata la semina, lepiastre vengono incubate a temperatura appropriata per un dato periodo di tempo, trascorsoil quale tutte le colonie visibili vengono contate avvalendosi di un contatore elettronico Que-bec. Il metodo SPC è di gran lunga il più utilizzato per determinare il numero di cellule o diunità formanti colonia (ufc) nei prodotti alimentari. Quando per uno specifico prodotto sonoriportate le conte totali vitali, i valori dovrebbero essere valutati in funzione di alcuni tra iseguenti fattori.

1. Metodo di campionamento utilizzato.2. Distribuzione dei microrganismi nel campione alimentare.3. Natura della microflora dell’alimento.4. Natura della matrice alimentare.5. Storia del prodotto alimentare prima dell’esame.6. Idoneità nutrizionale del terreno di crescita utilizzato.7. Temperatura e tempo di incubazione impiegati.8. pH, aw e Eh del terreno di crescita.9. Tipo di soluzione utilizzata per le diluizioni.10. Numero relativo di microrganismi nel campione alimentare.11. Presenza di microrganismi competitivi o antagonisti.

Oltre ai limiti intrinseci già ricordati, per alcuni gruppi di microrganismi la scelta delleprocedure di piastramento risulta ulteriormente limitata dal grado di inibizione e di efficaciadegli agenti selettivi e/o differenziali impiegati.

Sebbene il più delle volte la conta su piastra venga effettuata per inclusione del campio-ne nel terreno, risultati paragonabili possono essere ottenuti mediante spatolamento superfi-ciale, che prevede l’impiego di piastre di terreno agarizzato, solidificato e asciutto in super-ficie. I campioni diluiti vengono versati sulla superficie delle piastre; quindi, con l’ausilio dispatole sterili, viene distribuito sull’intera superficie in modo uniforme e con cautela unquantitativo di inoculo pari a 0,1 mL per piastra. Il piastramento superficiale è particolar-mente utile per determinare la concentrazione nei prodotti alimentari dei microrganismi psi-crotrofi sensibili al calore, in quanto questi non vengono a contatto con l’agar liquido. Talemetodo è inoltre di scelta quando le caratteristiche delle colonie sono importanti per l’iden-tificazione del microrganismo e per la maggior parte dei terreni selettivi. Gli aerobi strettisono chiaramente avvantaggiati dalla semina superficiale, mentre i microaerofili tendono acrescere più lentamente. Tra gli svantaggi del piastramento superficiale vi sono i problemilegati alla distribuzione in superficie (in particolar modo quando questa non è stata adegua-tamente asciugata) e all’affollamento delle colonie, che rende il conteggio più difficoltoso.(Vedi oltre la tecnica di semina a spirale.)

10.1.1 Omogeneizzazione dei campioni

Prima della seconda metà degli anni Settanta, i microrganismi venivano estratti dai campio-ni di alimenti per il piastramento utilizzando quasi sempre miscelatori meccanici (tipoWaring). Intorno al 1971, in Inghilterra, Sharpe e Jackson114 hanno sviluppato il Colwell sto-

Microbiologia degli alimenti232

macher (di solito indicato semplicemente come stomacher), uno strumento ora utilizzato inmolti laboratori per omogeneizzare i campioni di alimenti da sottoporre a conta. Questodispositivo, relativamente semplice, consente di omogeneizzare il campione in sacchetti diplastica speciali grazie all’azione vigorosa esercitata da due pale. L’azione meccanica disgre-ga il campione alimentare e i microrganismi vengono rilasciati nella soluzione diluente. Incommercio sono disponibili diversi modelli, ma il modello 400 è il più ampiamente utilizza-to nei laboratori di microbiologia degli alimenti, in quanto consente di trattare volumi com-plessivi (soluzione diluente e campione alimentare) compresi tra 40 e 400 mL.

Numerosi studi hanno confrontato lo stomacher con miscelatori ad alta velocità per l’ana-lisi di alimenti. Le conte in piastra ottenute da campioni trattati con stomacher sono simili aquelle ottenute con i miscelatori. In generale lo stomacher è preferito per i seguenti motivi:

– non è necessario pulire e riporre i contenitori del miscelatore;– non si ha accumulo di calore durante le fasi operative (solitamente 2 minuti);– i campioni omogeneizzati possono essere conservati nei sacchetti dello stomacher, in con-

gelatore, per un uso successivo;– il rumore è meno fastidioso di quello dei miscelatori meccanici.

In uno studio effettuato da Sharpe e Harshman113 è stato dimostrato che, rispetto al misce-latore, lo stomacher è meno letale per Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis e Esche-richia coli. Un ricercatore ha osservato che i conteggi ottenuti con l’impiego dello stomachererano significativamente più alti rispetto a quelli ottenuti impiegando il miscelatore129, men-tre altri ricercatori hanno conseguito conteggi più elevati con il miscelatore 5. Questi ultimiricercatori, in particolare, hanno dimostrato che i risultati ottenuti con lo stomacher variano aseconda dell’alimento analizzato: il dispositivo consente risultati più attendibili per alcuni ali-menti, ma non per altri. In un’altra ricerca, le analisi di conta su piastra effettuate con stoma-cher, miscelatore e agitatore non hanno condotto a risultati significativamente differenti, seb-bene le conte relative ai Gram-negativi siano state più alte per i campioni trattati con lo sto-macher rispetto a quelle ottenute con gli altri due metodi63. Un altro vantaggio dello stoma-cher rispetto al miscelatore riguarda l’omogeneizzazione della carne effettuata prima del testdi riduzione del colorante. Holley e colleghi54 hanno dimostrato che l’estrazione dei batteridalla carne utilizzando lo stomacher non causa una distruzione rilevante dei tessuti dellacarne; di conseguenza vi è una minore quantità di composti riducenti in grado di interferirecon il test di riduzione della resazurina. Utilizzando il miscelatore, invece, la quantità di com-posti riducenti rilasciati rende i risultati del test non significativi.

Un altro dispositivo, piuttosto simile allo stomacher, è il Pulsifier, che generando unaforte turbolenza nel campione di alimento da analizzare, causa il rilascio dei microrganismi.

10.1.2 Piastratore a spirale

Il piastratore a spirale è un dispositivo meccanico che distribuisce l’inoculo liquido sullasuperficie di una piastra rotante, contenente un terreno agarizzato solidificato. Partendo daun punto vicino al centro della piastra, il braccio di distribuzione procede verso l’esternodella stessa, depositando il campione in una spirale di Archimede. Una siringa speciale erogavolumi progressivamente decrescenti di campione, in modo da creare su una singola piastradifferenze di concentrazione fino a 10.000:1. Dopo incubazione a temperatura idonea, lo svi-luppo delle colonie in corrispondenza delle cellule depositate vicino al centro rivela una den-sità maggiore, che si riduce progressivamente spostandosi verso il bordo della piastra.

Capitolo 10 - Tecniche di coltura, di microscopia e di campionamento 233

Sulle piastre così preparate, il conteggio delle colonie viene effettuato utilizzando unaparticolare griglia (figura 10.1A). A seconda della densità relativa delle colonie, vengonocontate le colonie presenti in una o più aree specifiche della griglia applicata. Una piastra diagar preparata mediante piastratore a spirale è rappresentata in figura 10.1B; in figura 10.1Csono evidenziate le corrispondenti aree della griglia su cui è stato effettuato il conteggio. Inquesto esempio sono stati depositati 0,0018 mL di campione e il numero di colonie conteg-giate nelle due aree di riferimento è stato, rispettivamente, 44 e 63, corrispondenti a unaconta totale di 6,1 × 104 batteri per millilitro.

Il piastratore a spirale qui descritto è stato ideato da Gilchrist e colleghi44, sebbene alcuniprincipi legati al suo funzionamento fossero già stati presentati da altri ricercatori, tra i qualiReyniers105 e Trotman128. Il metodo è stato studiato da numerosi ricercatori e confrontato conaltri metodi di conteggio di microrganismi vitali. Per esempio, è stato confrontato con ilmetodo di conta su piastra convenzionale nell’analisi di 201 campioni di latte crudo e pasto-rizzato, ottendendo risultati complessivamente concordanti30. Una ricerca condotta in colla-borazione da sei analisti su campioni di latte ha dimostrato che i risultati ottenuti con l’im-piego del piastratore a spirale sono comparabili con quelli ottenuti con la conta su piastraconvenzionale. La deviazione standard relativa al piastramento a spirale è stata 0,109, men-tre quella relativa al metodo convenzionale è stata 0,110 94. In un’altra ricerca il piastratore aspirale è stato confrontato con altri tre metodi (inclusione, semina di superficie e agar dro-plet): al livello di significatività del 5% non sono state rilevate differenze tra le quattro tec-niche 62. In un altro studio i conteggi ottenuti con il piastratore a spirale sono risultati altret-tanto validi di quelli ottenuti con agar droplet 51. La semina a spirale è un metodo ufficialedell’AOAC (Association of Official Analytical Chemists).


1

2

2

1

1/2

4

4

3

4aaa aaa bbbb bbcccc cc

4 33 22 11

A

4

4

4 41 1

3

bbb aaaa ccc

C

3b

Figura 10.1 Griglia per il conteggio delle colonie utilizzata nel piastramento a spirale (A); crescitadi microrganismi in una piastra dopo semina a spirale (B); aree della piastra in cui viene effettuatala conta (C). In questo esempio sono stati inoculati 0,0018 mL; il numero di colonie risultanti nelledue aree di riferimento è stato, rispettivamente, 44 e 63, con una conta totale media di 6,1 × 10 4

batteri per millilitro. (Per gentile concessione di Spiral System Instruments, Bethesda, Maryland)

B

Rispetto alla semina standard, questo metodo presenta, tra gli altri, i seguenti vantaggi:minore impiego di agar; utilizzo di un numero inferiore di piastre, diluizioni e pipette; pos-sibilità di analizzare in un’ora un numero di campioni tre o quattro volte superiore rispettoalle metodiche tradizionali 69. Possono essere preparate anche 50 o 60 piastre all’ora, e ciòrichiede un addestramento limitato62. Tra gli svantaggi del metodo vi è il rischio di ostruzio-ne della punta di erogazione, causata dall’eventuale presenza di particelle di alimento. Ancheper questo motivo, il metodo è più indicato per gli alimenti liquidi come il latte. È stato idea-to un contatore di colonie a raggio laser da utilizzare con questo dispositivo. A causa delcosto elevato, tale dispositivo non è sempre presente nei laboratori che non devono analiz-zare quotidianamente un gran numero di piastre. (Questo metodo è ulteriormente descrittonel riferimento bibliografico 36.)

10.2 Membrane filtranti

Questa tecnica prevede l’impiego di membrane con pori di dimensioni tali da trattenere i bat-teri (in genere 0,45 μm), ma da permettere il passaggio dell’acqua o della soluzione utilizza-ta per le diluizioni. Dopo raccolta dei batteri mediante filtrazione di un dato volume di cam-pione, la membrana viene posta su una piastra di agar o su un tampone assorbente imbevutodel terreno di coltura scelto e incubata in condizioni appropriate; una volta sviluppate, lecolonie vengono contate. In alternativa può essere effettuata la conta diretta al microscopio.In questo caso i microrganismi raccolti sulla membrana vengono osservati e contati al micro-scopio, dopo colorazione, lavaggio e trattamento della membrana per renderla trasparente.Queste tecniche sono particolarmente adatte per campioni contenenti un numero ridotto dibatteri. Sebbene volumi relativamente elevati di acqua possano passare attraverso una mem-brana senza intasarla, una singola membrana può essere utilizzata per filtrare solo piccolicampioni di alimenti, opportunamente omogeneizzati e diluiti.

L’efficienza globale dei metodi con membrane filtranti per la determinazione del numerodi microrganismi mediante conta diretta al microscopio è stata migliorata dall’introduzionedi coloranti fluorescenti. Questi coloranti, insieme ai microscopi a epifluorescenza, sonostati utilizzati piuttosto ampiamente dai primi anni Settanta per determinare la carica batte-rica delle acque. I filtri di cellulosa sono stati tra i primi a essere impiegati; tuttavia i filtrinucleopore in policarbonato offrono il vantaggio di trattenere tutti i batteri sulla superficiedel filtro. Analizzando le acque di lago e di oceano con entrambi i tipi di membrana, il valo-re della conta microbica ottenuto con le membrane nucleopore è risultato doppio rispetto aquello ottenuto con le membrane di cellulosa 52.

10.2.1 Conta diretta su filtro con microscopio in epifluorescenza (DEFT)

Questa tecnica di filtrazione su membrana può essere considerata una variante migliorativadel metodo di base. La DEFT (direct epifluorescent filter technique), che è basata sull’im-piego di coloranti fluorescenti e della microscopia a fluorescenza 52, è stata valutata da nume-rosi ricercatori come metodo rapido per la determinazione dei microrganismi negli alimenti.Di norma, il campione di alimento omogeneizzato e diluito viene filtrato attraverso un filtrodi nylon con porosità da 5 μm; il filtrato viene raccolto e trattato con 2 mL di Triton X-100e 0,5 mL di tripsina, che ha la funzione di lisare le cellule somatiche e prevenire l’intasamen-to dei filtri. Dopo incubazione il filtrato trattato viene fatto passare attraverso una membra-na nucleopore in policarbonato con pori di 0,6 μm; il filtro viene quindi colorato con aran-


cio di acridina. Dopo essiccamento, le cellule colorate vengono contate utilizzando il micro-scopio a epifluorescenza; il numero di cellule per grammo si calcola moltiplicando il nume-ro medio per campo per il fattore del microscopio. I risultati possono essere ottenuti in 25-30 minuti ed è possibile rilevare concentrazioni di sole 6.000 ufc/g in prodotti carnei e latte.

La DEFT è stata impiegata per il latte 97, ottenendo risultati coerenti con quelli rilevatimediante conta aerobia in piastra e metodo standard breed DMC nel latte crudo che conte-neva tra 5 × 103 e 5 × 108 batteri per millilitro. Il metodo è stato adattato per contare i batteriGram-negativi vitali e tutti i batteri Gram-positivi presenti nel latte in circa 10 minuti108. Incirca 20 minuti è stato possibile rilevare concentrazioni di soli 5.700 batteri per millilitro inlatte e prodotti derivati sottoposti a trattamento termico 98. In uno studio, condotto in colla-borazione da sei laboratori, sono state confrontate la DEFT e la conta aerobia in piastra: ilcoefficiente di correlazione era generalmente superiore a 0,9, ma rispetto all’APC la ripeti-bilità del metodo DEFT è risultata 1,5 volte minore e la riproducibilità 3 volte minore96. Glialimenti solidi possono essere esaminati mediante DEFT dopo appropriata filtrazione; in unostudio è stato possibile rilevare un numero di microrganismi < 60.000 per grammo99. LaDEFT è stata impiegata con successo per valutare la carica microbica in carne e pollame120

e sulle superfici a contatto con gli alimenti53. (Per ulteriori informazioni si consiglia la con-sultazione del riferimento bibliografico 95.)

10.2.2 DEFT per la conta di microcolonie

La DEFT consente la conta diretta delle cellule al microscopio; la microcolony-DEFT è unavariante che permette di determinare solo le cellule vitali presenti nel campione. In genere, icampioni di alimenti omogeneizzati vengono filtrati attraverso le membrane DEFT, questevengono quindi poste sulla superficie di idonei terreni colturali e incubate per consentire losviluppo delle microcolonie. Per i batteri Gram-negativi sono necessarie 3 ore di incubazio-ne, per i Gram-positivi 6 ore107. Le microcolonie che si sviluppano devono essere osservateal microscopio. In 8 ore è stato possibile rilevare concentrazioni di coliformi, Pseudomona-daceae e stafilococchi pari a sole 103 cellule per grammo107.

Un’altra variante della microscopia a epifluorescenza delle microcolonie combina ilmetodo DEFT con quello del filtro a griglia a membrana idrofobica (HGMF)106. Con questometodo il campione, che non deve essere trattato né con detergenti né con enzimi, viene fil-trato attraverso membrane nucleopore in policarbonato; le membrane vengono poi trasferitesulla superficie di un terreno agarizzato selettivo e incubate per 3 o 6 ore, a seconda che deb-bano svilupparsi batteri Gram-negativi o Gram-positivi (analogamente alla procedura segui-ta per il microcolony-DEFT). Al termine dell’incubazione, le membrane vengono coloratecon arancio di acridina e le microcolonie possono essere enumerate mediante microscopia aepifluorescenza. Se non vengono effettuati passaggi per recuperare i microrganismi danneg-giati, i risultati possono essere ottenuti in meno di 6 ore, altrimenti sono necessarie 12 ore106.

10.2.3 Filtro con membrana idrofobica reticolata

Questa tecnica (HGMF, hydrophobic grid membrane filter), inizialmente proposta da Shar-pe e Michaud118,119, è stata poi ulteriormente sviluppata e utilizzata per determinare la contamicrobica in diversi prodotti alimentari. Il metodo impiega un filtro appositamente realizza-to, costituito da un reticolo di 1600 celle posto su un singolo filtro a membrana, che limitala crescita e le dimensioni della colonia all’interno di un’unica cella. Su un filtro possonoessere contate – con il metodo del MPN (eventualmente automatizzato) – da 10 a 9 × 104 cel-


lule19. Tale tecnica consente di rilevare anche solo 10 cellule per grammo e i risultati posso-no essere ottenuti in 24 ore circa116; può essere utilizzata per determinare tutte le ufc oppuregruppi specifici, tra i quali microrganismi indicatori 8,15,33, funghi17, salmonelle 32 e Pseudo-monadaceae66. L’AOAC ne ha approvato l’impiego per la conta di coliformi totali, coliformifecali, salmonelle, lieviti e muffe. Il metodo con membrane reticolate ISO per la ricerca difunghi prevede l’impiego di uno speciale terreno per il piastramento, contenente due antibio-tici antibatterici e trypan blue, che conferisce alle colonie fungine una colorazione blu; pos-sono essere rilevate anche sole 10 ufc in 48 ore.

In una tipica applicazione, 1 mL di campione omogeneizzato diluito in rapporto 1:10viene filtrato attraverso una membrana filtrante; la membrana viene quindi posta su un ter-reno di crescita agarizzato e si procede all’incubazione per una notte per permettere la cre-scita delle colonie. Le celle che contengono le colonie vengono contate e si calcola il MPN.Il metodo consente di filtrare fino a 1 g di alimento per membrana117. Il metodo ISO conmembrana reticolata (ISO-GRID), per l’isolamento di E. coli negli alimenti, prevede l’im-piego di 39 SD agar, che si è dimostrato più versatile rispetto al LMG agar (lattosio monen-sin glucuronato), se utilizzato in associazione con MUG (4-metilumbelliferil-β-D-glucuroni-de), poiché consente di rilevare contemporaneamente E. coli O157:H7 e di E. coli β-glucu-ronidasi positivi 34. Il metodo con 39 SD agar fornisce i risultati in circa 24 ore con una sen-sibilità < 10, mentre il metodo LMG richiede circa 30 ore.

Quando confrontata con il metodo MPN a 5 tubi per coliformi, la tecnica HGMF – cheprevede una fase di rivitalizzazione dei microrganismi – ha prodotto risultati statisticamenteequivalenti, sia per i coliformi sia per i coliformi fecali19. Per l’enumerazione dei coliformifecali, i filtri HGMF sono stati posti prima su agar tripticase soia (TSA) per 4 ore a 35 °C(per rivitalizzare le cellule danneggiate) e poi trasferiti su m-FC agar e incubati nuovamen-te. È stata sviluppata una procedura HGMF, basata sul dosaggio immuno-enzimatico (ELA),per il recupero di ceppi di E. coli O157:H7 enteroemorragici (EHEC) dagli alimenti126. Talemetodo prevede l’impiego di un particolare terreno di crescita in piastra che consente aiceppi HC di svilupparsi a 44,5 °C. Il terreno speciale HC agar contiene solo lo 0,113% di salibiliari n. 3 rispetto all’usuale 0,15%. Con questo terreno è stato recuperato da carne bovinamacinata circa il 90% dei ceppi HC 124. Il metodo HGMF-ELA prevede l’impiego di HC agar,l’incubazione a 43 °C per 16 ore, il lavaggio delle colonie cresciute sulle membrane, l’espo-sizione delle membrane a una soluzione fissante e, infine, l’immersione in un complessocostituito da proteine e anticorpi coniugati con perossidasi A estratta da radice di rafano. Conquesta tecnica, le colonie ELA-positive assumono una colorazione violacea e il 95% deiceppi HC può essere recuperato entro 24 ore, con un limite di sensibilità di 10 ceppi HC pergrammo di carne.

10.3 Conta delle colonie al microscopio

I metodi per la conta delle colonie al microscopio prevedono il conteggio delle microcolonieche si sviluppano su uno strato di agar posto sui vetrini da osservazione. Il primo metodoideato è stato quello di Frost, che consisteva nella distribuzione di 0,1 mL di una miscelalatte-agar su 4 cm2 di un vetrino. Dopo incubazione, essiccamento e colorazione, le micro-colonie venivano contate con l’ausilio di un microscopio. In un altro metodo, 2 mL di agarfuso erano miscelati con 2 mL di latte tiepido, quindi 0,1 mL dell’agar inoculato venivanodistribuiti su un’area di 4 cm2. Dopo colorazione con blu tionina, il vetrino era osservato conun microscopio a campo largo con obiettivo da 16 mm 65.


10.4 Agar droplet

In questo metodo (noto anche come agar goccia), ideato da Sharpe e Kilsby115, l’alimentoomogeneizzato viene diluito in tubi contenenti agar fuso (45 °C). Per ogni campione vieneimpiegata una serie di tre tubi di agar, inoculando il primo con 1 mL di alimento omogeneiz-zato. Dopo miscelazione, con una pipetta capillare sterile (che teoricamente lascia caderegocce da 0,033 mL), si forma sul fondo di una piastra Petri vuota una linea di 5 gocce da 0,1mL di terreno inoculato con il campione. Con la stessa pipetta si prelevano tre gocce (0,1 mL)dal primo tubo e si trasferiscono nel secondo tubo; dopo miscelazione con l’agar fuso conte-nuto all’interno di quest’ultimo, si forma, accanto alla prima, un’altra linea di 5 gocce da 0,1mL. Questa serie di passaggi viene ripetuta anche per il terzo tubo. La piastra Petri contenen-te le gocce di agar viene incubata per 24 ore e le colonie successivamente enumerate conl’aiuto di un obiettivo 10 ×. Con questo metodo, i risultati ottenuti per colture pure, carni evegetali erano confrontabili con quelli ottenuti con il metodo di conta in piastra tradizionale;per la carne macinata i valori erano leggermente più elevati rispetto a quelli ottenuti dallaconta in piastra. Il metodo dell’agar droplet fornisce, dopo incubazione per 24 ore, risultaticonfrontabili con quelli ottenuti dalla conta in piastra tradizionale dopo 48 ore di incubazio-ne, ed è quindi più rapido di quest’ultima; inoltre, non è necessario allestire il bianco ed è suf-ficiente una sola piastra Petri per campione.

10.5 Film reidratabili e metodi analoghi

Le piastre pronte all’uso reidratabili, prodotte dalla 3M e note come Petrifilm, sono costitui-te da due pellicole di materiale plastico unite per un lato, ricoperte dagli ingredienti del ter-reno di coltura e da un agente gelificante solubile in acqua fredda. Sono disponibili piastrePetrifilm con terreni non selettivi, per effettuare la conta in piastra aerobia (APC), oppurecon terreni selettivi, per determinare specifici gruppi di microrganismi. Questo sistema,approvato dalla AOAC, rappresenta un’alternativa accettabile ai metodi convenzionali diconta in piastra, che fanno uso di normali piastre Petri.

Nella pratica, 1 mL di diluente viene posto tra le due pellicole e distribuito sulla superfi-cie dei nutrienti esercitando una pressione mediante un apposito dispositivo piatto. Dopoincubazione, le microcolonie appaiono rosse sul film non selettivo per la presenza di coloran-te a base di tetrazolio nella fase nutriente. Oltre che per la determinazione della conta aero-bia in piastra, sono disponibili piastre Petrifilm che consentono lo sviluppo e la conta di grup-pi specifici, tra i quali coliformi ed E. coli. Nella determinazione della conta aerobia in pia-stra di 108 campioni di latte il metodo del film reidratabile è risultato altamente correlato conil metodo di conta tradizionale e si è quindi dimostrato una valida alternativa45. Nel conteg-gio dei coliformi in 120 campioni di latte crudo il metodo VRB-Petrifilm ha fornito risultaticoerenti con quelli ottenuti con il metodo tradizionale del violet red bile agar (VRBA) e conil metodo MPN84. Per la conta di E. coli in terreno reidratabile (EC agar) è stato sviluppatoun metodo che prevede l’impiego di un substrato per la β-glucuronidasi, che consente di dif-ferenziare agevolmente E. coli dagli altri coliformi, grazie alla formazione di un alone bluattorno alle colonie. In uno studio condotto su 319 campioni alimentari, il metodo che impie-ga il terreno EC ha fornito risultati analoghi a quelli dei metodi MPN e VRBA classici 75.

Il terreno per piastre Redigel non contiene agar quale agente solidificante; per il suoimpiego, gli ingredienti presterilizzati vengono inoculati con il campione alimentare omoge-neizzato o diluito, si miscela il tutto e si attende la solidificazione che avviene dopo circa 30


minuti. Questo mezzo di crescita è particolarmente indicato per la determinazione degli psi-crotrofi: questi, infatti, non vengono esposti all’azione dell’agar fuso, che ne ridurrebbe laconcentrazione nel campione a causa della loro estrema sensibilità al calore. D’altra parte lecolonie sul terreno Redigel tendono a presentare dimensioni piuttosto ridotte. Comparandoquesto metodo con tecniche quali Petrifilm, ISO-GRID e piastratore a spirale su sette tipo-logie di alimenti diversi, sono stati ottenuti risultati statisticamente equivalenti 21.

Il metodo colturale SimPlate si basa sull’azione di diversi enzimi, comuni a un grannumero di microrganismi di interesse alimentare. Il terreno di sviluppo contiene alcuni tipidi substrati che vengono idrolizzati da tali enzimi, con conseguente rilascio di MUG (vedicapitolo 11), la cui fluorescenza si manifesta alla lunghezza d’onda della luce ultravioletta.Il metodo impiega piastre speciali munite di fori o pozzetti di incubazione, disponibili in duemisure, da 84 o da 198 pozzetti. In sostanza si tratta di un metodo MPN: a differenza deimetodi convenzionali di piastramento, non consente la caratterizzazione dell’aspetto dellecolonie. In uno studio comparativo condotto sui frutti di mare, non è stata trovata alcuna dif-ferenza tra i risultati ottenuti impiegando diversi metodi quali conta aerobia in piastra conPetrifilm, Redigel, ISO-GRID e SimPlate 26. In un’altra ricerca effettuata su 751 campionialimentari il metodo SimPlate si è dimostrato una valida alternativa ai metodi convenziona-li in piastra e a quelli che impiegano Petrifilm e Redigel16. Tuttavia, alcuni alimenti (comefegato crudo, farina di frumento e noci) danno luogo a falsi-positivi. Nella determinazionedei batteri eterotrofi presenti nell’acqua, condotta da sei laboratori diversi, è emerso che ilmetodo SimPlate e la conta in piastra standard forniscono risultati comparabili 61.

10.6 Most probable number (MPN)

In questo metodo le diluizioni dei campioni alimentari sono allestite come descritto per laconta convenzionale in piastra. Si preparano tre diluizioni seriali decimali, con le quali siseminano 9 o 15 tubi contenenti uno specifico terreno, a seconda che vengano impiegati 3 o5 tubi per ciascuna diluizione. Il numero di microrganismi nel campione di partenza è calco-lato mediante tabelle standard MPN. La determinazione è di tipo statistico e i risultati otte-nuti sono in genere più elevati rispetto a quelli del metodo tradizionale.

Questo metodo di analisi, introdotto da McCrady nel 1915, non è preciso. Infatti, quan-do viene condotto utilizzando la serie di tre tubi, con un intervallo di confidenza del 95%, ilrange dei valori è compreso tra 21 e 395. Quando si utilizza la serie di tre tubi, il 99% ditutti i risultati è rappresentato da 20 delle 62 possibili combinazioni, mentre con la serie di5 tubi il 99% di tutti i risultati è rappresentato da 49 combinazioni su 214 possibili131. In unostudio collaborativo sulla densità dei coliformi negli alimenti, il valore MPN per il test a tretubi condotto su 10 prodotti è stato di 34, mentre in un’altra fase dello studio il limite supe-riore era 60121.

Sebbene Woodward131 abbia concluso che molti valori MPN sono improbabili, questo meto-do di analisi è diventato molto popolare. Tra i vantaggi che esso offre, vi sono i seguenti:

1. è relativamente semplice;2. vi è maggiore probabilità, rispetto al metodo di conta in piastra convenzionale, che i risul-

tati ottenuti da laboratori diversi siano concordanti;3. utilizzando appropriati terreni selettivi e differenziali, il metodo consente la determinazio-

ne di specifici gruppi di microrganismi;4. è il metodo di scelta per determinare la concentrazione dei coliformi fecali.


Tra gli svantaggi del metodo, si ricordano: il non poter osservare la morfologia delle colo-nie, la scarsa precisione e la grande quantità di vetreria necessaria (soprattutto quando vienecondotto con la serie di cinque tubi).

TEMPO è un metodo basato sul MPN che utilizza una scheda di conteggio associata a unospecifico terreno, che consente la rilevazione rapida mediante fluorescenza di microrganismitarget; i risultati possono essere ottenuti entro 24 ore. Questo metodo non richiede diluizio-ni seriali.

10.7 Metodi basati sulla riduzione del colorante

I coloranti comunemente impiegati in questa procedura per la stima del numero di microrga-nismi vitali in determinati prodotti sono il blu di metilene e la resazurina. Per effettuare iltest di riduzione del colorante, i surnatanti adeguatamente preparati dei campioni alimentarivengono addizionati a soluzioni standard impiegate sia per la riduzione del blu di metilene,che passa dalla colorazione blu a quella bianca, sia per la riduzione della resazurina, che virada una colorazione iniziale blu ardesia a rosa o bianco. Il tempo richiesto per la riduzione delcolorante è inversamente proporzionale al numero di microrganismi presenti nel campione.

La riduzione del blu di metilene e della resazurina è stata studiata nel latte: con due ecce-zioni, su 100 colture è stata osservata una buona corrispondenza tra il numero di batteri e iltempo necessario per la riduzione dei due coloranti43. In uno studio sull’impiego del test diriduzione della resazurina, come metodo rapido per valutare il deterioramento della carnemacinata, la perdita di colore del colorante, il punteggio relativo all’odore e la conta su pia-stra sono risultati significativamente correlati111. Uno dei problemi associati alla riduzionedel colorante in particolari alimenti è l’intrinseca presenza di sostanze riducenti. Austin eThomas 9 hanno osservato che nelle carni crude la riduzione della resazurina è meno utile chenelle carni cotte. Circa 600 campioni di carni cotte sono stati esaminati con successo median-te riduzione della resazurina aggiungendo 20 mL di una soluzione allo 0,0001% di resazuri-na a 100 g di carne affettata contenuta in una busta di plastica. Un altro modo per evitare chele sostanze contenute nelle carni fresche influenzino i risultati del test di riduzione del colo-rante è omogeneizzare il campione con lo stomacher, piuttosto che con il miscelatore Waring.Gli omogeneizzati di carne cruda ottenuti utilizzando lo stomacher hanno dato risultati sod-disfacenti al test di riduzione della resazurina, quando sono stati addizionati a una soluzionedi resazurina al 10% in latte scremato54. Gli omogeneizzati ottenuti mediante stomacher con-tenevano una minore quantità di tessuti lesionati e, di conseguenza, una più bassa concentra-zione di composti riducenti. Il metodo elaborato da Holley e colleghi54 è stato ulteriormentevalutato da Dodsworth e Kempton29; questi hanno osservato che la carne cruda con valori diconta in piastra superiori a 107 batteri per grammo poteva essere individuata in 2 ore. Quan-do è stata comparata con nitro blu di tetrazolio (NT) e indofenil nitrofenil tetrazolio (INT),la resazurina ha fornito risultati più rapidi104. Con i campioni di superficie provenienti da car-casse di pecora la resazurina è stata ridotta in 30 minuti da 18.000 ufc/m2, NT in 600 minu-ti da 21.000 ufc/m2 e INT in 660 minuti da 18.000 ufc/m2 108. La riduzione del blu di metile-ne è stata confrontata con la conta aerobia in piastra su 389 campioni di piselli congelati: irisultati erano linearmente correlati nell’intervallo di conta aerobia compreso tra 2 e 6 log10

unità formanti colonie. I tempi medi di decolorazione sono stati, rispettivamente, di 8 e 11ore per concentrazioni di 105 e 104 ufc/g.

I test di riduzione del colorante sono impiegati, ormai da moltissimo tempo, nell’industrialattiero-casearia per valutare la qualità microbiologica complessiva del latte crudo. Sempli-


cità, rapidità e bassi costi sono i punti di forza di questo metodo; inoltre, solamente le cellu-le vitali riducono attivamente il colorante. D’altra parte, va sottolineato che non tutti imicrorganismi riducono il colorante allo stesso modo e che il metodo non è applicabile aicampioni alimentari che contengono enzimi di riduzione, a meno che non si ricorra a parti-colari trattamenti. (L’impiego di substrati modificati con composti fluorogeni e cromogeni inmicrobiologia degli alimenti è discusso nel capitolo 11.)

10.8 Roll tubes (provette in rotazione)

Questo metodo si basa sull’impiego di appositi tubi con tappo a vite. Volumi predeterminatidi agar fuso e inoculato vengono aggiunti e lasciati solidificare nel tubo mantenuto in rota-zione, in modo da formare sulla superficie interna uno strato sottile. Dopo adeguata incuba-zione, le colonie vengono contate osservando il tubo in trasparenza. Attuato in assenza diossigeno, questo metodo si è dimostrato eccellente per il conteggio dei microrganismi anae-robi più esigenti. (Per una revisione del metodo si consiglia il lavoro di Anderson e Fung3.)

10.9 Conta diretta al microscopio (DMC)

Nella forma più semplice della tecnica DMC i campioni di alimenti o le colture vengono stri-sciati su un vetrino e colorati con un appropriato colorante; l’osservazione e la conta dellecellule vengono effettuate con l’aiuto di un microscopio (mediante immersione dell’obietti-vo in olio). Questi metodi sono i più ampiamente utilizzati nell’industria lattiero-casearia pervalutare la qualità microbiologica del latte crudo e di prodotti derivati dal latte; nello speci-fico, il metodo impiegato è quello originariamente sviluppato da R.S. Breed (conta Breed).In sintesi, il metodo consiste nel distribuire 0,01 mL di un campione su 1 cm2 di superficiedi un vetrino da microscopio; dopo fissazione, sgrassamento e colorazione del campione, imicrorganismi o gli aggregati di microrganismi vengono contati per mezzo di un microsco-pio calibrato (per ulteriori dettagli, vedi il riferimento 73). Il metodo si è dimostrato adattoper l’esame microbiologico rapido di altri prodotti, come alimenti essiccati o surgelati.

Tra i vantaggi offerti dal metodo DMC vi sono, oltre alla semplicità e alla rapidità, la pos-sibilità di valutare la morfologia delle cellule e di impiegare sonde fluorescenti per aumenta-re l’efficienza. Tra gli svantaggi, i principali sono: la conduzione dell’analisi risulta piuttostofaticosa (come tutti i metodi microscopici); vengono contate sia le cellule vitali sia quelle nonvitali; le particelle di alimento non sono sempre distinguibili dai microrganismi; le cellulemicrobiche non sono uniformemente distribuite, quindi alcune non assorbono bene il colo-rante e non possono essere contate; i conteggi ottenuti risultano invariabilmente più alti diquelli della conta in piastra convenzionale. Nonostante questa serie di svantaggi, il metodoDMC è il più rapido per stimare le cellule microbiche presenti in un prodotto alimentare.

Un metodo di osservazione su vetrino, messo a punto per individuare ed enumerare le cel-lule vitali11, utilizza il sale di tetrazolio (p-iodofenil-3-p-nitrofenil)-5-fenil tetrazolio cloruro(INT). Le cellule vengono esposte a INT filtrato e sterilizzato per 10 minuti, a 37 °C a bagno-maria; quindi si filtra attraverso una membrana speciale con porosità di 0,45 μm. Dopo essic-camento per 10 minuti a 50 °C, la membrana viene preparata su un vetrino con olio di semidi cotone, coperta con un coprioggetto e osservata. Il metodo si è dimostrato adatto per col-ture pure di lieviti e batteri, ma utilizzato per il latte ha fornito sottostime, rispetto ai valoridi APC, di 1-1,5 unità logaritmiche. Impiegando il microscopio a fluorescenza e il coloran-


te Viablue (fluorocromo modificato del blu di anilina), è possibile distinguere le cellule dilievito vitali da quelle morte 60,67. Le cellule vitali possono essere determinate con il metododella conta diretta con arancio acridina (AODC, acridine orange direct count), che in sinte-si prevede: colorazione con arancio acridina (0,01%), seguita da microscopia a epifluore-scenza e conteggio delle cellule di colore arancio fluorescente.

10.9.1 Conta delle muffe con il metodo di Howard

Questo metodo, basato sull’osservazione di vetrini al microscopio, fu ideato da B.J. Howardnel 1911 per monitorare i prodotti derivati dal pomodoro. Il metodo richiede l’impiego di unacamera (vetrino) apposita per il conteggio del micelio fungino e non è applicabile ai prodot-ti derivati dal pomodoro che sono stati sminuzzati. Un metodo simile a quello di Howard perla conta delle muffe – e anch’esso descritto dalla AOAC 89 – è utilizzato per quantificareGeotrichum candidum in frutti e bevande conservati in scatola. Su campioni di concentratodi pomodoro, autoclavato e non autoclavato, il DEFT si è dimostrato positivamente correla-to con il metodo di conta delle muffe; per tale motivo può essere utilizzato in alternativa allaconta delle muffe di Howard 100.

10.10 Esame microbiologico delle superfici

La necessità di mantenere le superfici a contatto con gli alimenti in corrette condizioni igie-niche è evidente. Il problema principale che deve essere risolto quando si effettua l’esamemicrobiologico delle superfici e degli utensili è rappresentato dal prelievo di una percentua-le significativa della microflora presente. Anche se un determinato metodo non è in grado direcuperare tutti i microrganismi, il suo impiego sistematico in aree specifiche di uno stabili-mento di trasformazione degli alimenti può fornire informazioni utili, purché si tenga contodel fatto che non tutti i microrganismi vengono recuperati. Nei paragrafi seguenti sono pre-sentati i metodi più frequentemente impiegati per la valutazione delle superfici nelle indu-strie alimentari.

10.10.1 Metodi tampone / tampone-risciacquo

Il prelievo mediante tamponi è il metodo più antico e anche più largamente impiegato perl’esame microbiologico delle superfici, non solo nelle industrie alimentari ma anche negliospedali e nei ristoranti. Il metodo tampone-risciacquo – sviluppato da W.A. Manheimer e T.Ybanez – impiega tamponi sia di cotone sia di alginato di calcio. Per analizzare un’areadeterminata di una certa superficie, possono essere preparate sagome di misure corrispon-denti alle dimensioni dell’area da esaminare, per esempio di 1 cm2. La sagoma sterile vieneapplicata sulla superficie e l’area delimitata viene strofinata accuratamente con un tamponeinumidito. Il tampone viene quindi reinserito all’interno della provetta, contenente un appro-priato diluente, e conservato in frigorifero fino al piastramento. All’occorrenza, il diluentepuò contenere anche una sostanza neutralizzante. Quando si impiegano tamponi di cotone, ènecessario rimuovere i microrganismi dalle fibre, mentre nel caso di tamponi di alginato dicalcio i microrganismi vengono rilasciati nella soluzione diluente, in seguito alla dissoluzio-ne dell’alginato mediante esametafosfato di sodio. I microrganismi contenuti nel diluentevengono successivamente enumerati con un metodo idoneo, come la conta in piastra tradi-zionale, ma per determinare specifici gruppi di microrganismi è possibile utilizzare appro-


priati terreni selettivi. Secondo un innovativo metodo tampone-risciacquo, proposto da Kol-ler 68, 1,5 mL di fluido vengono versati su una superficie piana e tamponati per 15 secondi suun’area di 3 cm2; volumi di 0,1 e 0,5 mL di fluido sono quindi prelevati mediante micropi-pette e piastrati in superficie o per inclusione utilizzando un terreno per la conta in piastraconvenzionale o terreni selettivi.

Per quanto riguarda l’efficacia relativa dei tamponi di cotone e di alginato di calcio, lamaggior parte dei ricercatori concorda nel ritenere che il secondo metodo consente di racco-gliere un numero superiore di microrganismi. Mediante tamponi, alcuni ricercatori hannorecuperato appena il 10% dei microrganismi dalle carcasse bovine 87, il 47% di spore diBacillus subtilis dalle superfici in acciaio inossidabile 7 e fino al 79% dalla superficie dellecarni 22,93. I risultati ottenuti dai tamponi effettuati sulle carcasse di carne bovina sono risul-tati mediamente 100 volte più alti rispetto a quelli forniti dal metodo della piastra a contattoe la deviazione è stata considerevolmente più bassa87. In quest’ultimo caso i ricercatorihanno constatato che il metodo del tampone è il più adatto per superfici flessibili, irregolarie fortemente contaminate. La facilità con cui i microrganismi vengono asportati dalla super-ficie dipende dalla struttura della superficie stessa e dalla natura e tipologia della flora micro-bica presente. Nonostante i suoi limiti, il metodo del tampone-risciacquo resta comunque unsistema rapido, semplice ed economico per valutare la popolazione microbica delle superfi-ci degli alimenti e degli utensili.

Il test basato sulla misura dell’ATP, per determinare la presenza di cellule entro 2-5 minutidal prelievo, consente l’impiego in linea del metodo con tampone. Sebbene in questa applica-zione il test basato sull’ATP non sia specifico per i batteri, esso fornisce informazioni utili sullacontaminazione delle superfici e può essere impiegato per valutazioni rapide dell’efficaciadelle procedure di sanificazione. (I fondamenti di questa tecnica sono riportati nel capitolo 11.)

10.10.2 Metodo della piastra a contatto diretto

Il metodo a contatto diretto (RODAC, replicate organism direct agar contact) impiega par-ticolari piastre Petri, nelle quali vengono versati volumi di 15,5-16,5 mL di un appropriatoterreno agarizzato, con il risultato che lo spessore del terreno è maggiore rispetto alla norma.Capovolgendo la piastra, l’agar solido viene portato a contatto diretto con la superficie daesaminare. Questa metodica è stata elaborata da Gunderson e Gunderson nel 1945 e ulterior-mente sviluppata da Hall e Hartnett nel 1964. Quando le superfici da esaminare sono statepulite con taluni detergenti, occorre includere nel terreno una sostanza neutralizzante (peresempio lecitina, Tween 80 ecc.). Una volta esposte, le piastre vengono coperte e incubate;successivamente vengono contate le colonie.

Tra gli svantaggi principali di questo metodo vi sono la completa copertura della superfi-cie della piastra di agar da parte delle colonie e la sua inefficacia nel caso di superfici forte-mente contaminate. Questi limiti possono essere minimizzati utilizzando piastre con super-fici perfettamente asciutte e contenenti terreni selettivi28. Il metodo RODAC è di scelta quan-do le superfici da esaminare sono lisce, solide e non porose 7,87. Sebbene la procedura non siaadatta per le superfici fortemente contaminate, è stato stimato che per rilevare la contamina-zione su una superficie – sia con il metodo della piastra a contatto sia con quello del tampo-ne – la soluzione contaminante deve contenere almeno 10 cellule per millilitro 87. Gli autoridi quest’ultima hanno osservato, inoltre, che il metodo della piastra a contatto diretto è ingrado di asportare solo lo 0,1% circa della popolazione microbica presente in superficie: ciòsignifica che se con questo metodo vengono rilevate 10 ufc/cm2, il numero di microrganismirealmente presenti sulla superficie esaminata sarà di circa10 4 ufc/cm2. Quando superfici di


acciaio inossidabile sono state contaminate da endospore di B. subtilis, con il metodoRODAC è stato rilevato il 41% delle spore e con la tecnica del tampone il 47% 7. In un’altraricerca quest’ultimo metodo si è dimostrato migliore rispetto a quello della piastra a contat-to quando il grado di contaminazione era di 100 o più microrganismi per 21-25 cm2 112. D’al-tra parte, il metodo della piastra a contatto fornisce migliori risultati a basse concentrazionidi contaminanti. Nella determinazione del grado di contaminazione delle superfici, i duemetodi risultano ben correlati.

10.10.3 Metodi agar siringa/agar sausage

Il metodo agar siringa è stato proposto da W. Litsky nel 1955 e successivamente modificato6.In questa tecnica si impiega una siringa privata dell’estremità inferiore per creare un cilindrocavo, che viene riempito con agar. Uno strato di agar viene spinto direttamente a contatto conla superficie da analizzare mediante lo stantuffo della siringa. Tale strato viene quindi taglia-to e posto su una piastra Petri; dopo incubazione si procede con la conta delle colonie. Ilmetodo “agar sausage” (noto anche come “agar salsiccia”), proposto da L. ten Cate125, è simi-le al precedente ma impiega tubi di plastica anziché siringhe modificate; è stato ampiamenteutilizzato in Europa per valutare la contaminazione delle carcasse e delle superfici degliimpianti per la lavorazione degli alimenti. Entrambi i metodi sono considerati varianti delRODAC e presentano gli stessi svantaggi legati alla copertura delle piastre da parte dellecolonie e alla loro limitata applicabilità ai campioni con basso livello di contaminazionesuperficiale. Poiché aggregati o catene di microrganismi presenti sulle superfici possono dareluogo a singole colonie, le conte ottenute con questi metodi sono più basse rispetto a quellerisultanti dai metodi che consentono la separazione delle catene e degli aggregati.

Per l’esame delle carcasse delle carni, Nortje e colleghi88 hanno confrontato tre metodi:doppio tampone, asportazione e agar salsiccia. Il metodo dell’asportazione del campione èrisultato il più affidabile; il metodo dell’agar sausage modificato ha presentato una correlazio-ne con quello dell’asportazione maggiore rispetto al doppio tampone. Il metodo dell’agar sau-sage è raccomandato dai ricercatori per la sua semplicità, velocità e accuratezza.

10.10.4 Altri metodi per l’analisi delle superfici

Analisi diretta della superficieDiversi ricercatori hanno impiegato metodi di piastramento diretto delle superfici, nei qualiagar fuso viene versato sulla superficie o sull’utensile da analizzare. Dopo solidificazione laforma di agar viene posta in una piastra Petri e successivamente incubata. Angelotti e Foter 6

hanno proposto l’utilizzo di questa tecnica come metodo di riferimento per la determinazio-ne della contaminazione superficiale, poiché è eccellente per l’enumerazione dei microrga-nismi vitali contenuti nei particolati 35. Il metodo è stato applicato con successo per determi-nare la sopravvivenza delle endospore di Clostridium sporogenes sulle superfici in acciaioinossidabile 83. Nonostante sia considerato un’efficace strumento di ricerca, il metodo non sipresta all’impiego in analisi di routine negli stabilimenti alimentari.

Film adesiviIl metodo dei film adesivi di Thomas è stato utilizzato con un certo successo da Mossel e col-leghi82. Viene condotto premendo un film o un nastro adesivo contro la superficie del campio-ne, la superficie esposta del film viene successivamente premuta su una piastra contenente ter-reno solido. Questo metodo è risultato meno efficace rispetto a quello del tampone nel recu-


pero della popolazione batterica presente su superfici di legno82. Un metodo basato sull’im-piego di nastro adesivo è stato impiegato con successo nella determinazione dei microrgani-smi sulla superficie delle carni41. In un recente studio condotto su carcasse di maiale sono statimessi a confronto i metodi tampone, RODAC e nastro adesivo (Mylar); la correlazione traRODAC e quello con nastro adesivo è risultata migliore rispetto alla correlazione tra tampo-ne e nastro adesivo o tra tampone e RODAC 25. Tamponi con supporti di plastica contenentiterreno di coltura sono stati usati per monitorare i microrganismi nelle bottiglie 27.

Metodo tampone/agar slantIl metodo tampone/agar slant, descritto nel 1962 da N-H. Hansen e utilizzato con buoni risul-tati da alcuni ricercatori europei, consiste nel prelievo del campione per mezzo di tamponi dicotone, che vengono direttamente trasferiti su provette inclinate (slant). Dopo essere stateincubate, le provette vengono suddivise in due gruppi di unità logaritmiche, a seconda delnumero di colonie sviluppatesi. Il numero medio di colonie è determinato osservando la distri-buzione dei risultati su una tabella delle probabilità. Un metodo che può essere consideratosimile al precedente è quello tampone/piastra, proposto da Ølgaard 90. Per eseguire tale tecni-ca è necessario individuare e delimitare la superficie da campionare mediante una mascheri-na sterile e strofinare roteando la punta del tampone sulla superficie; per l’interpretazione deidati è necessario rifarsi a standard di riferimento presenti in letteratura.

Dispositivi a ultrasuoniQuesti dispositivi possono essere utilizzati per determinare la contaminazione microbicasuperficiale; le superfici da esaminare devono però essere di piccole dimensioni e asportabi-li, per poter essere poste all’interno di un contenitore immerso nel diluente. Una volta collo-cato il contenitore nell’apparecchio a ultrasuoni, l’energia generata provoca il rilascio deimicrorganismi nella soluzione diluente. Un possibile impiego più pratico degli ultrasuoni èla rimozione dei batteri dai tamponi di cotone utilizzati nel metodo tampone-risciacquo102.

Spray gunIl metodo “spray gun”, ideato da Clark 22,23, è basato sull’azione di un getto di soluzione dilavaggio su una superficie circoscritta; la soluzione recuperata viene successivamente semi-nata in piastra. Sebbene l’apparecchiatura sia portatile, è necessario un generatore di ariacompressa. Nel recupero dei batteri dalle superfici delle carni tale metodo si è dimostrato piùefficace di quello con tampone.

10.11 Microrganismi metabolicamente danneggiati

Quando i microrganismi sono soggetti a stress ambientali, quali riscaldamento e congela-mento subletali, molte cellule riportano un danno metabolico che si traduce nell’incapacitàdi formare colonie su terreni selettivi, tollerati dalle cellule non danneggiate. La presenza dieventuali danni metabolici in una coltura può essere determinata piastrando aliquote separa-te su un terreno non selettivo e su un terreno selettivo e contando le colonie che si sono svi-luppate dopo un adeguato periodo di incubazione. Le colonie sviluppate sul terreno nonselettivo derivano sia dalle cellule danneggiate sia da quelle non danneggiate, mentre sul ter-reno selettivo si sviluppano solo le cellule non danneggiate. La differenza tra il numero dicolonie riscontrate sui due terreni è la misura del numero di cellule danneggiate presentinella coltura o nella popolazione originarie. Questo principio è illustrato nella figura 10.2,


ricavata da dati dello studio di Tomlins e colleghi127 sul danno subletale da calore in S.aureus. In questa ricerca il microrganismo è stato sottoposto a una temperatura di 52 °C perun tempo di 15 minuti in tampone fosfato a pH 7,2, allo scopo di danneggiare le cellule. Lasemina in piastra al tempo zero e dopo 15 minuti di trattamento termico, in un terreno nonselettivo, come TSA (trypticase soy agar) e selettivo, come TSAS (stress medium: TSA +7,0% di NaCl), ha evidenziato sul terreno TSA solo una leggera riduzione del numero di cel-lule, mentre sul terreno TSAS i valori sono risultati considerevolmente ridotti, indicando undanno di grado elevato rispetto alla capacità di sopportare concentrazioni saline normalmen-te tollerate dalle cellule non danneggiate. Per consentire il recupero della loro funzionalità,le cellule danneggiate dal trattamento termico sono state poste in nutrient broth (terreno direcupero) e successivamente incubate alla temperatura di 37 °C per 4 ore. Piastrando su


9

A B

8

7

6

3 40 105 0 1 2

TempoMinuti Ore

Nu

mer

o/m

L (lo

g)

Figura 10.2 Curva di sopravvivenza e recupero di S. aureus MF-31. (A) Danno riportato in seguito aesposizione a 52 °C per 15 minuti in una soluzione tampone di fosfato di potassio 100 mM. (B) Recu-pero delle cellule danneggiate dall’esposizione al calore in nutrient broth (NB) a 37 °C. Simboli: (�)campioni seminati in piastra su TSA per la conta vitale totale; (�) campioni seminati in piastra su TSASper la stima della popolazione microbica danneggiata: recupero delle cellule in NB contenente 100μg/mL di cloramfenicolo; (�) campioni seminati in piastra su TSAS. (Da Tomlins et al.127, CanadianJournal of Microbiology 17: 759-765, 1971, National Research Council of Canada, con autorizzazione)

TSAS aliquote derivanti dal terreno di recupero dopo ogni ora di incubazione, si può osser-vare che le cellule danneggiate riacquistano la capacità di resistere a concentrazioni del 7%di NaCl dopo 4 ore di incubazione.

La presenza di cellule metabolicamente danneggiate negli alimenti e la loro capacità direcupero durante la coltivazione è di fondamentale importanza, in relazione sia ai microrga-nismi patogeni sia a quelli alteranti. I dati riportati suggeriscono che, se per individuare lapresenza di S. aureus in prodotti pastorizzati con trattamento termico venisse utilizzato unmezzo a elevata concentrazione salina, il numero di cellule vitali rinvenute risulterebbe dicirca 3 unità logaritmiche inferiore a quello reale. Numerosi studi hanno dimostrato che ildanneggiamento dei microrganismi presenti negli alimenti non è indotto solo dal riscalda-mento e dal congelamento subletali, ma anche da trattamenti di liofilizzazione, essiccamen-to, irradiazione, aerosolizzazione, colorazione, come pure dalla presenza negli alimenti disodio azide, sali, metalli pesanti, antibiotici, oli essenziali e altre sostanze chimiche comeacido etilendiamminotetracetico (EDTA) e disinfettanti.

Il riconoscimento degli stress subletali nei microrganismi di interesse alimentare e lo stu-dio della loro influenza sulla crescita microbica in diverse condizioni risale agli anni attornoal 1900; tuttavia la comprensione completa di questo fenomeno è stata conseguita solo allafine degli anni Sessanta. All’inizio dello stesso decennio si osservò che un’iniziale rapidadiminuzione del numero dei microrganismi metabolicamente danneggiati era seguita da unrecupero limitato durante il processo di riparazione (“Phoenix phenomenon”). Nel 1943 Nel-son85 constatò che i batteri sottoposti a trattamento termico presentavano maggiori richiestenutrizionali. (Nelson condusse anche una rassegna dei precedenti lavori di altri ricercatori.)Gunderson e Rose46 osservarono che il numero di coliformi isolati da prodotti a base di pollosurgelati, in grado di crescere su VRBA, diminuiva progressivamente all’aumentare deltempo di conservazione dei prodotti. Hartsell 50 inoculò salmonelle in alcuni alimenti, conge-lò gli alimenti inoculati e, quindi, studiò il destino dei microrganismi in essi presenti duran-te la conservazione. Su terreni altamente nutritivi e non selettivi è stato possibile recuperareun numero di microrganismi maggiore rispetto a quello recuperato su terreni selettivi qualiMacConkey, desossicolato o VRBA. L’importanza del terreno di isolamento nel recuperodelle cellule stressate è stata sottolineata anche da Postgate e Hunter101 e da Harris 48. Oltre amaggiori esigenze nutrizionali, i microrganismi di interesse alimentare soggetti a stressambientali manifestano il danno subito con l’aumento della lag fase e della sensibilità neiconfronti di vari agenti contenuti nei terreni selettivi, con il danneggiamento delle membra-ne cellulari e degli enzimi del ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA), con la rottura dei ribo-somi e il danneggiamento del DNA. Sebbene il danno da calore subletale sembri interessarein modo specifico ribosomi e membrane cellulari, non tutti gli agenti nocivi producono danniidentificabili.

10.11.1 Recupero / “riparazione”

Le cellule metabolicamente danneggiate, per lo meno quelle di S. aureus, possono riprende-re la propria funzionalità se poste in terreno di recupero (no-growth medium)59 alla tempe-ratura di 15 °C, ma non a 10 °C 42. In alcuni casi il processo di recupero non è immediato,poiché è stato dimostrato che non tutti i coliformi stressati hanno la capacità di recuperarenella stessa misura e che il processo avviene gradualmente 76. Non tutte le cellule della popo-lazione riportano un danno della stessa entità. Hurst e colleghi56 hanno osservato che le cel-lule di S. aureus gravemente danneggiate dalla disidratazione non erano in grado di svilup-parsi in un terreno di recupero non selettivo (TSA), ma recuperavano aggiungendo allo stes-


so terreno piruvato. È stato inoltre dimostrato che le cellule di S. aureus sottoposte a tratta-mento termico subletale possono recuperare la loro tolleranza a NaCl prima del ripristino dialcune funzioni della membrana 58. È assodato che la riparazione del danno non richiede lapresenza della parete cellulare e la sintesi proteica. Nella figura 10.2 si può osservare che lapresenza di cloramfenicolo nel terreno di recupero di S. aureus non influenza la riparazionedel danno causato da un trattamento termico subletale. Nel caso di danni provocati da altetemperature, congelamento, essiccamento e irradiazione la riparazione dei ribosomi cellula-ri e della membrana sembra fondamentale per il recupero.

La protezione delle cellule dai danni causati dal calore e dal congelamento è favorita dai ter-reni complessi e brodi o da specifici componenti in essi presenti. Il latte fornisce una maggio-re protezione rispetto alle soluzioni saline o alle miscele di amminoacidi81, e i componenti inesso presenti che sembrano avere un ruolo principale sono il fosfato, il lattosio e la caseina. Ilsaccarosio avrebbe un’azione protettiva contro i danni provocati dal calore2,70, mentre il gluco-sio ridurrebbe la protezione contro il calore in S. aureus 81. È stato osservato che gli zuccheri ei polioli non metabolizzabili, quali arabinosio, xilosio e sorbitolo proteggono S. aureus daidanni provocati dal calore subletale, ma il meccanismo di tale azione non è chiaro122.

Busta20 ha esaminato le conseguenze del mancato impiego di una fase di recupero. Il ter-reno trypticase soy broth (TSB), associato a un periodo di incubazione compreso tra 1 e 24ore a temperature variabili da 20 a 37 °C, è ampiamente utilizzato per diversi microrganismi.La conta di ceppi di S. aureus danneggiati da riscaldamento subletale è stata studiata in diver-si terreni di coltura 14,37,56; in uno di questi studi è stata comparata la capacità di sette terreniper stafilococchi di recuperare 19 ceppi di S. aureus danneggiati da riscaldamento subletale:il mezzo Baird-Parker è risultato nettamente il migliore tra quelli esaminati, incluso il TSAnon selettivo. Sulla base di risultati analoghi ottenuti da altri ricercatori, questo terreno è statoadottato nei metodi ufficiali della AOAC per la determinazione diretta di S. aureus in alimen-ti contenenti ≥10 cellule per grammo. La maggiore efficacia del terreno Baird-Parker è dovu-ta al suo contenuto in piruvato; è stato suggerito l’impiego di questo mezzo di crescita dopoil recupero in un terreno non selettivo contenente antibiotici 56. Sebbene questo approcciopossa essere adatto per recuperare S. aureus, alcuni problemi potrebbero derivare dal largoimpiego di antibiotici nei mezzi di recupero per prevenire lo sviluppo cellulare. È stato dimo-strato che le spore di C. perfringens danneggiate da trattamento termico sono più sensibilialla polimixina e alla neomicina10 ed è appurato che gli antibiotici che influenzano la sintesidella parete cellulare determinano varianti di forme L in molti batteri.

Il piruvato è noto per l’azione riparatrice nei confronti delle cellule danneggiate, non solo diS. aureus, ma anche di altri microrganismi, come E. coli; la sua presenza nei terreni consentedi ottenere conte più elevate dopo danno cellulare provocato da diversi tipi di agenti. Quandoaggiunto a TSB contenente il 10% di NaCl, si è sviluppato un numero più elevato di S. aureus,sia stressati sia non stressati14; inoltre, cellule di E. coli danneggiate dal calore o dal congela-mento hanno mostrato un recupero significativamente migliore con l’aggiunta di piruvato77.

Un altro agente che favorisce il recupero dei microrganismi aerobi danneggiati è la catala-si. L’azione di questo enzima, osservata per la prima volta da Martin e colleghi74, è stata con-fermata da molti altri ricercatori. La catalasi è efficace per le cellule danneggiate da tratta-mento termico subletale di S. aureus, Pseudomonas fluorescens, Salmonella Typhimurium edE. coli 74; inoltre favorisce la ripresa di S. aureus in presenza del 10% di NaCl14 e dopo stresscausato da mancanza di acqua37. Un’altra sostanza che presenta la stessa efficacia del piruva-to per le cellule di E. coli danneggiate dal calore è l’acido 3,3′- tiodipropionico77.

Il danno da radiazioni riportato dalle spore di C. botulinum di tipo E dopo esposizione a4 kGy si manifesta con l’incapacità di crescere a 10 °C in presenza di polimixina e neomici-


na110. È stato osservato che le cellule danneggiate riportano un danno al sistema di post ger-minazione e formano filamenti asettati durante la crescita, mentre il sistema di germinazio-ne non risulta compromesso. Il danno provocato dalle radiazioni è stato riparato in circa 15ore a 30 °C su agar tellurite polymyxin egg yolk (TPEY), privo di antibiotici. Quando lespore di C. botulinum vengono danneggiate da ipoclorito, i siti di germinazione della L-ala-nina risultano alterati e occorrono concentrazioni maggiori di alanina per consentire il recu-pero39. I siti di germinazione della L-alanina possono essere attivati dal lattato e le spore trat-tate con ipoclorito possono germinare per azione di lisozima e ciò dimostra che il clorurorimuove il rivestimento proteico 40. (Per maggiori dettagli sul danneggiamento delle spore sirimanda al lavoro di Foegeding e Busta38.)

I lieviti stressati da trattamenti termici subletali sono inibiti da alcuni oli essenziali (spe-zie a basse concentrazioni, per esempio 25 ppm) 24. Gli oli delle spezie influenzano la dimen-sione delle colonie e la produzione di pigmenti.

Speck e colleghi123 e Hartman e colleghi49 hanno messo a punto speciali procedure di pia-stramento per consentire la riparazione del danno e la successiva enumerazione in un unicopassaggio. Le procedure sono basate su una tecnica di piastramento su agar sovrapposto.Dapprima, su uno strato di TSA vengono seminati i microrganismi danneggiati; dopo 1 o 2ore di incubazione a 25 °C, per consentire il recupero delle cellule, lo strato di TSA vienericoperto con VRBA e incubato a 35 °C per 24 ore. Il metodo della sovrapposizione di Har-tman e colleghi prevede l’uso di VRBA modificato. Naturalmente, questa tecnica può esse-re impiegata con altri terreni selettivi ed è stata raccomandata per il recupero dei coliformi.Con questo metodo i coliformi vengono piastrati su TSA e incubati a 35 °C per 2 ore e, suc-cessivamente, viene sovrapposto lo strato di VRBA.

Comparando 18 terreni solidi e 7 brodi di arricchimento per il recupero di cellule di Vibrioparahaemolyticus danneggiate dal calore, Beuchat e Lechowich13 hanno osservato che i terre-ni solidi più efficaci erano water blue-alizarin, yellow agar e arabinose-ammonium-sulfate-chocolate agar, mentre il brodo di arricchimento più adatto era arabinose-ethyl violet.

10.11.2 Meccanismi di recupero

Sia il piruvato sia la catalasi degradano i perossidi e ciò indica che le cellule metabolicamen-te danneggiate sono prive di tale capacità. L’incapacità delle cellule di E. coli danneggiatedal calore di crescere in un determinato terreno, sia quando piastrate in superficie sia quan-do seminate per inclusione47, può essere spiegata dalla perdita di perossidasi.

Numerosi ricercatori hanno osservato che il danno metabolico è accompagnato da altera-zioni della membrana cellulare, dei ribosomi, del DNA o degli enzimi; in particolare, lamembrana sembra essere la struttura cellulare più colpita55. I componenti lipidici della mem-brana sono gli obiettivi principali, soprattutto se il danno è causato dal calore; il danno airibosomi sarebbe invece dovuto alla perdita di Mg2+ e non all’azione diretta del calore57.D’altra parte, al microscopio elettronico sono state osservate zone prive di ribosomi nelle cel-lule di S. aureus danneggiate dal calore64. Dopo riscaldamento prolungato a 50 °C, non è statopraticamente individuato nessun ribosoma; inoltre, le cellule erano caratterizzate dalla com-parsa di vescicole superficiali e da ingrossamento delle membrane interne64. Nelle cellule diS. aureus danneggiate dall’esposizione ad acidi (quali acetico, cloridrico e lattico) a 37 °C èstata osservata la riduzione dell’attività della coagulasi e della nucleasi termostabile132. Seb-bene il danno provocato dagli acidi non interessasse le membrane cellulari, la sintesi del-l’RNA risultava alterata. (Per ulteriori informazioni sul danneggiamento cellulare e sullemetodiche di recupero, si veda il riferimento bibliografico 4.)


10.12 Microrganismi vitali ma non coltivabili

In determinate condizioni e in alcuni ambienti, i risultati della conta standard in piastra pos-sono suggerire l’assenza di unità formanti colonie o valori di popolazione vitale considerevol-mente più bassi di quelli reali. Sebbene ciò possa sembrare il risultato di uno dei danni meta-bolici descritti, queste cellule vitali ma non coltivabili (VBNC, viable but nonculturable cells)si trovano, in realtà, in uno stato diverso da quello delle cellule danneggiate. Per esempio, pia-strate in un terreno non selettivo privo di inibitori, le cellule metabolicamente danneggiatepossono recuperare la propria funzionalità, mentre ciò non accade per le VBNC.


9

8

7

6

5

4

3

2

1

0 2 4 6 8 10 12Giorni di incubazione a 37 °C

Conte in piastra

DVC

AODC

Cel

lule

co

ltiv

abili

(Lo

g10

ufc

/mL)

Figura 10.3 Determinazione quantitativa della vitalità di Campylobacter quale indice di vitalità dellamicroflora stabile presente in acque correnti. Confronto tra: conta in piastra (5% di sheep bloodagar) (�), DVC (basata sulla sintesi proteica in assenza di replicazione del DNA) (▲) e AODC (�). (DaRollins e Colwell109, copyright © 1986 American Society for Microbiology)

La condizione VBNC è stata osservata per la prima volta nei vibrioni marini, che risulta-vano difficili da coltivare in acqua marina durante i mesi invernali. È noto che un abbassa-mento della temperatura fino a circa 5 °C induce le cellule a passare in questo stato. In unodei primi studi su Campylobacter jejuni, le cellule in fase log avevano quasi sempre forma aspirale, mentre quelle in avanzata fase stazionaria avevano per lo più morfologia coccica109;a 4 °C lo stato VBNC è stato mantenuto per oltre 4 mesi. Impiegando la conta in piastra stan-dard il numero delle VBNC appariva basso, ma risultava di circa 7 unità logaritmiche piùelevato utilizzando la conta vitale diretta (DVC, direct viable count) e la conta diretta conarancio acridina (AODC) (figura 10.3).

Le cellule nello stato VBNC hanno morfologia coccica; in uno studio su V. vulnificus que-sta condizione è stata indotta, in acqua di mare artificiale con un ridotto contenuto in nutrien-ti, dopo 27 giorni a 5 °C 86. In un’altra ricerca lo stato VBNC è stato indotto in V. vulnificusnei 7 giorni successivi all’abbassamento della temperatura fino a 5 °C 91. Riportando la tem-peratura a valori di circa 21 °C , la rivitalizzazione ha luogo in genere entro 24 ore 92. Tra icambiamenti che si verificano all’interno della cellula, quando il microrganismo entra nellostato di non coltivabilità, vi sono quelli legati alla sintesi cellulare di lipidi e proteine. Si èosservato che, riducendo la temperatura da 23 a 13 °C, il tempo di generazione di V. vulnifi-cus aumentava da 3,0 a 13,1 ore e venivano sintetizzate 40 nuove proteine78. È stato inoltredimostrato che quando V. vulnificus si trova in uno stato vitale ma non coltivabile esso è ingrado di conservare la propria virulenza, sebbene in misura ridotta 91. La condizione VBNCè stata accertata anche in Salmonella Enteritidis, Shigella, Vibrio cholerae e E. coli entero-patogeno. Sebbene i risultati di uno studio suggeriscano che E. coli O157:H7 sia in grado dientrare nello stato VBNC in acqua130, in un altro studio i ricercatori non sono riusciti a indur-re tale stato in diversi batteri enterici, tra i quali E. coli 18.

Utilizzando una coltura di Pseudomonas fluorescens marcata con una proteina fluorescen-te verde, le cellule che venivano stressate a 37,5 °C ed entravano nello stato VBNC emette-vano fluorescenza di intensità pari al 50% circa di quella delle cellule non stressate, mentrele cellule che entravano nello stato VBNC dopo mancanza di nutrienti, presentavano fluore-scenza di intensità pari al 90-120% rispetto alle cellule non private di nutrienti 71. Poiché lecellule morte non emettono fluorescenza, si può dedurre che lo stato VBNC è una condizio-ne nella quale le cellule mantengono la propria vitalità. Quando Vibrio harveyi e V. fischerisono stati indotti a entrare nello stato di non coltivabilità limitando la concentrazione dinutrienti, entrambe le specie hanno perso la capacità di emettere luminescenza, ma l’hannoriacquistata al cessare della condizione limitante, dopo aggiunta di nutrienti103.

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[Food] Microbiologia degli alimenti Volume 186 || Tecniche di coltura, di microscopia e di...

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