SECONDA UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI NAPOLI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOCHIMICA CELLULARE SETTORE DISCIPLINARE BIO/10 TESI DI DOTTORATO 2010 RUOLO DELL’RNA INTERFERENZIALE NELLA REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ISOASPARTATO METILTRASFERASI: POTENZIALE BERSAGLIO PER LA MODULAZIONE DELL’APOPTOSI IN CELLULE TUMORALI. Dottoranda: Dott.ssa Irene Sambri Docente guida: Chiar.mo Prof. Diego Ingrosso Coordinatore: Chiar.ma Prof.ssa Patrizia Galletti
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SECONDA UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI NAPOLI
DOTTORATO DI RICERCA IN BIOCHIMICA CELLULARE
SETTORE DISCIPLINARE BIO/10
TESI DI DOTTORATO 2010
RUOLO DELL’RNA INTERFERENZIALE NELLA REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ISOASPARTATO
METILTRASFERASI: POTENZIALE BERSAGLIO PER LA MODULAZIONE DELL’APOPTOSI IN CELLULE TUMORALI.
Dottoranda: Dott.ssa Irene Sambri
Docente guida: Chiar.mo Prof. Diego Ingrosso
Coordinatore: Chiar.ma Prof.ssa Patrizia Galletti
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INDICE
SUMMARY pag.3
RIASSUNTO pag.6
INTRODUZIONE pag.9
- Meccanismo di formazione di residui “anomali”di acido aspartico pag.11 - PCMT: struttura del gene e della proteina pag.15
- Apoptosi o Morte cellulare programmata pag.19
- L’RNA interferenziale pag.35
- I microRNA pag.50
SCOPO DELLA TESI pag.66
MATERIALI E METODI pag.69
RISULTATI E DISCUSSIONE pag.84
• Effetti del silenziamento della PCMT indotto da siRNA in colture cellulari di epatocarcinoma trattate con cisplatino pag.84
• Regolazione post-trascrizionale della PCMT indotta da miRNA pag.103
CONCLUSIONI pag.115 RINGRAZIAMENTI pag.119
BIBLIOGRAFIA pag.120
ABBREVIAZIONI pag.141
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SUMMARY BACKGROUND: The AdoMet-dependent L-isoaspartyl protein carboxyl-O-
methyltransferase (PCMT; EC 2.1.1.77) repairs abnormal isopeptide bonds, at the
level of altered L-isoaspartyl residues, which are spontaneously generated through
deamidation of L-asparaginyl residues. Isoaspartyl formation is particularly
remarkable in long-lived proteins during cell/molecular ageing and may destabilize
protein structure with consequent functional impairment. Protein deamidation rate is
also accelerated by cell stress conditions, such as oxidation, UV irradiation, cell
shear stress, metabolic derangement and/or mutations of the genes encoding for
membrane cytoskeletal protein components . Previous data showed that:
-isoaspartyl-containing damaged proteins result in a severalfold accumulation in all
tissues and organs, in homozygous PCMT knockout mice.
-PCMT overexpression in primary mouse cortical neurons appears to protect against
Bax-induced apoptosis.
-protein deamidation is related to UV-induced DNA damage, through overexpression
of a proton membrane transporter, causing an increase of local intracellular pH.
In our previous work we demonstrated the antiapoptotic action of PCMT and propose
a mechanism, based on the ability of this methyltransferase to maintain the structural
stability of some crucial antiapoptotic proteins, through methylation and repair of their
L-isoaspartyl-containing derivates. We thus identified a number of PCMT key
substrates, which are also crucial anti-apoptotic members in the apoptosis cascade,
like Hsp 70, Hsp 90 and Bcl-xL. These proteins represent potential substrates for
regulation induced by PCMT on apoptosis. The mechanism through which PCMT can
be hypothesized to function as an antiapoptotic effector implies regulation of the
partitioning between the native (active) and deamidated (inactive) forms of some
apoptosis effectors, through repair of their deamidated forms.
AIMS: To investigate the role of PCMT in apoptosis, as well as its post-transcriptional
regulation.
METHODS: Since apoptosis mechanisms play a pivotal role in cancer I used
HepG2 cell line with characteristics relevant to this pathophysiological conditions.
Cells were transfected with siRNA against PCMT; PCMT transcript levels were
monitored by Real Time PCR; PCMT protein levels were estimated by Western
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blotting using anti-PCMT antibodies. In PCMT-silenced cells, BclxL was evaluated by
Western blotting using anti-BclxL antibody.Bioinformatic prediction (Targetscan,
Miranda and Pictar software) was made to identify PCMT as a potential target of
miRNA-15a and miR-16-1. Identification of PCMT as a target of miRNA-15a and
miRNA-16-1 was evaluated by transient cell transfection with pre-miR and/or antago-
miR. To obtain the direct proof that miRNA-15-16 regulate expression of PCMT, I
cloned the PCMT 3ʻUTR immediately downstream of the firefly luciferase open
reading frame contained in the pGL3TK reporter vector. I cotrasfected pGL3TKPCMT
recombinant plasmids with both miRNA 15-16, and 24 h after transfection I measured
luciferase activity; I also co-transfected renilla luciferase reported plasmid (pRLCMV)
to normalize the data.
RESULTS: A) EFFECTS OF PCMT SILENCING INDUCED BY siRNA IN CELL
CULTURES. PCMT is effectively silenced by transient transfection with siRNA
monitored by Real Time PCR and western blotting. To investigate the functional
meaning of these alterations we monitored the levels of BclxL deamidation, which is
both an anti apoptotic effector of the Bcl2 protein family and a PCMT substrate . In
cells transfected with siRNA against PCMT, in which this methyltransferase
expression is suppressed, BclxL protein is more deamidated than in the control,
where the enzyme can exert its repairing activity. BclxL, deamidated and native
forms, were characterized by MS analysis. B) POST-TRASCRIPTIONAL
REGULATION OF PCMT EXPRESSION BY microRNA. Bioinformatic analysis
allowed prediction of PCMT as a potential gene target of miR15-16 . In addition it
should be pointed out that this microRNA cluster regulates the expression of a
number of antiapoptotic effectors. Evidence in this respect supports the role of
miR15-16 deregulation in the pathophysiology of various types of cancer. These
miRNAs are in fact deleted or downregulated in the majority of chronic lymphocytic
leukemia (CLL) and negatively and post-transcriptionally regulate Bcl2, thus inducing
apoptosis. Cells transfected with pre-miR-15a and pre-miR-16-1 showed a decrease
in the expression of PCMT, while in cells transfected with the relevant antago-miRs
PCMT was overexpressed compared to the control. The transcripts encoding for
PCMT is effective target of miRNAs 15-16, because their mutual interactions reduce
firefly luciferase activity of pGL3TKPCMT recombinant plasmid. In cells co-
transfected with pGL3TKPCMT and miRNA 15-16 the firefly luciferase activity is
significantly reduced, while in both controls (cells co-transfected with pGL3TKCT and
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miRNA15-16 and cells co-transfected with pGL3TKPCMT and miRNA random) firefly
luciferase activity is unchanged.
CONCLUSIONS: Our results showed that regulatory properties of miR 15-16 on
PCMT expression. PCMT represents indeed a potential target of deregulation in
proliferative diseases in which the miR15-16 cluster is deregulated . siRNA effectively
silences PCMT expression in living cells. This represent a potential tool to induce
apoptosis in damaged tissues, by regulating the partitioning between the native
(active) and deamidated (inactive) forms of BclXL and, prospectively, of other PCMT
substrates.
These results, establish the very basis for the future potential use of RNAi toward
PCMT as a gene therapy approach in cancer.
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RIASSUNTO INTRODUZIONE: La proteina carbossimetiltrasferasi (PCMT; EC 2.1.1.77) è un
enzima ubiquitario in natura che ripara legami isopeptidici anomali a livello di residui
di acido isoaspartico che si generano attraverso la deamidazione spontanea di
residui di asparagina. Tale alterazione, anche a carico di un singolo residuo
amminoacidico, può determinare alterazioni strutturali alquanto estese, tali da
comportare significativi cambiamenti dell’attività biologica delle proteine interessate,
assumendo la caratteristica di veri e propri danni molecolari. In particolari condizioni
di stress cellulare, come lo stress meccanico, osmotico e ossidativo, questi danni
aumentano significativamente in relazione alle variazioni del biochimismo del
microambiente intracellulare.
Dati precedenti dimostrano che:
- topi omozigoti knockout per PCMT in tutti i tessuti presentano un sorprendente
accumulo di proteine danneggiate contenenti residui isoaspartilici.
- l’iperespressione della PCMT in cellule primarie neuronali di topo protegge queste
ultime dall’apoptosi indotta da Bax.
- la deamidazione proteica è correlata al danno al DNA, indotto dagli UV, attraverso
l’iperespressione di un trasportatore protonico di membrana, che causa un aumento
locale del pH intracellulare.
In un nostro precedente lavoro abbiamo dimostrato l’azione antiapoptotica della
PCMT e abbiamo proposto un meccanismo basato sull’abilità di questa
metiltrasferasi di mantenere la stabilità strutturale di alcune proteine antiapoptotiche,
attraverso la metilazione e la riparazione dei residui isoaspartilici.
Abbiamo identificato quindi una serie di substrati-chiave della PCMT che sono anche
proteine antiapoptotiche cruciali per l’inizio della cascata apoptotica, come Hsp70,
Hsp90 e Bcl-xL. Queste proteine rappresentano potenziali substrati per la
regolazione indotta dalla PCMT sull’apoptosi. Si ipotizza che il meccanismo
attraverso cui la PCMT funzioni come effettore antiapoptotico implichi la regolazione
della ripartizione tra la forma nativa (attiva) e la forma deamidata (inattiva) di alcuni
effettori apoptotici, attraverso la riparazione della loro forma deamidata.
SCOPO: studiare il ruolo della PCMT nell’apoptosi e la sua regolazione post-
trascrizionale.
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METODICHE: Dal momento che l’apoptosi gioca un ruolo cruciale nello sviluppo del
cancro ho utilizzato, quale modello sperimentale, cellule di carcinoma epatico
(HepG2). Le cellule sono state trasfettate con siRNA contro PCMT. Attraverso Real
time PCR sono stati monitorati i livelli del trascritto della PCMT, mentre con il
Western blot ne sono stati valutati i livelli proteici. Nelle cellule silenziate per PCMT,
mediante Western blot, è stata stimata la ripartizione della forma nativa e deamidata
di Bcl-xL. Per valutare se la PCMT potesse essere regolata post-trascrizionalmente
da potenziali miRNA, ho effettuato una predizione bioinformatica (utilizzando i
software Targetscan, Miranda e Pictar) che ha suggerito che la PCMT poteva essere
potenziale target di interazione di miRNA 15-16. L’identificazione della PCMT come
target dei miRNA15a e miRNA-16-1 è stata valutata attraverso trasfezione transiente
con pre-miRNA e antago-miRNA-15-16 e analisi con Western blot, usando un
anticorpo anti-PCMT. Per ottenere la prova diretta dell’interazione tra la PCMT e i
miRNA-15-16, la seed sequence della PCMT (che corrisponde al sito di interazione
dell’enzima con i miRNA-15-16) è stata clonata a valle della luciferasi del plasmide
pGL3TK e co-trasfettata con i pre-miRNA-15-16 e, 48 h dopo la trasfezione, è stata
misurata l’attività luciferasica del plasmide ricombinante (pGL3TKPCMT). E’ stato
inoltre co-trasfettato anche un plasmide contenente renilla (pRLCMV) per
normalizzare i dati.
RISULTATI: A) EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DELLA PCMT INDOTTO DA siRNA
IN COLTURE CELLULARI DI HepG2. La PCMT risulta effettivamente silenziata dalla
trasfezione transiente con siRNA monitorata attraverso Real Time PCR e Western
blotting. Per studiare il significato funzionale di queste alterazioni ho monitorato i
livelli di deamidazione di BclxL, che è sia un effettore anti-apoptotico della famiglia
delle proteine Bcl2 che un substrato della PCMT. Nelle cellule trasfettate con siRNA
contro PCMT, in cui l’espressione di questa meltiltrasferasi è soppressa, la proteina
BclxL è più deamidata che nel controllo, dove l’enzima può esercitare la sua attività
di riparazione. Le forme deamidata e nativa di BclxL sono state caratterizzate
mediante analisi di spettrometria di massa.
B) REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE DELLA PCMT INDOTTA DA MICRO-
RNA. L’analisi bioinformatica ha permesso la predizione della PCMT come
potenziale gene bersaglio dei miRNA-15a e miRNA-16-1. E’ importante sottolineare
che questo cluster di miRNA regola l’espressione di una serie di effettori
antiapoptotici. Evidenze a riguardo suggeriscono che la deregolazione dei miRNA-
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15-16 svolga un ruolo-chiave nella fisiopatologia di vari tipi di cancro. Questi miRNA
sono infatti eliminati attraverso mutazioni o deregolati nella maggioranza delle
leucemie linfocitarie croniche (CLL) e ciò comporta l’ipoespressione di Bcl2, che
causa l’induzione dell’apoptosi. Le cellule trasfettate con pre-miRNA-15a e pre-
miRNA-16-1 mostrano una diminuzione dose-dipendente dell’espressione della
PCMT, mentre nelle cellule trasfettate con i relativi antago-miRNA 15-16 la PCMT è
iperespressa in confronto ai controlli. Nelle cellule co-trasfettate con pGL3TKPCMT e
i miRNA-15-16, l’attività luciferasica è significativamente ridotta, mentre nei controlli
l’attività luciferasica risulta invariata, dimostrando la diretta interazione della PCMT
con i due miRNA-15-16.
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI: I risultati dimostrano che i siRNA esercitano una
potente ed efficace azione di silenziamento sull’espressione della PCMT in linee
cellulari. Ciò rappresenta un potenziale strumento per indurre l’apoptosi in tessuti
danneggiati, attraverso la regolazione della ripartizione tra la forma nativa (e dunque
attiva) e deamidata (e quindi inattiva) di BclxL e, in prospettiva, di altri substrati della
PCMT. I miRNA-15-16 esercitano una specifica azione di regolazione
sull’espressione della PCMT. La PCMT quindi rappresenta un potenziale bersaglio di
deregolazione in malattie proliferative in cui questi miRNA sono a loro volta
deregolati.
Nel complesso, questi risultati in prospettiva suggeriscono un uso futuro dell’RNA
interferenziale come potenziale approccio alla terapia genica del cancro, attraverso
l’inibizione dell’espressione della PCMT nei tessuti patologici.
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INTRODUZIONE Le proteine naturali sono soggette a modificazioni post-biosintetiche non
enzimatiche, quali:
• La deamidazione di residui aminoacidici di asparagina ed acido glutammico;
• La racemizzazione di residui aminoacidici di acido aspartico;
• La glicosilazione non enzimatica di gruppi amminici liberi;
• L’ossidazione di residui aminoacidici di metionina, triptofano ed istidina.
(Galletti et al.1995)
Tali alterazioni, anche a carico di un singolo residuo aminoacidico, possono
determinare modificazioni strutturali alquanto estese (Rogers e Reichsteiner, 1988,
Robinson e Robinson, 2004) e possono comportare significativi cambiamenti
dell’attività biologica delle proteine interessate, assumendo così le caratteristiche di
veri e propri “danni” molecolari. Gli effetti di tali alterazioni di natura post-biosintetica
sono inoltre cumulativi nel tempo, nel senso che più lunga è la vita media di una
certa proteina e maggiore sarà anche la probabilità che tali alterazioni possano
manifestarsi e determinare conseguenze strutturali e funzionali significative. Questo
spiega come proteine di particolari cellule o tessuti, nei quali queste macromolecole
presentano un turnover lentissimo o virtualmente assente (cellule del cristallino,
neuroni, eritrociti), siano particolarmente soggette ad accumulare danni strutturali
spontanei. La caratteristica della tempo-dipendenza e l’effetto additivo di accumulo di
singoli danni, fino al raggiungimento di livelli critici per la stabilità della conformazione
biologicamente attiva della proteina, ha suggerito di definire queste reazioni post-
biosintetiche “danni da fatica molecolare”.
E’ stato inoltre dimostrato che, in particolari condizioni di “stress cellulare”, come lo
stress meccanico, osmotico ed ossidativo, questi specifici danni da fatica molecolare
aumentano significativamente in relazione alle variazioni del biochimismo del
microambiente intracellulare (Ingrosso et al., 2000; Ingrosso et al., 2002).
E’ opinione comune che il principale meccanismo per contrastare l’effetto dei danni
da “fatica” molecolare possa consistere nella completa sostituzione delle proteine
danneggiate con molecole neosintetizzate. Anche se le macromolecole proteiche
sono naturalmente soggette ad un turnover specifico, è stata chiaramente dimostrata
l’esistenza di sistemi enzimatici in grado di riparare le proteine danneggiate. La
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riparazione, oltre a comportare un notevole risparmio energetico, (l’energia
consumata da una cellula per la sintesi ex novo di una proteina, stimata mediamente
pari a circa mille molecole di ATP, è maggiore di quella consumata per la sua
riparazione, vale a dire, in media, dieci molecole di ATP), costituisce l’unica modalità
attraverso cui cellule, in cui è assente o ridotta la sintesi proteica, sono in grado di
proteggere il loro patrimonio proteico.
Sono stati identificati vari processi di riparazione:
• Uno coinvolge una famiglia di isomerasi della prolina che è in grado di
convertire residui anomali di cis-prolina in residui di trans-prolina (Schiene e
Fischer, 2000).
• Un secondo gruppo di enzimi catalizza la conversione di residui di metionina
sulfossido modificati ossidativamente in normali residui di metionina (Grimaud
et al., 2001; Ruan et al., 2002).
• Un terzo sistema di riparazione coinvolge una metil trasferasi (L-isoaspartato
(D-aspartato) O-metiltrasferasi PCMT, E.C. 2.1.1.77), di cui si tratterà
estesamente nella presente tesi. Tale enzima è in grado di riconoscere
residui isoaspartilici anomali (L-isoaspartato e talvolta anche residui di D-
aspartato) nelle proteine substrato e di rendere possibile la loro conversione in
residui aspartilici normali.
• Esistono infine vari sistemi di prevenzione e/o riparazione di danni ossidativi,
nonchè di mantenimento dello stato ridotto di varie macromolecole. Tali
meccanismi sono ben conosciuti ed in genere consistono nell’attività di enzimi
specifici (superossido dismutasi, catalasi, glutatione perossidasi e reduttasi) e
molecola scavenger endogene (glutatione) o di provenienza alimentare
(ascorbato, vitamina E, acido urico) o mista (melatonina).
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Meccanismo di formazione di residui “anomali” di acido aspartico
La più frequente modifica covalente responsabile della formazione nelle proteine di
residui anomali L-isoaspartilici è la deamidazione di residui labili di L-asparagina
(Asn) descritta per la prima volta negli anni 80’ (Aswad et al., 1984; Murray e Clarke,
1984). Benché siano possibili vari meccanismi di reazione attraverso cui l’asparagina
nelle proteine può deamidare, l’unico ampiamente confermato sperimentalmente
avviene attraverso la formazione di un intermedio succinimmidico. Il meccanismo,
illustrato in figura 1 , prevede un attacco nucleofilo dell’atomo di azoto del residuo
Asn+1 al carbonio del β-carbonile della catena laterale del residuo asparaginilico,
con eliminazione di una molecola di ammoniaca e formazione di un intermedio
succinimmidico. Tuttavia l’anello succinimmidico è instabile, e l’uno o l’altro legame
sui due lati dell’atomo di azoto s’idrolizza, portando alla formazione di due possibili
prodotti: L-aspartil-peptide normale e L-isoaspartil peptide, rispettivamente in
rapporto 3:7 (Barber e Clarke, 1985; Stephenson e Clarke, 1989, Galletti et al.,1995).
E’ stato inoltre dimostrato che l’intermedio succinimmidico si può formare, benché
meno frequentemente, da un residuo L-aspartilico. La succinimmide, inoltre, può
lentamente racemizzare e dare origine, in seguito alla sua apertura, a peptidi
contenenti rispettivamente il D-aspartato o il D-isoaspartato. Nel caso in cui si formi
un prodotto contenente l’L-isoaspartil peptide, la presenza di un metilene in più nello
scheletro peptidico va ad alterare la normale alternanza di atomi di C e N nello
scheletro peptidico e può costituire un fattore di destabilizzazione dell’organizzazione
spaziale della proteina, causando, ad esempio, l’interruzione di un segmento ad α-
elica.
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Figura 1. Meccanismo di deamidazione di residui di asparagina (tratto da Cimmino et al., 2008)
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La tendenza alla deamidazione di residui di asparagina dipende sia dalla sequenza
aminoacidica del polipeptide intorno al residuo labile, in particolare dalla presenza di
residui poco ingombranti e/o polari non carichi quali: Gly Ala Ser Thr (Stephenson et
al,1989 Clarke et al., 2003) sia dall’organizzazione tridimensionale ed in particolare
dalla flessibilità conformazionale della regione della proteina interessata (Kossiakoff,
1988; Wright, 1991). La sequenza aminoacidica del polipeptide intorno al residuo
labile di Asn non è sufficiente a condizionarne la suscettibilità alla deamidazione. E’
stato infatti dimostrato che alcuni residui di asparagina potenzialmente labili sono
situati in strutture che non consentono la necessaria flessibilità conformazionale
affinché avvenga l’attacco nucleofilo dell’azoto del residuo Asn+1 al β-carbonile della
Asn. Pertanto non tutte le sequenze Asn-Gly, oppure Asn-Ser sono di fatto soggette
a deamidazione, in quanto non tutte le strutture spaziali locali risultano permissive.
Evidentemente, in alcuni casi, la comparsa di un residuo isoaspartilico può essere
particolarmente dannosa per la struttura e la funzione della proteina. E’ inoltre
emerso che, nel corso dell’evoluzione, la presenza di residui con catena laterale
piccola appaiono sfavoriti, rispetto a residui più ingombranti, nell’occupare la
posizione di sequenza Asn+1. Ciò indica che, sia la sequenza aminoacidica del
polipeptide intorno al residuo labile, sia i fattori di impedimento sterico, tenderebbero
a proteggere i residui asparaginilici dalla deamidazione, in quanto questa
risulterebbe potenzialmente dannosa alla struttura ed alla funzione della proteina.
La deamidazione dei residui di asparagina comunque, costituisce una frequente
modifica post-biosintetica delle proteine, infatti ne è stata dimostrata la presenza:
nella proteina chinasi A (Pepperkok et al., 2000), nella calmodulina, nella tubulina,
nel fattore di crescita epiteliale (epidermal growth factor), nell’ attivatore del
plasminogeno (tissue plasminogen activator) (Reissner et al, 2003), nel collagene di
tipo I (Lanthier et al, 2004), nel peptide β-amiloide dell’Alzheimer (Bohme et al.,
2008; Sargaeva et al., 2009), nella ribonucleasi U2 del fungo Ustilago sphaerogena
(Noguchi et al., 2010) e nella cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) dal batterio
Paenibacillus (Yenpetch et al., 2010). Un altro aspetto, emerso dal lavoro di Yang e
collaboratori (Yang et al.,2006), sottolinea che l’anormale accumulo di residui di iso-
Asp possa contribuire alla patogenesi di malattie autoimmuni, in qualto l’aspartile è in
genere situato in una struttura β-hairpin che si trova alquanto in superficie nella
compagine della proteina ed è piuttosto immunogenica. Nelle cellule del cristallino,
che è un tessuto con un turnover proteico quasi assente, gli effetti della
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deamidazione proteica sono molto evidenti e correlati con una serie di patologie
oculari (Kaji et al., 2009; Yamazaki et al., 2010). La presenza di residui isoaspartilici
inoltre influenza fortemente il riconoscimento e il turnover dei substrati da parte delle
proteasi (Bohme et al., 2008).
La formazione di residui isoaspartilici ha un ruolo importante anche nella produzione
di farmaci. Nella produzione di immunoglobuline gamma destinate all’impiego
terapeutico la deamidazione è un evento che può compromettere la stabilità durante
la shelf-life del farmaco e deve essere evitata in quanto diminuisce l’efficacia ed
aumenta l’immunogenicità (Mukherjee et al.,2010), per cui sono state messe a punto
nuove tecniche di spettrometria di massa per monitorare la comparsa di tali
alterazioni (Vlasak et al., 2009; Li et al., 2010; Chan et al., 2010; Ni et al., 2010).
Non sempre però la formazione di residui isoaspartilici ha delle conseguenze
negative nell’efficacia di un farmaco, infatti in un recente studio (Curnis et al., 2010) è
stato evidenziato che farmaci contro l’aminopeptidasi N (CD13) (che è un marker di
tumore vascolare) che contengono residui NGR (Ans-Gly-Arg), vanno incontro a
deamidazione con la formazione di peptidi iso-DGR (iso-Asp-Gly-Arg). Ciò ha delle
interessanti ripercussioni in termini di effetto d’azione, in quanto l’affinità per il
substrato risulta aumentata considerevolmente. Questa considerazione è molto
importante per la progettazione e lo sviluppo di questo farmaco antitumorale. Ciò non
riguarda solo le possibili modificazioni di struttura e funzione di proteine destinate
all’uso umano in terapia, ma anche la funzione fisiologica di molecole proteiche in
vivo. Infatti, gli stessi autori hanno dimostrato che la conversione tempo-dipendente
di NGR in iso-DGR nelle proteine naturali come la fibronectina possa avere la
funzione di “timer molecolare” nella generazione di nuovi siti di legame per le
integrine coinvolte nell’angiogenesi (Corti et al., 2008; Curnis et al., 2008). Queste ed
altre evidenze (Cimmino et al., 2008) dimostrano come in varie condizioni la
deammidazione e la successiva modifica riparativa di proteine deammidate possa
avere il significato di regolazione piuttosto che di alterazione indesiderata della
funzione di tali macromolecole.
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PCMT: struttura del gene e della proteina
La PCMT è un enzima ubiquitario in natura, presente sia in eucarioti che in procarioti;
nell’uomo è presente in tutti i tessuti, raggiungendo alti livelli di attività specifica nei
globuli rossi e nei tessuto nervoso. La PCMT umana ha un peso molecolare pari a 26
kDa . Sono stati isolati due isoenzimi principali, entrambi proteine monomeriche di
226 e 227 residui rispettivamente (Ingrosso et al., 1989), ed un isoenzima minore
(Ingrosso et al., 1991). Gli isoenzimi presentano un differente punto isoelettrico, ciò
riflette variazioni della sequenza aminoacidica nella regione C-terminale, dove i
residui RWK (Arg, Trp, Lys) dell’isoenzima I sono sostituiti dalla sequenza RDEL
(Arg, Asp, Glu, Leu) nell’isoenzima II. I due principali isoenzimi si generano
attraverso un meccanismo di splicing alternativo del trascritto primario, mentre la
forma isoenzimatica minore si produce spontaneamente per deamidazione
dell’isoenzima I (McFadden et al., 1995).
Tali isoenzimi non presentano, almeno in vitro, differenze per ciò che concerne le
caratteristiche cinetiche e la specificità di substrato nei confronti di peptidi e proteine
danneggiati che espongono residui isoaspartilici (Ota e Clarke et al.,1991). In
Arabidopsis thaliana, è stato dimostrato che, attraverso splicing alternativo, il gene
della pcmt è in grado di generare fino a otto forme dell’enzima, che si caratterizzano
per la differente localizzazione cellulare; infatti le differenti forme dell’enzima sono
state localizzate: nel nucleo, nel citoplasma, nel sistema di endomembrane, nel
clorolasto e/o nel mitocondrio (Dinkins et al., 2008). Recentemente si è scoperto che
la PCMT presenta un polimorfismo Val/Ile in alpha 5, a circa 13 amminoacidi di
distanza dal suo sito attivo. La sola presenza del residuo Val comporta una minore
attività enzimatica e una diminuita stabilità termica ma aumenta l’affinità per i
substrati endogeni. La variante Ile invece presenta difficoltà di riconoscimento e
orientazione per substrati specifici a causa del sito di legame che risulta distorto
strutturalmente. Di conseguenza tale studio suggerisce che l’eterozigosi Val/Ile
favorisca il riparo più efficiente grazie al bilanciamento di tali caratteristiche
(Rutherford et al., 2009).
Attraverso algoritmi di confronto di sequenze aminoacidiche di proteine, è stato
possibile identificare tre regioni consenso, altamente conservate in un gran numero
di metiltransferasi AdoMet-dipendenti, sia di origine procariotica che eucariotica.
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Queste regioni sono definite motivi strutturali I, II e III. Tali regioni, lungo la catena
polipeptidica, sono disposte sempre nello stesso ordine e sono separate da regioni
spaziatrici di lunghezza simile nei vari enzimi. Questi studi fanno propendere per
un’organizzazione strutturale simile, nonché per un comune destino evolutivo come
si evince dalla figura 2 (Fang et al., 2010).
Figura 2. Struttura cristallografica della PCMT. L’enzima in specie diverse ha conservato omologia di sequenza nel corso dell’evoluzione. (tratto da Fang et al., 2010)
Le funzioni della PCMT
Utilizzando diversi modelli sperimentali, è stato dimostrato, sia in vivo che in vitro,
che la PCMT è in grado di riparare i danni molecolari, derivati dalla deamidazione
delle proteine, attraverso la conversione dei residui alterati di acido L-isoaspartico in
residui di acido L-aspartico (Clarke, 2003) (Figura 3). La PCMT catalizza la reazione
di trasferimento di un gruppo metilico al gruppo carbossilico libero del residuo
isoaspartilico formatosi spontaneamente. Il donatore del gruppo metilico è la S-
adenosil-L-metionina (AdoMet; SAM) che viene sintetizzata a partire da metionina ed
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ATP in una reazione catalizzata dall’adenosil metionina-sintetasi . La reazione
prosegue con la formazione di un metil estere che però è instabile e rapidamente si
idrolizza liberando metanolo e lo stesso intermedio succinimmidico implicato nel
meccanismo di deamidazione (Johnson e Aswad, 1987; Murray e Clarke, 1986). In
tal modo il ruolo dell’enzima consiste nell’attivare il gruppo α-carbossilico libero del
residuo anomalo, favorendo la formazione della succinimide, che rappresenta
l’intermedio nella conversione di un β-isopeptide in un α-peptide normale. I primi
esperimenti di gene targeting in cellule embrionali staminali di topo che consentirono
di generare topi pcmt-knockout (Kim et al., 1997) rivelarono un sorprendente
accumulo di proteine danneggiate nelle frazioni citosoliche di cervello, cuore, fegato
e sangue (eritrociti), con i più alti livelli di residui danneggiati nel citoplasma di cellule
cerebrali. I topi pcmt-knockout mostravano un significativo ritardo nella crescita e
morivano mediamente 42 giorni dopo la nascita (Kim et al., 1999). Questi risultati
dimostrarono che la PCMT, quale parte essenziale di un sistema di riparazione di
danni strutturali delle proteine, è indispensabile per una normale crescita corporea ed
un corretto sviluppo del sistema nervoso centrale (Kim et al., 1997). Esperimenti
simili furono condotti da Lowenson e collaboratori (Lowenson et al., 2001; Shimizu et
al., 2002) che, producendo topi transgenici in cui l’attività della PCMT era espressa
nei neuroni esclusivamente sotto il controllo di uno specifico promotore, stimarono
che la sopravvivenza dei topi aumentava in base al tempo in cui era permessa
l’espressione dell’enzima. Evidenze più recenti hanno confermato che la PCMT ha
un ruolo indispensabile per l’integrità e la funzione del sistema nervoso. Effettuando
un’analisi globale dei substrati endogeni della PCMT nel cervello di topo, attraverso
saggi radiochimici e spettrometria di massa, è emerso che i substrati dell’enzima
sono proteine coinvolte in un’ampia serie di funzioni: sviluppo neuronale,
trasmissione sinaptica, composizione di strutture citoscheletriche, metabolismo
energetico, omeostasi del pH intracellulare e folding proteico (Zhu et al., 2006;
Vigneswara et al., 2006). Tra tutti i substrati identificati, la proteina che rappresenta il
principale substrato endogeno della PCMT nel cervello è la sinapsina I, che ha un
ruolo fondamentale nei meccanismi di plasticità sinaptica a breve termine (Reissner
et al., 2006). Un substrato della PCMT nel cervello, recentemente scoperto da
Bidinosti e collaboratori (Bidinosti et al., 2010), è il fattore di trascrizione 4E-BP2 che
ha un ruolo fondamentale nella plasticità sinaptica, per i fenomeni di comprensione e
memoria
18
Figura 3. Meccanismo di formazione dei residui L-isoaspartilici e loro riparazione mediata dalla metil esterificazione enzimatica.
19
Apoptosi o Morte cellulare programata La morte cellulare è un processo che può essere scatenato da molteplici stimoli
differenti. I principali meccanismi di morte cellulare sono la necrosi e l’apoptosi
(Krysko et al., 2008). La necrosi è un processo passivo, patologico, scatenato in
risposta ad un danno acuto quale ipossia, ipotermia, radiazioni, infezioni virali,
risposta immunitaria, agenti chimici e farmaci
(Israels et al, 1999). Questi eventi portano ad una perdita dell’integrità delle
membrane degli organelli, incluso il nucleo, con conseguente rilascio del loro
contenuto (ATP, proteasi e lisozimi), fino alla rottura dell’intera cellula e alla
degradazione del DNA in modo aspecifico. Tale fenomeno, che la cellula subisce
passivamente, innesca una risposta infiammatoria con rilascio di citochine da parte di
cellule infiammatorie tra cui i macrofagi. Al contrario, il termine apoptosi viene
utilizzato per descrivere la morte cellulare programmata (Programmated Cell Death;
PCD), un meccanismo cellulare geneticamente controllato e altamente conservato
nel corso dell’evoluzione (Metzstein et al., 1998). Descritto in tutti gli eucarioti
multicellulari (Ellis et al., 1996), l’apoptosi è un evento fisiologico che si verifica
durante le prime fasi dello sviluppo ed ha un ruolo chiave nella morfogenesi (Jezek
et al., 2009), nel differenziamento sessuale e nei processi epigenetici di auto-
organizzazione del sistema immunitario e nervoso (Fox et al., 2009), inoltre,
bilanciando il rapporto vita/morte delle cellule danneggiate nell’adulto, permette
l’omeostasi dei tessuti (Orrenius et al., 2003).
L’apoptosi è dunque un processo regolato, al quale la cellula partecipa attivamente,
con una serie di eventi morfologicamente e biochimicamente ripetibili e ben definiti. I
cambiamenti cellulari iniziano con un arrotondamento della cellula, cui conseguono la
perdita dei contatti con le cellule circostanti e la scomparsa di strutture proprie di
membrana come i microvilli e le regioni specifiche di contato con le altre cellule. Nel
contempo, la perdita di acqua e di ioni determina una riduzione del volume cellulare
con conseguente condensazione citoplasmatica (Kerr, 2002). A livello nucleare, si
manifesta la perdita del nucleolo e la condensazione della cromatina in ammassi
densi e circoscritti che si addossano alla membrana nucleare (nucleo picnotico).
Successivamente, la matrice nucleare interna viene solubilizzata esponendo il DNA
all’attacco enzimatico di nucleasi, che provocano la rottura dell’acido nucleico in
frammenti ad alto peso molecolare. Al termine della condensazione cromatinica, il
20
nucleo si presenta distrutto in frammenti che racchiudono anche organuli cellulari
(mitocondri e porzioni del reticolo endoplasmico), circondati da membrana nucleare
ed inglobati in protuberanze, che si formano alla superficie della cellula (blebs). La
membrana plasmatica che delimita tali protuberanze si salda, dando origine ai “corpi
apoptotici”, rapidamente fagocitati e digeriti dai macrofagi (Krysko et al., 2008)
(Figura 4).
Figura 4. Gli eventi cellulari dell’apoptosi
21
Il processo apototico può essere suddiviso schematicamente in tre fasi:
1. Induzione: comprende l’invio di segnali che porteranno la cellula all’apoptosi e le
vie primarie di trasduzione da essi innescate. I segnali pro-apoptotici si distinguono in
intrinseci ed estrinseci, a seconda se provengono dall’ambiente esterno o all’interno
della cellula. I primi interagiscono con recettori transmembrana appartenenti alla
superfamiglia dei recettori Tumor Necrosis Factor (TNF) (Locksley et al., 2001); i
secondi, invece, determinano modificazioni a carico del mitocondrio, come la
diminuzione del potenziale di membrana e un’eccessiva produzione di specie
radicaliche, con conseguente apertura dei pori nella membrana mitocondriale
(megachannel o mitochondral pores) e liberazione nel citoplasma di fattori
normalmente sequestrati nello spazio intermembrana come il citocromo C (cytC) o
l’AIF (Apoptosis Inducing Factor) (Saelens et al., 2004).
2. Esecuzione: durante questa fase entrambe le vie, estrinseca ed intrinseca,
convergono nell’attivazione di una classe di proteasi dette caspasi (cystein
dependent aspartate specific protease), caratterizzate dalla presenza di un residuo di
cisteina nel proprio sito catalitico e dalla specificità per substrati contenenti un
residuo di aspartato. Le proteasi coinvolte nel suicidio cellulare si distinguono in
sulle effettrici attivandole (Murphy et al., 2003) e queste ultime, a loro volta, agiscono
su substrati specifici eterogenei, che si distinguono per attività, funzione e
localizzazione subcellulare, tra cui citocheratine, PARP, proteine citoscheletriche e la
proteina nucleare NuMA, responsabili dei cambiamenti biochimici e morfologici
osservati nelle cellule apoptotiche (Elmore, 2007): ciò dimostra come la funzione di
queste proteasi coinvolga l’intero apparato cellulare e ne determini le sorti (Tabella I).
23
Tabella I: proteine bersaglio delle caspasi effettrici
24
Figura 5. Apoptosi via estrinseca
Figura 6. Apoptosi via intrinseca
25
3. Fagocitosi: la membrana plasmatica dei corpi apoptotici in superficie espone
molecole quali la fosfatidilserina, normalmente esposta sul versante citosolico della
membrana (Bratton et al., 1997), o la calreticulina (Gardai et al., 2005), che vengono
riconosciute da recettori specifici presenti sui macrofagi, segnando l’inizio della
fagocitosi.
Regolazione della morte cellulare programmata Prima che le caspasi effettrici entrino in azione, rendendo irreversibile il cammino
verso la morte cellulare, deve essere completata la fase di induzione, durante la
quale vengono valutati i segnali che giungono alla cellula. Infatti, la cellula riceve
segnali di morte per via recettoriale, oppure innesca un processo endogeno
(causato, ad esempio, da stress genotossici) che attiva la via mitocondriale, ma al
contempo, può ricevere segnali di sopravvivenza, veicolati da fattori di crescita,
citochine o integrine e molecole di adesione. I principali protagonisti di questa
modulazione sono proteine appartenenti, rispettivamente, alla famiglia Bcl-2 e p53.
Famiglia Bcl-2 Fino ad oggi sono stati identificati 22 membri della famiglia Bcl-2 (B-cell lymphoma
gene 2), classificati sulla base di sequenze-elica conservate, conosciute come
domini di omologia Bcl-2 (BH, Bcl-2 Homology domains) (Scorrano & Korsmeyer,
2003, Wyllie AH., 2010) (Figura 7). Per semplicità, sono stati suddivisi in due gruppi,
in base ai tipi di domini che contengono. Il primo gruppo comprende inibitori
dell’apoptosi, quali Bcl-2 e Bcl-XL, e contiene quattro domini BH (da BH1 a BH4). Il
secondo, che comprende proteine pro-apoptotiche, è diviso a sua volta in due classi,
proteine con tre domini BH (come Bax e Bak) e proteine con un solo dominio BH3
(Bad, Bid, Bim, Bik, Bmf). Queste ultime operano bloccando l’azione delle proteine
anti-apoptotiche (Bcl-2, Bcl-xL) o attivando le proteine pro-apoptotiche Bax e Bak
(Pinon et al,2008; Martin & Vuori, 2004). Le proteine di questa famiglia hanno una
localizzazione dipendente dal ruolo svolto. Gli elementi anti-apoptotici Bcl-2 e Bcl-xL
sono situati soprattutto sulle membrane degli organelli (reticolo endoplasmatico,
nucleo e membrana esterna del mitocondrio). Bax, invece, è situata principalmente
nel citoplasma, ancorata alle strutture citoscheletriche (Desagher & Martinou, 2000).
Gli stimoli apoptotici, esponendo il residuo C-terminale idrofobico, determinano la
26
dimerizzazione di Bax che può, quindi, intercalarsi tra i lipidi della membrana
mitocondriale esterna (Figura 8). Ne consegue la caduta del potenziale
mitocondriale e la fuoriuscita non solo di molecole come Smac/Diablo, che inattivano
gli inibitori delle caspasi, ma anche di ioni calcio, radicali liberi e glutatione,
responsabili dell’amplificazione del segnale. D’altra parte anche Bax e Bak possono
agire sul reticolo endoplasmatico controllando l’omeostasi del calcio (Scorrano &
Korsmeyer, 2003). Bisogna ricordare, infine, che il mitocondrio è interessato dai
fenomeni di apoptosi anche quando il segnale parte dai recettori di membrana, in
quanto la caspasi iniziatrice 8 determina il taglio di Bid, un modulatore pro-
apoptotico, che si localizza appunto su questo organello (Figura 8). Questo
rappresenta un esempio di ‘‘crosstalk’’ tra i pathways recettoriale e mitocondriale
(Elmore, 2007).
Figura 7. Struttura dei domini dei membri della famiglia Bcl-2. TM: dominio transmembrana (tratto da Martin & Vuori, 2004)
27
Figura 8. Meccanismo d’azione delle proteine pro-apoptotiche appartenenti alla famiglia Bcl-2 (tratto da Desagher & Martinou, 2001)
28
p53
La proteina p53 fu nominata, per la sua importanza, “molecola dell’anno” nel 1993
dalla rivista Science. Il gene codificante per la proteina p53 la cui struttura è mostrata
nella figura 9, è un oncosoppressore, il cui ruolo principale consiste nel prevenire
una proliferazione inappropriata delle cellule in risposta al danno subito dal DNA.
Una volta attivata, p53 può indurre, a seconda delle circostanze, l’arresto del ciclo
cellulare in G1 o l’apoptosi. L’induzione della morte cellulare programmata avviene in
maniera dipendente o meno dall’attività trascrizionale (Moll & Zaika, 2001; Sebastian
et al., 2010) (Figura 10). Nel primo caso, p53 attiva la trascrizione dei recettori di
morte (DR5, CD95, Fas), di proteine proapoptotiche della famiglia Bcl-2 (Bax, PUMA,
NOXA, Bid), nonchè di adattatori apoptotici come Apaf-1. Inoltre, p53 reprime la
trascrizione di proteine anti-apoptotiche quali Bcl-2 e Bcl-xL (Sionov & Haupt, 1999,
Ploner et al., 2008). Nel caso in cui l’induzione sia indipendente dalla trascrizione,
p53 si comporterebbe come un sensibilizzatore dell’apoptosi, al pari di Bad e Bik,
legandosi direttamente a Bcl-2 e Bcl-xL e, quindi, attivando solo indirettamente Bak e
Bax (Mihara et al., 2003).
Figura 9. Struttura di p53
29
Figura 10. Induzione dell’apoptosi da parte di p53
30
L’apoptosi in fisiopatologia
E’ ormai chiaro che un’alterata regolazione dell’apoptosi ha un ruolo-chiave nella
patogenesi di molte malattie. Un esame sistematico del ruolo dell’apoptosi in
fisiopatologia esula dagli scopi di questa tesi. Basti infatti pensare che in Medline,
sotto le parole-chiave “Apoptosis and disease”, compaiono 32599 di cui 10075
soltanto negli ultimi 3 anni. Tuttavia vengono dati di seguito alcuni esempi di gruppi di
processi patologici associati a deregolazione dell’apoptosi. Possiamo distinguere
patologie associate ad una ridotta mortalità cellulare come i tumori, come nel caso
del tumore ovarico o del linfoma B-cellulare (Tang et al, 2010, Provencio et al, 2010),
le infezioni virali come l’epatite C (Hanafy et al, 2010), le malattie neurodegenerative
caratterizzate dalla perdita graduale di specifici gruppi di neuroni, come il morbo di
Parkinson e quello di Alzheimer (Gatta et al, 2009, Irrcher et al, 2009) e patologie
causate da un’aumentata mortalità cellulare come le malattie autoimmuni, ad
esempio il Lupus erythematosus (Liphaus et al, 2010). Recentemente infatti è stato
evidenziato che la fase di fagocitosi è fondamentale nell’apoptosi e una sua
deregolazione comporta un’ incorretta tolleranza immunologica e un’alterazione
dell’omeostasi cellulare (Nagata et al, 2010).
PCMT e apoptosi
Da tempo ormai dati di letteratura hanno dimostrato l’esistenza di una correlazione
tra l’azione riparatrice della PCMT su proteine danneggiate e la morte cellulare
programmata. Le prime evidenze (Huebscher et al. 1999) mostrarono che l’aggiunta
di CGP3466 a colture primarie di cellule di astroglia di ratto provocava l’iper-
espressione del trascritto della PCMT. Il CGP3466 è un composto che appartiene
alla famiglia delle ammino-metil-dibenzoxepine, strutturalmente e funzionalmente
correlato al R-(-)-deprenile, un farmaco anti-Parkinsoniano. Quest’ultimo previene, in
cellule nervose, l’apoptosi indotta dalla privazione del fattore di crescita nervoso
(NGF) ed incrementa l’espressione del gene CNTF (ciliary neutrophic factor).
Questo, a sua volta, protegge gli oligodendrociti dall’apoptosi naturale e da quella
indotta dal fattore di necrosi tumorale (TNF: tumor necrosis factor) (Louis et al.,
1995). Huebscher e collaboratori dimostrarono che il livello dell’mRNA della PCMT
31
aumentava significativamente nelle cellule nervose in seguito al trattamento con il
farmaco rispetto al controllo.
E’ noto inoltre che il prodotto del gene proapoptotico Bax è coinvolto nella cascata di
eventi che porta all’apoptosi le cellule nervose (primary mouse cortical neurons). Gli
stessi autori verificarono la capacità di tale metiltrasferasi di proteggere tali cellule
dall’apoptosi indotta da Bax. Le cellule trasfettate con un plasmide esprimente Bax
presentavano una bassa sopravvivenza; al contrario, la co-trasfezione delle stesse
cellule con un plasmide contenente il gene PCMT e un altro contenente il gene Bax,
determinava un aumento altamente significativo della sopravvivenza cellulare.
Quest’attività di prevenzione dall’apoptosi non era ristretta a tipi cellulari specifici del
cervello, ma si manifestava anche in cellule COS1.
Il meccanismo attraverso cui la metiltrasferasi protegge le cellule dall’apoptosi indotta
da Bax tuttavia non era ancora ben chiaro. Fu ipotizzato che l’effetto protettivo
potesse coinvolgere strutture citoscheletriche cellulari e quindi che un possibile
substrato della metiltrasferasi potesse essere la tubulina (Najbauer et al., 1996). Per
studiare l’influenza della metiltrasferasi sulla tubulina e sulla stabilità del
citoscheletro, gli stessi autori (Huebscher e collaboratori) co-trasfettarono cellule
ovariche di criceto cinese (CHO) con un plasmide contenente la metiltrasferasi e con
un secondo costrutto β-tubulina-GFP. Le strutture del citoscheletro furono analizzate
mediante microscopia a fluorescenza e si osservò che nelle cellule trasfettate con il
costrutto contenente il gene PCMT wild type la tubulina era polimerizzata mentre non
lo era nelle cellule trasfettate con mutanti della PCMT. Questi dati sostenevano
l’ipotesi che l’attività della PCMT fosse coinvolta nel mantenimento dell’integrità del
citoscheletro (Lanthier et al., 2002). Ulteriori recenti evidenze hanno confermato il
ruolo-chiave della PCMT nella regolazione del fenomeno apoptotico. Zhu e
collaboratori (Zhu et al, 2006) studiando l’effetto protettivo dell’acido folico contro
l’insorgenza della Spina bifida, hanno sottolineato che la somministrazione di tale
composto provoca l’iper-espressione del gene della pcmt che dunque può avere un
ruolo regolatore nel riparare le proteine danneggiate, contrastando l’apoptosi. Inoltre i
neonati omozigoti per l’allele polimorfico Val/Val nel gene della pcmt (che codifica
un’isoforma che presenta sia una bassa affinità enzimatica che una bassa
termostabilità ma una più alta affinità per l’AdoMet), sembrano presentare un più
basso rischio di insorgenza di spina bifida rispetto ai neonati che presentano
omozigosi Ile/Ile nel gene dell’enzima. Ciò suggerisce che una maggiore affinità della
32
PCMT per l’AdoMet possa avere un ruolo cruciale durante lo sviluppo del tubo
neurale.
La PCMT sembra essere coinvolta anche nello sviluppo del diabete di tipo I (Wagner
et al, 2007). Wagner e collaboratori, trattando topi obesi con CGP3466 (un farmaco
antiapoptotico che induce iper-espressione della PCMT) riscontravano un ritardo
nello sviluppo e una riduzione nell’insorgenza del diabete di tipo I. Il fatto che alti
livelli di PCMT si trovassero nelle cellule beta pancreatiche sostiene il ruolo di tale
enzima nella patogenesi di questo tipo di diabete. Infatti, in modelli cellulari di cellule
beta in corso di maturazione, l’esposizione a citochine porta ad una significativa
diminuzione dell’espressione del trascritto maturo della PCMT, ma ciò non si verifica
nelle cellule pre-beta immature. Ciò suggerisce che la modulazione dell’espressione
della PCMT possa essere parte di uno specifico fenotipo che rende le cellule beta
soggette alla distruzione immuno-mediata. Studi proteomici di questo modello
suggeriscono che le modificazioni proteiche post-traduzionali possano riflettere
l’acquisita sensibilità delle cellule beta alle citochine. Infatti i principali autoantigeni
sono soggetti all’isomerizzazione: l’insulina può subire questo tipo di modifica in vitro
(Nielsen et al, 2004).
Anche nelle piante il sistema riparativo della PCMT svolge l’importante compito di
contribuire alla longevità ed alla sopravvivenza (Ogè et al, 2008). L’iperespressione
di tale enzima in Arabidopsis thaliana riduce l’accumulo di residui isoaspartilici nelle
proteine dei semi ed incrementa sia la longevità che la germinazione della pianta.
In un nostro recente lavoro (Cimmino et al., 2008) abbiamo dimostrato che in cellule
endoteliali, l’iperespressione della PCMT conferisce resistenza all’apoptosi indotta da
stress ossidativo. Al contrario, le stesse cellule, sottoposte a stress ossidativo e
private della presenza della PCMT, mostrano un significativo accumulo di proteine
contenenti residui isoaspartilici. Grazie a tecniche di proteomica abbiamo identificato
una serie di substrati della PCMT che sono anche proteine antiapoptotiche cruciali
per l’inizio della cascata apoptotica, come Hsp70, Hsp90 e BclXL. Hsp70 è una
proteina che esercita prevalentemente funzione antiapoptotica, sia nella via
apoptotica intrinseca che in quella estrinseca (Arya et al., 2007; Ruchalski et al.,
2006). Hsp90 è una proteina coinvolta nell’attività antiapoptotica attraverso diversi
meccanismi (Arya et al., 2007; Beere et al., 2004).
BclXL rappresenta probabilmente il substrato di PCMT più interessante, prima di
tutto perchè esercita una diretta e potente attività antiapoptotica, ma soprattutto
33
perchè è una proteina il cui processo di deamidazione è stato abbastanza ben
caratterizzato e tale alterazione ha profonde implicazioni per il suo ruolo
antiapoptotico. Infatti è stato precedentemente riportato in letteratura che la
deamidazione di BclXL è una modifica critica nel pathway di segnalazione che porta
dal danno al DNA all’apoptosi. La deamidazione di BclXL comporta una profonda
modifica strutturale che compromette la funzione antiapoptotica di tale proteina. I
primi a far luce su questo importante aspetto furono Aritomi e collaboratori (Aritomi et
al,1997) che trovarono che Bcl-XL ricombinante di ratto esiste in due forme: la forma
nativa contenente residui di asparagina e la forma deamidata contenente residui
isoaspartilici anomali. I siti di deamidazione sono localizzati in due sequenze Asn-Gly
all’interno di una regione parzialmente flessibile della proteina. Queste due forme
migrano separatamente su gel di poliacrilammide in SDS, come osservato anche
mediante western blotting su proteine estratte da tessuti umani e di ratto (Sohma O.
et al., 1996; Mizuguchi M. et al., 1996), suggerendo che la deamidazione di Bcl-xL
può avvenire anche in vivo. In seguito fu dimostrato che Bcl-XL viene deamidata in
vivo con formazione di isoaspartato, e che i livelli della forma nativa e di quella
deamidata sono diversi nel carcinoma epatocellulare (Takehara T. & Takahashi H.,
2000). Mentre la forma nativa è in grado di proteggere le cellule dall’apoptosi in
quanto non viene alterata l’attività anti-apoptotica di Bcl-XL, quella deamidata
potrebbe bloccare l’attività anti-apoptotica della proteina e quindi favorire l’apoptosi.
Deverman e collaboratori (Deverman et al., 2002) dimostrarono che in cellule
tumorali la deamidazione di Bcl-xL indotta dal Cisplatino è determinante per l’azione
apoptotica di questi farmaci. Nel loro lavoro, il trattamento di cellule di osteosarcoma
(SAOS-2) con cisplatino portava ad un cambiamento nel pattern di migrazione di Bcl-
XL simile a quello osservato da Aritomi. Si iniziò ad ipotizzare che la presenza della
forma deamidata di BclXL poteva essere correlata con la morte cellulare. Gli autori
osservarono che lo shift nella migrazione di Bcl-XL era dovuto alla deamidazione
delle asparagine 52 e 66, che si localizzano all’interno della regione destrutturata
della proteina. La trasfezione di cellule SAOS-2 con costrutti esprimenti la proteina
deamidata ne bloccavano l’attività antiapoptotica. Recentemente è stato chiarito che
il meccanismo cellulare che è alla base della deamidazione di BclXL in vivo ha
origine da un danno al DNA che comporta l’iperespressione del trasportatore NHE-1
(carrier dell’antiporto Na+/H+) che produce un aumento del pH intracellulare che,
conseguentemente, facilita la deamidazione di Bcl-xL, scatenando l’inizio della
34
cascata apoptotica (Zhao et al., 2007). In base a questi dati e a quanto riportato nel
nostro lavoro, ipotizziamo che il meccanismo attraverso cui la PCMT funzioni come
effettore antiapoptotico comporti la regolazione della ripartizione della forma nativa
(attiva) e la forma deamidata (inattiva) di tali effettori antiapoptotici (Figura 11),
attraverso la riparazione della loro forma deamidata e che quindi tale enzima abbia
un ruolo regolatore fondamentale nel processo apoptotico, nel mantenere la stabilità
funzionale di proteine antiapoptotiche e ciò fa ipotizzare potenziali ma importanti
sviluppi terapeutici sulla base di questo meccanismo.
Figura 11. Sequenza di BclXL. Sono evidenziati i siti soggetti a deamidazione.
35
L’RNA interferenziale La genetica inversa (Reverse Genetics) rappresenta la via preferenziale per lo studio
della funzione biologica di una proteina e consiste nel determinare la funzione di un
gene, la cui sequenza è nota, generando un corrispondente mutante knockout ed
analizzandone il fenotipo.
La scoperta di metodi specifici di silenziamento genico ha aumentato la potenzialità e
l’efficienza dell’approccio “Reverse Genetics”.
L’RNA interference (RNAi) è un meccanismo di silenziamento genico sequenza-
specifico naturale, mediato da RNA a doppio filamento (dsRNA), ubiquitario negli
animali e nelle piante (figura 12).
L’interferenza basata su RNA può essere mediata principalmente:
• da doppi filamenti di RNA (siRNA) che possono essere regioni trasposoniche,
virus o sequenze iniettate artificialmente che promuovono silenziamento
attraverso la degradazione del trascritto.
• da microRNA che sono molecole di RNA a singolo filamento che si
conformano in strutture ad hairpin a causa di zone di complementarietà. I
36
miRNA vengono codificati dal genoma, sono abbondanti in tutti i tipi cellulari
(anche in cellule di mammifero) e regolano l’espressione di geni distinti
inibendo la traduzione in proteine.
Figura 12. Meccanismi di silenziamento genico indotto da RNA interference
37
La scoperta dell’RNAi La scoperta dell’RNAi avvenne nel tentativo di trovare nuovi metodi per studiare la
funzione di determinati geni in C. elegans (Figura 13) usando la tecnologia dell’”RNA
antisenso”. Studiando la funzione del gene par-1, Guo e collaboratori (Guo &
Kemphues, 1995) iniettarono l’RNA antisenso del gene stesso nel nematode. Questo
gene codifica per una serina-tirosina kinasi, implicata nell’asimmetria di divisione
cellulare (la prima divisione) a livello embrionale, generando cellule figlie diverse per
dimensioni, componenti citoplasmatiche e destino di differenziamento. Questo
esperimento, come atteso, determinò un fenotipo letale. Effettuando però il controllo
con l’iniezione del RNA senso, si ebbe sbalorditivamente lo stesso effetto. A quel
tempo, però, a causa delle limitate conoscenze, questo risultato fu attribuito ad
un’ipotetica saturazione dei fattori necessari alla traduzione di par-1. Tuttavia, già
prima di questi risultati fenomeni analoghi, che in futuro si sarebbero dimostrati
collegati con l’RNAi, erano stati osservati, ma erano rimasti senza spiegazione.
Nel 1996, il gruppo di ricerca di Jorgensen, (Jorgensen et al., 1996) nel tentativo di
aumentare l’attività del gene della calcolone sintasi (un enzima coinvolto nella
produzione di specifici pigmenti), introdusse dei transgeni in petunia.
Inaspettatamente la pigmentazione non aumentò, anzi si ebbe una variegazione del
colore e, in alcuni casi, la totale perdita di colore. Questo fenomeno fu definito “co-
soppressione”, intendendo la soppressione sia del gene introdotto, che di quello
endogeno. In seguito, la “co-soppressione” fu ricondotta al PTGS (post trascriptional
gene silencing) poichè, in tutti i casi, il fenomeno era il risultato di una degradazione
dell’RNA trascritto. Inoltre, questa degradazione post-trascrizionale era osservata per
transgeni espressi da piante, batteri o sequenze virali. Mentre si parlava di PTGS in
piante, un fenomeno molto simile denominato “quelling” (repressione) era già stato
osservato nei funghi (Pandit & Russo, 1992; Romano & Macino, 1992). Nel 1996,
Cogoni e collaboratori (Cogoni et al., 1996) nel tentativo di incrementare la
produzione di un pigmento arancione trasformarono una coltura di Neurospora
crassa con un plasmide contenente un segmento del gene al1 ottenendo come
risultato fenotipi albini. Questi risultati confermarono le precedenti osservazioni sul
silenziamento genico indotto da transgeni, e dimostrarono che altri meccanismi di
silenziamento, quali la metilazione del DNA non erano obbligatoriamente coinvolti
nella sua induzione.
38
Nel 1998 Fire e Mello catalogarono questi fenomeni isolati sotto un principio comune:
l’RNA interference (RNAi). Sempre lavorando su C. elegans, (Fire at al., 1998) essi
focalizzarono i loro studi sul gene unc22 (responsabile della produzione di una
proteina del miofilamento), il cui trascritto è presente in centinaia di copie nelle cellule
dei muscoli striati. Una diminuita attività del gene generava fenotipi con limitata
coordinazione motoria, mentre una totale perdita di funzionalità dello stesso si
mostrava in muscoli strutturalmente difettosi, compromettendone la motilità. I risultati
indicarono che l’introduzione di una soluzione contenente filamenti di RNA senso e
antisenso era almeno dieci volte più efficace del solo RNA a singolo filamento.
Analisi elettroforetiche mostrarono che, all’interno dell’organismo, il materiale
iniettato si conformava per la maggior parte come doppio filamento (dsRNA). Di
contro, osservarono che un tempo prolungato tra l’iniezione del filamento senso e di
quello antisenso dava un drastico calo di efficienza, fino alla totale assenza di effetto
. Questo fenomeno venne spiegato con il fatto che il ssRNA (single strand RNA)
viene rapidamente degradato nel citoplasma e che, presumibilmente, è necessaria la
struttura a doppio filamento per il riconoscimento da parte di un eventuale
meccanismo cellulare. Sorprendentemente, gli effetti di questa interferenza genica si
mostravano sia negli organismi trattati che, limitatamente, nella loro progenie,
nonostante la rapida degradazione dell’RNA nelle cellule embrionali, nel corso dei
processi differenziativi. Verosimilmente, pochissime erano le molecole di dsRNA
sufficienti a generare l’interferenza. La concentrazione delle molecole di dsRNA
utilizzate non sarebbe stata sufficiente, se il fenomeno dell’RNAi fosse stato di tipo
stechiometrico (tra dsRNA ed mRNA), come nel caso dell’antisenso. Questa
considerazione suggerì l’esistenza di una componente catalitica o di un evento di
amplificazione che rendesse possibile l’RNAi partendo da basse concentrazioni di
dsRNA. Gli stessi risultati si ottennero ripetendo l’approccio su altre proteine quali
fem-1, hlh-1 e unc-54.
39
Figura 13: Stadi di sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans; il nematode è uno dei principali modelli per lo studio della regolazione genetica durante gli stadi di differenziazione tissutale.
Per esaminare gli effetti dell’interferenza di dsRNA a livello cellulare gli autori
usarono linee transgeniche esprimenti due differenti green fluorescent proteins
(GFP) nei muscoli e, in altri casi, attraverso ibridazioni in situ. L’iniezione di dsRNA
specifica per la GFP generò una marcata riduzione della frazione fluorescente delle
cellule (Figura.14).
Tre importanti conclusioni furono tratte dal lavoro di Fire e Mello (1998):
1. il dsRNA complementare a sequenze promoter o introniche non produceva
un’interferenza rilevabile;
2. l’iniezione di dsRNA produceva la diminuzione o la totale eliminazione dell’mRNA
endogeno; per dimostrare ciò venne usato come trascritto bersaglio mex-3,
abbondante nelle gonadi e nei primi stadi embrionali, nei quali è facile eseguire
ibridazioni in situ. Nei soggetti iniettati con dsRNA derivato da mex-3 non venne
rilevato mRNA mex-3. Mentre individui iniettati con solo antisenso purificato di mex-3
mantennero comunque alti livelli di mRNA dello stesso (Figura15).
3. l’interferenza mediata da dsRNA riesce ad attraversare le barriere cellulari. Infatti,
l’iniezione di dsRNA (per unc-22, LacZ o GFP) nelle cavità della testa o della coda
produssero una specifica e consistente interferenza anche nella progenie,
diffondendo quindi fino agli organi riproduttivi.
40
Si è recentemente attribuita alla diffusione di questa interferenza il ruolo del gene
SID-1, probabile trasportatore intercellulare di sequenze iniziatrici dell’RNAi.
Figura 14. Analisi dell’RNA interference in tessuto e singole cellule. Progenie ottenuta da genitori iniettati con ds-RNA. a,d,g: giovane larva; b,e,h: adulto; c,f,i: parete cellulare di adulto ingrandita.
41
Figura 15. Effetto dell’interferenza dell’RNA di mex-3 sull’mRNA endogeno di embrioni di C. elegans. Ibridazione in situ con sonda specifica per l’mRNA di mex-3. a: Controllo negativo con assenza di sonda b: Embrione di genitori non iniettati (pattern di espressione di mex-3 normale). c: Embrione di genitori iniettati con RNA antisenso; la presenza di mRNA rispetto al fenotipo wild-type è calata ma resta comunque elevata.d: Embrioni di genitori iniettati con ds-RNA di mex-3B; mRNA di mex-3B assente nell’embrione.
42
Questo esperimento fu il primo nel suo genere e gettò le basi per la messa a punto di
metodi di silenziamento genico specifici attraverso l’applicazione di dsRNA esogeno,
applicabile ed espandibile a tutti gli organismi. Per l’importanza delle loro scoperte
Fire e Mello nel 2006 hanno vinto il Premio Nobel per la medicina e la fisiologia.
Studi successivi (Baulcombe et al., 1999; Zamore et al., 2000) spiegarono il
meccanismo base dell’RNA interference; questo avvenne con saggi su lisati di cellule
embrionali allo stadio S2 di Drosophila. In altri esperimenti si pose l’attenzione su
RNAs di ~25 nucleotidi presenti solo in piante soggette a co-soppressione ed assenti
nelle piante in cui non si presentava il fenomeno del silenziamento; da questi emerse
che l’mRNA endogeno veniva tagliato nella regione complementare al dsRNA e il
taglio era effettuato in un intervallo di 21-23 nucleotidi.
Molto presto, attraverso approcci genetici e molecolari, divenne chiaro il meccanismo
dell’RNAi. Si chiarirono così le basi di un meccanismo che da subito si capì essere
un potentissimo strumento ai fini della ricerca di base, ed una possibile alternativa a
strategie terapeutiche per malattie (come HIV e cancro) per le quali fino ad ora non si
è trovato un rimedio generale e mirato.
Meccanismo base dell’RNAi mediato da siRNA Il modello funzionale dell’RNAi consta di due fasi fondamentali: quella di “iniziazione”
e quella “effettrice”.
Nella fase iniziale, i dsRNA immessi nella cellula (in maniera diretta, attraverso
transgene o virus) vengono “digeriti” in corte molecole di dsRNA chiamate siRNA
(small interfering RNAs), lunghe da 21 a 23 paia di basi. Dati sperimentali provano
che i siRNA vengono prodotti dall’enzima Dicer (una ribonucleasi), membro della
super famiglia delle RNAsi III, (dsRNA- specifiche ribonucleasi), il quale taglia i
dsRNA attraverso una reazione ATP-dipendente. Successive rielaborazioni
degradano i siRNA a duplex di 19-21 bp con un prolungamento di due nucleotidi al
3’.
Nella fase effettrice, i duplex siRNA si legano ad un complesso nucleasico e formano
quello che viene chiamato “RNA-induced silencing complex”: RISC. Dopo tale
legame, i siRNA vanno incontro ad una denaturazione a singolo filamento (reazione
ATP-dipendente), necessaria per l’attivazione del complesso RISC. Inoltre, è
43
necessaria una fosforilazione al 5’ del siRNA duplex perchè esso possa incorporarsi
in RISC (Nykanen et al., 2001); questa modificazione è svolta da una chinasi
endogena (Schwarz et al., 2002). Il complesso così attivato, usando come stampo il
singolo filamento incorporato, va a tagliare filamenti di mRNA complementari allo
stesso (Figura.16). Il taglio avviene a circa 12 nucleotidi dal 3’ del siRNA antisenso.
Analisi biochimiche (Hutvagner et al., 2002) indicano che l’RNAsi presente nel
complesso RISC è diversa da Dicer.
Figura 16. Esemplificazione schematica del meccanismo dell’RNAi mediato da siRNA.
44
Geni coinvolti nell’RNAi
Gli “iniziatori”
Due geni di C. elegans, rde-1 e rde-4 si presuppongono coinvolti nella fase iniziale
dell’RNAi. Il gene rde-1 è membro di una grande famiglia di geni ed è omologo a
qde- 2 in Neurospora crassa (qde sta per “quelling deficient”) e ad AGO1 di
Arabidopsis thaliana (AGO sta per ARGONAUTE; AGO-1 è stato precedentemente
studiato come gene coinvolto nello sviluppo di Arabidopsis).
Anche se l’esatta funzione di questi geni non è ancora chiara, un gene studiato in
mammiferi, della famiglia di RDE-1, è stato identificato come fattore di iniziazione
dell’RNAi (Sharp et al., 2001; Sijen et al., 2001).
Gli “effettori” Geni importanti per la fase effettrice in C.elegans sono rde-2 e mut-7. Questi geni
sono stati identificati in esemplari eterozigoti che non erano in grado di trasmettere
l’RNAi alla progenie omozigote. Nematodi con rde-2 o mut-7 mutati si dimostravano
difettivi per l’RNAi. Mut-7 codifica per una proteina che ha omologia al dominio
nucleasico dell’RNAsi D e ad una proteina implicata nella sindrome di Werner
(progeria adulta), caratterizzata nel rapido invecchiamento dell’uomo (Grishok et al.,
2000).
RNA polimerasi – RNA dipendente: un sistema di amplificazione La potenza dell’RNAi, riscontrata in tutti gli esperimenti, è stata attribuita ad un
processo di amplificazione, proprio del meccanismo di interferenza. Questa
amplificazione può avere come bersaglio i dsRNA, al fine di produrre più siRNA, o i
siRNA stessi. In questo modo i complessi RISC hanno la possibilità di effettuare un
maggior numero di reazioni ribonucleasiche sequenza-specifiche (“tagli”). Recenti
indagini hanno dimostrato che i siRNA complementari all’mRNA bersaglio funzionano
da primer per un RNA polimerasi-RNA dipendente (RdRP) che trasforma l’mRNA in
dsRNA, il quale a sua volta sarà il substrato di Dicer. Questo passaggio amplifica
così la risposta dell’RNAi, la quale può autoalimentarsi fino a quando tutto l’mRNA
bersaglio non è degradato. Il silenziamento genico mediato da RNAi diventa così uno
dei più eleganti ed efficienti meccanismi in natura (Zamore et al., 2002).
45
Gli Argonauti
Gli argonauti sono proteine facenti parti di una grande famiglia, molto conservata, i
cui membri sembrano andare a formare la maggior parte del complesso RISC; esse
sono quindi implicate come effettori del processo di silenziamento ad opera dell’RNAi
ed in altri fenomeni correlati in molti organismi, come funghi, piante e mammiferi. I
ruoli degli Argonauti 1 e 2 (chiamati Ago1 e Ago2 in Drosophila) sono quelli meglio
definiti. Ago2 è stato identificato come una componente del complesso RISC,
essenziale per l’RNAi mediato da siRNA (Okamura et al., 2004). Ago2 è necessaria
alla denaturazione dei siRNA a doppio filamento ed alla loro integrazione nel
complesso (solo il filamento antisenso). Embrioni deficienti di Ago2 restano
comunque in grado di effettuare RNAi mediato da miRNA. Ciò suggerisce l’esistenza
di più proteine che svolgono un ruolo simile a quello di Ago2. Viceversa, Ago1,
indispensabile per il taglio dell’RNA guidato da siRNA, è anche richiesto per la
produzione di miRNA (Okamura et al., 2004). L’associazione di Ago1 con Dicer-1 e i
pre-miRNA suggerisce inoltre che Ago1 sia coinvolto nella biogenesi dei miRNA.
Gli Argonauti si mostrano anche coinvolti nello sviluppo e nel differenziamento
cellulare. Le proteine argonaute hanno dimensioni di circa 100 kD, altamente basiche
e contengono due domini comuni chiamati PAZ e Piwi (Cerutti et al., 2000). Il
dominio PAZ è costituito da 130 amminoacidi ed è stato anche identificato in Dicer
(Bernstein et al., 2001). Anche se non si conosce ancora l’esatta funzione del
dominio PAZ, si ipotizza che esso sia necessario per l’interazione proteina-proteina,
probabilmente per l’omo- o eterodimerizzazione (Cerutti et al., 2000). Essendo
queste proteine molto basiche, si pensa possano legare il DNA. Miwi, un omologo di
Piwi in topo, è stato trovato associato ad un complesso con l’mRNA bersaglio in vivo
(Deng & Lin, 2002); ciò ha fatto dedurre che il dominio Piwi sia implicato nel legare
l’mRNA bersaglio nel complesso RISC. Successivamente Ago1 si è scoperto legare
ribomopolimeri in vitro (Kataoka et al., 2001). Sicuramente le proteine argonaute
sono coinvolte nel processo dell’RNAi, sia indirettamente che direttamente, ma sono
comunque necessari ulteriori studi biochimici per poter scoprire la loro precisa
funzione nel metabolismo dell’RNA.
46
RNAi in cellule di mammifero In cellule di mammifero sono state riscontrate molte più difficoltà nell’indurre l’RNAi.
Questo perchè a seguito dell’introduzione di dsRNA, spesso a rispondere non è un
sistema di silenziamento sequenza-specifico, ma un sistema che inibisce tutta
l’espressione globalmente. In questi casi ad interagire con il dsRNA, introdotto in
cellule di mammifero, è una proteina kinasica (DAI o PKR) che va a scatenare la
risposta immunitaria dell’interferone bloccando globalmente la trascrizione. Un altro
evento di silenziamento genico osservato in mammiferi è quello mediato da una
ribonucleasi (RNAsi L), attivata da dsRNA, che agisce attuando una degradazione
non specifica dell’mRNA. Utilizzando invece i siRNA, i quali non azionano la risposta
interferonica, si è riusciti ad indurre il silenziamento sequenza-specifico. Questa
scoperta, è utile al fine di poter progettare metodologie di somministrazione umana a
scopo terapeutico. Attraverso lo studio dell’RNAi su colture di cellule umane HeLa, si
è capito che erano i siRNA, prodotti dall’enzima Dicer, a generare il fenomeno di
silenziamento genico.
siRNA : Applicazioni terapautiche
Attualmente si stanno sviluppando diversi approcci terapeutici basati sull’uso di
siRNA, tanto che recentemente sono stati riportati i successi di numerosi esperimenti
pilota. Questi sviluppi recenti nelle applicazioni terapeutiche di siRNA sono senza
dubbio imputabili al superamento di problematiche correlate con la veicolazione. Ad
esempio, il rilascio sistemico di quantità terapeutiche dei siRNA diretti contro la ApoB
negli scimpanzè, è stato recentemente realizzato attraverso l’uso di liposomi a
doppio strato (Higuchi et al., 2010). Il potenziale terapeutico degli siRNA è stato
ormai messo in evidenza in numerosi esperiementi-pilota e in trial che ne mostrano
l’efficacia nei confronti di diverse patologie fra cui la sclerosi laterale amiotrofica
(Prakash et al., 2010 ; Schwarz et al., 2007), la degenerazione maculare dell’anziano
(McFarland et al., 2004; Campochiaro et al., 2006) ed il cancro (Landen et al., 2010;
Kenny et al., 2010). Molto interessante e promettente è anche lo studio che ha
evidenziato l’efficacia di siRNA nei confronti dell’infezione del virus dell’HIV sia in
colture cellulari (Melki et al., 2010) che in pazienti affetti dalla patologia (DiGiusto et
al., 2010). Inoltre, sono in corso alcuni “trials” clinici che usano strategie già basate
47
su siRNA per quanto riguarda l’infezione da virus respiratorio sinciziale (RSV)
(Lusebrink et al., 2009). Nella tabella II sono riportate alcune patologie che
rappresentano possibili “target” terapeutici per siRNA, e le industrie farmaceutiche
che hanno realizzato gli studi sullo sviluppo di tali terapie (Hoyer et al., 2007;
Aagaard et al., 2007).
Tabella II. Sviluppo di terapie basate sui siRNA.
48
Problematiche relative all’uso di siRNA: Effetti al di fuori del
bersaglio dipendenti dalla sequenza di base
Varie importanti esperienze, in parte illustrate nel paragrafo precedente, hanno
aperto la strada al possibile impiego sistemico dei siRNA in terapia, tuttavia sono
state sollevate alcune problematiche, che ancora attendono una soluzione definitiva.
Il silenziamento dell’espressione di un gene è ottenuto progettando sequenze di
siRNA che hanno come obiettivo regioni codificanti e non codificanti degli mRNA con
perfetta complementarietà, per l’induzione di silenziamento genico post-
trascrizionale. Diverse organizzazioni commerciali, coinvolte nella realizzazione di
siRNA, forniscono “on-line” efficaci algoritmi di progettazione, che sono basati sulla
combinazione di sequenze “target” di mRNA e strutture di tipo secondario, siRNA
duplex con estremità stabili (Kim et al., 2007). Queste hanno come obiettivo
principale quello di minimizzare potenziali “off-target effects” (OTEs) dipendenti dalla
sequenza. Infatti il filamento guida dell’siRNA potrebbe funzionare come un miRNA
quando contiene una sequenza di base che si combina con le regioni 3′UTR
dell’mRNA, ma, allo stesso tempo, potrebbe condurre ad OTE dannosi attraverso la
repressione della traduzione o la degradazione aspecifica di mRNA estranei al target
atteso. È stato dimostrato che tali OTE non si verificano se il filamento guida si
accoppia con l’”open reading frame” (ORF) dei trascritti di mRNA di una determinata
cellula; dunque evitando che i siRNA di base si combinino esclusivamente con 3′UTR
dell’mRNA, e questo può essere ottenuto utilizzando algoritmi “on-line” che ricercano
3′UTR, potenzialmente si potrebbero ridurre, ma non necessariamente eliminare, gli
OTE dannosi.
È chiaro che devono essere effettuati studi preclinici estremamente accurati della
vitalità e della funzione cellulare. A oggi si può affermare che non sono stati riportati
casi di OTE dannosi nei “trials” preclinici o clinici precoci di siRNA (Grimm et al.,
2007; Burchard et al., 2009). Attualmente, la maggior parte dei RNAi proposti in
diverse applicazioni cliniche, derivano dall’incorporazione di siRNA a doppio
filamento di 21 nucleotidi, sintetizzati chimicamente, caratterizzati da due nucleotidi
sporgenti all’estremità 3′ (Figura 17 a). Ciò consente indubbiamente, da un lato la
sintesi su larga scala e dall’altro la produzione di molecole di siRNA con
caratteristiche uniformi e che successivamente possono essere sottoposte ad
49
alterazioni chimiche selettive con il fondamentale obiettivo di aumentarne la stabilità
(Figura 17).
Figura 17. Le molecole effettrici nell’interferenza ad RNA.
a) Piccoli RNA interferenti (siRNAs) sintetici vengono somministrati in vivo. Questi possono essere prodotti contenendo modificazioni chimiche come le 2’-O-metilpurine o 2’-fluoropirimidine, che possono essere aggiunte per aumentare la stabilità. Possono essere anche prodotti siRNA substrato per Dicer asimmetrici. Questi hanno un’estremità netta che include 2 basi del DNA, mentre l’altra estremità 3’ ha 2 nucleotidi che sporgono. Questo assicura che una singola specie di siRNA venga generata dal Dicer che processa l’estremità non sfalsata. RNA sintetici a forcina più lunghi (shRNAs) sono anche processati come substrati del Dicer. b) Vettori di espressione guidano alti livelli di espressione di shRNA mediante promotori della polimerasi III (Pol III). Lunghi RNA a forcina (lhRNAs) generano multiple specie di siRNA processati da Dicer, questo suggerisce che il Dicer dei mammiferi è processivo. Promotori multipli separati della Pol III possono essere usati in un singolo vettore per guidare l’espressione di diversi shRNA. Vettori che hanno promotori per la Pol II o Pol III generano RNA precursori più lunghi inclusi i trascritti di shRNA policistronici e micro-RNA (miRNA) mimetici che sono processati da Drosha e da Dicer.(da Daniel H.Kim and John J.Rossi. Nature Reviews, 2007).
50
I microRNA
I microRNA (miRNA) sono un’ampia classe di piccoli RNA non codificanti (21-25
nucleotidi) che regolano negativamente l’espressione genica a livello post-
trascrizionale, o inducendo la degradazione di specifici RNA messaggeri (mRNA)
codificanti per i geni-bersaglio, o impedendone la traduzione in proteina (He ed
Hannon, 2004; Kim et al., 2005, Peterson et al., 2006). Le prime evidenze
sull’esistenza dei miRNA risalgono alla scoperta di un piccolo RNA non codificante di
22 nucleotidi, chiamato lin-4, nel nematode C. elegans (Lee et al., 1993). Questo
piccolo RNA appaiandosi alla regione 3’ non tradotta (3‘UTR) dell’mRNA di LIN-14
(Ha et al., 1996), ne inibiva l'espressione durante i primi stadi dello sviluppo larvale
(Wightman et al., 1993; Moss et al., 1997). Successivamente, è stato scoperto che
lin-4 è in grado di regolare negativamente anche il gene lin-28 coinvolto in uno stadio
più avanzato dello sviluppo larvale di C. elegans (Griffiths-Jones, 2007). La maggior
parte dei miRNA identificati finora sono conservati tra specie evolutivamente vicine,
ma molti hanno omologhi anche in specie più distanti (Pasquinelli et al., 2000). Ad
esempio almeno un terzo dei miRNA di C. elegans presentano omologhi anche nella
specie umana, suggerendo che la loro funzione potrebbe essersi conservata nel
corso l'evoluzione delle linee evolutive animali (Lim et al., 2003). Ad oggi, nell’uomo
sono stati identificati circa più di 720 miRNA (http://www.mirbase.org - Sanger).
Centinaia di miRNA sono stati clonati e sequenziati (Bartel et al., 2004; Bentwich et
al., 2005) e le ricerche informatiche suggeriscono che il numero totale possa
addirittura superare le mille unità e che essi regolino dal 30% al 60% dei geni di tutto
il genoma (Lewis et al., 2005; Friedman et al., 2009). Numerosi dati sperimentali
dimostrano che i miRNA agiscono in numerosi processi cellulari, quali proliferazione,
apoptosi e differenziamento, e in molti processi fisiologici come il metabolismo e la
morfogenesi (sviluppo differenziamento e regolazione delle funzioni del sistema
nervoso, cardiovascolare e immunitario) (Ambros et al., 2004; Kloosterman et al.,
2006; Herranz et al., 2010). È stato dimostrato che i miRNA possono presentare
profili di espressione tessuto-specifici e diversificati in rapporto ai diversi stadi di
sviluppo; essi risultano inoltre modificati significativamente in varie patologie. Ciò
implica che, in generale, ciascun tessuto è caratterizzato da uno specifico set di
miRNA, il cui profilo di espressione è distintivo di quel tessuto (Rana et al., 2007).
Inoltre, i miRNA sono stati scoperti indurre silenziamento trascrizionale mediante
51
modificazioni del DNA e/o della cromatina in lievito, piante e animali (Noma et al.,
2004; Matzke et al., 2004; Pulukuri et al., 2007; Aravin et al., 2007).
Negli ultimi anni, numerosi studi hanno dimostrato il coinvolgimento dei miRNA in
diverse patologie, cardiovascolari, come l'ipertrofia cardiaca (Catalucci et al., 2009),
neurologiche, come l'Alzheimer (Lukiw et al., 2007), obesità e diabete (Xie et al.,
2009), ma soprattutto nel cancro (Esquela-Kerscher, 2006; Beezhold et al., 2010).
La biogenesi dei miRNA Il processo che conduce alla formazione dei microRNA maturi è stato recentemente
chiarito (Figura 18). I geni per i microRNA possono essere localizzati nel genoma
singolarmente o in cluster, in regioni intergeniche (cira il 70%) o addirittura, come
suggeriscono numerose evidenze, nelle sequenze introniche (circa il 30%) di
specifici geni (Figura 19) (Rodriguez et al., 2004).
Figura 18. La biogenesi dei miRNA
52
Figura 19. Organizzazione genica dei miRNA
53
I geni codificanti per i microRNA sono generalmente trascritti nel nucleo dalla RNA
polimerasi II (Pol II) in lunghi precursori: i pri-miRNA. Questi ultimi vanno incontro ad
un processo di maturazione, grazie all’intervento di un’endonucleasi (RNasi di tipo III)
chiamata Drosha, e dal suo cofattore DGCR-8 (Pasha in Drosophila), per formare un
trascritto di circa 70 nucleotidi chiamato pre-miRNA, il quale consiste di una struttura
a forcina imperfetta. Drosha è prevalentemente localizzata nel nucleo e presenta due
domini sequenziali con attività di RNasi III, un dominio di legame per gli RNA a
doppio filamento e un segmento N-terminale a funzione ancora ignota (Lee et al.,
2003). Sebbene il meccanismo mediante il quale Drosha riesca a discriminare i
differenti precursori dei microRNA sia ancora sconosciuto, sono sempre più
numerose le evidenze che sia proprio la struttura del pri-microRNA la responsabile di
questo riconoscimento. Infatti l’efficienza del processing da parte di Drosha dipende
dalla grandezza dell’ansa terminale, dalla struttura della forcina e dalle sequenze
fiancheggianti il sito riconosciuto di taglio, poiche è stato osservato che mutazioni
che alterano le caratteristiche di queste regioni inducono in maniera significativa
l’inibizione della sua attività (Zeng et al., 2003). Dopo questo passaggio iniziale, il
pre-microRNA viene esportato ad opera del trasportatore della famiglia delle RAN-
GTPasi Esportina 5 (Exp5), dal nucleo verso il citoplasma dove un’altra RNasi di tipo
III, Dicer, ne catalizza un ulteriore stadio di maturazione, che conduce alla
formazione di un piccolo (circa 22 nucleotidi) RNA a doppio filamento imperfetto
(duplex) (miRNA:miRNA*) contenente sia il filamento del microRNA maturo (miRNA)
che il suo complementare (miRNA*) (He & Hannon, 2004). La proteina Dicer, di circa
200 KDa, contiene due domini, RIIIa e RIIIb, ad attività RNasica, un dominio con
attività ATPasica ed elicasica, un dominio DUF283 a funzione ancora ignota, un
dominio C-terminale di legame con gli RNA duplex ed un dominio PAZ (Piwi-
Argonaute-Zwille). Quest’ultimo risulta essere fondamentale nel riconoscimento
dell’estremità 3’ coesiva generata dal taglio catalizzato da Drosha (Lingel et al.,
2003; Song et al., 2003) e potrebbe inoltre essere il responsabile del corretto
posizionamento della regione ad attività RNasica di Dicer sul sito di taglio del pre-
microRNA (Figura 20) (Carmell and Hannon, 2004).
54
Figura 20. Struttura della RNasi tipo III Dicer. a) Schema che riassume un possibile meccanismo del processamento del pre-miRNA da parte di Dicer. Il posizionamento dei domini RIII dimostra l’asimmetria della regione catalitica, con RIIIa che taglia il braccio discendente ed RIIIb quello ascendente del pre-miRNA (frecce rosse). b) Modello di interazione della RNasi III di batterio (Aquifex aeolicus) con RNA a doppio filamento. Questa interazione potrebbe essere molto simile a quella di Dicer. (tratto da Filipowicz et al.,2005).
55
L’ultimo stadio della formazione dei microRNA richiede l’ intervento di RISC (RNA
induced-silencing complex): il complesso multiproteico che induce il silenziamento
dell’RNA. La selezione del RNA messaggero bersaglio specifico e l’efficienza
funzionale di un microRNA, richiedono che il filamento maturo del microRNA,
proveniente dal duplex miRNA:miRNA*, sia selettivamente incorporato nel
complesso RISC (Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003). Il filamento
complementare miRNA* viene, al contrario, rapidamente degradato. Sebbene i
microRNA maturi possano essere codificati su ciascuno dei filamenti di RNA duplex,
è stato osservato che l’incorporazione preferenziale in RISC di uno rispetto all’altro, è
principalmente dovuta all’instabilità relativa delle estremità 5’, ovvero viene "scelta”
come microRNA attivo e maturo, la molecola dotata di minore stabilità alla sua
estremità 5’. Sono dunque le proprietà termodinamiche del microRNA precursore a
determinare l’assemblaggio asimmetrico di RISC e di conseguenza, la specificità del
mRNA bersaglio durante il meccanismo di inibizione post-trascrizionale (He and
Hannon, 2004). Com’è stato accennato precedentemente, il complesso RISC è
formato da una serie di proteine, fra le quali spiccano quelle della famiglia Argonauta
(Bernstein et al., 2001). Quest’ultime presentano due domini caratteristici conservati:
il dominio PAZ, presente anche in Dicer, ed il dominio Piwi. Il dominio PAZ, sia in H.
Sapiens (hAgo2) che in Drosophila, contiene un sito di legame per gli acidi nucleici,
mentre Piwi, considerando la sua omologia strutturale con la RNasi H, sembrerebbe
essere implicato nel processo di taglio del mRNA bersaglio (Song et al., 2004).
Meccanismo d’azione dei microRNA
Per il corretto funzionamento della regolazione da parte dei miRNA, risulta
fondamentale la sequenza dei primi 6-8 nucleotidi all’estremità 5’, definita seed
sequence, che si appaia in maniera perfettamente complementare con il sito di
legame sul 3‘UTR dell’mRNA bersaglio. Gli mRNA target sono riconosciuti dai
miRNA sottoforma di complessi ribonucleoproteici (miRNPs). I miRNA possono agire
essenzialmente in due modi: o inducendo la degradazione dell’mRNA bersaglio o
inibendo la sua traduzione (Figura 21). La scelta del meccanismo dipende dal grado
di complementarietà fra la sequenza del miRNA e quella del suo target. Infatti, i
miRNA che si legano con complementarietà perfetta determinano la degradazione
56
dell’mRNA bersaglio; in questo caso è presente un solo sito di appaiamento che
generalmente si trova sulla ORF (open reading frame) o sequenza codificante
dell'mRNA bersaglio. Questa modalità di azione è omologa a quella dell’RNA
interferente (RNA interference) e viene comunemente riscontrata nelle piante (Hake
et al., 2003). Invece, negli animali, generalmente i miRNA si appaiano in maniera
imperfetta al 3'UTR del target, bloccando la traduzione o impedendo l’associazione
del ribosoma con l'mRNA target, o inibendo l’inizio della traduzione. Quest'ultimo
caso comporta un prematuro distacco del ribosoma, blocco o rallentamento
dell'allungamento e degradazione della proteina in fase traduzionale. L'mRNA
represso sembra essere presente nei polisomi, ovvero associato con più ribosomi
(He e Hannon, 2004; Doench et al., 2004). Inoltre sembra che i miRNPs possano
avere altri effetti sugli mRNA target, come la promozione della deadenilazione, che
può determinare la degradazione dell'mRNA. Entrambi i fenomeni, deadenilazione e
degradazione, possono avere luogo nei "P-bodies", che sono loci citoplasmatici
arricchiti per fattori coinvolti nella degrazione degli mRNA (Figura 21)(Liu et al.,
2005).
Figura 21. Meccanismo di repressione post-trascrizionale dei miRNA. L'interazione tra il miRNP e l' mRNA puo' avere diversi effetti sulla traduzione: effetto diretto (a destra) e indiretto (a sinistra). In entrambi i casi gli mRNA target vengono regolati in due modi: o per degradazione o per inibizione della traduzione, che risulta nella prevenzione dell'associazione del ribosoma con l'mRNA target, o mediante l'inibizione dell' inizio della traduzione (P): P-bodies.
57
Predizione bioinformatica dei target molecolari dei microRNA
Per la caratterizzazione funzionale di un microRNA risulta essere determinante
l’identificazione accurata del suo o dei suoi mRNA bersaglio. Il fatto che negli
animali, i microRNA conducano la loro azione tramite complementarietà perfetta
solamente dei nucleotidi 2-7 o 2-8 della seed sequence, complica notevolmente lo
studio per l’individuazione dei geni bersaglio di ogni microRNA, poichè una sequenza
così corta potrebbe teoricamente essere complementare ad un numero enorme di
sequenze nei 3’UTR di tutto il genoma, conducendo all’identificazione di molti falsi
positivi.
Per cercare di ridurre e indirizzare correttamente questo studio, negli ultimi anni,
sono stati sviluppati una serie di programmi di predizione bioinformatica basati su
algoritmi matematici, come ad esempio TagetScan, PicTar e Miranda che
identificano gli ipotetici mRNA target di ogni specifico microRNA. Questi supporti
chMirnas.do), tengono in considerazione oltre che la complementarietà, alcuni
parametri importanti come la conservazione evolutiva fra varie specie e la stabilità
termodinamica dell’eteroduplex formatosi dall’interazione fra microRNA e 3’UTR;
anche se il target deve essere sempre successivamente validato da specifiche
metodologie sperimentali, questo tipo di analisi rappresenta certamente il primo
passo nello studio del ruolo funzionale di un microRNA.
Proprio mediante l’utilizzo della predizione bioinformatica è stato stimato che per
ciascun microRNA potrebbero esistere addirittura più di duecento differenti geni
bersaglio, che includono fattori di trascrizione, proteine secrete, recettori,
trasportatori e regolatori di vie intracellulari. Questa enorme variabilità suggerisce
che i microRNA possano essere coinvolti in quasi tutti i processi fisiologici della
cellula, definendo un controllo regolativo su circa un terzo degli RNA messaggeri di
tutto il genoma umano (Esquela-Kerscher and Slack, 2006). Per questo motivo un
aspetto che deve essere sempre tenuto presente è la presenza di effetti collaterali o
non desiderati (OFF-target) dovuti a un’ attività aspecifica del miRNA utilizzato. Il
miRNA utilizzato potrebbe agire, infatti, oltre che contro il trascritto di interesse,
anche contro altri trascritti, determinando una falsificazione del risultato. I motivi di
58
tutto ciò possono essere diversi, quali un’inibizione da parte del miRNA di altri
miRNA con parziale omologia di sequenza o una attività del miRNA sulla struttura
della cromatina che può portare ad un fenotipo alterato che può anche risultare
tossico. Per poter superare questi problemi è opportuno effettuare gli esperimenti
utilizzando linee cellulari umane che rispecchino il più possibile la condizione in vivo
e la minima quantità di miRNA funzionale (Nielsen et al., 2007; Burchard et al.,
2009).
MicroRNA e cancro
Fra i processi biologici in cui è stato dimostrato il coinvolgimento dei microRNA ne
spiccano alcuni, quali ad esempio l’apoptosi, il differenziamento e la proliferazione
cellulare (Li et al., 2010; Bhagavathi et al., 2010; Drummond et al., 2010), la cui
alterazione risulta essere frequentemente associata all’insorgenza ed allo sviluppo
della patologia tumorale. Negli ultimi anni, numerosi gruppi di ricerca hanno
osservato cambiamenti del profilo di espressione di microRNA singoli o in cluster in
vari tipi di tumore, come nel linfoma di Burkitt (Leucci et al., 2008), nel cancro del
colon-retto (Agostini et al., 2010), nei tumori metastatici del fegato (Bala et al., 2009),
nel cancro della mammella (Wright et al., 2010), nel carcinoma papillifero della tiroide
(Pallante et al., 2010), nel carcinoma epatocellulare (Li et al., 2009) e nel
glioblastoma (Novakova et al., 2009). Tutte queste evidenze hanno non solo
suggerito che i microRNA siano direttamente coinvolti nello sviluppo e progressione
tumorale ma hanno anche stimolato gran parte del mondo scientifico nella ricerca sia
delle cause che delle conseguenze biologico-funzionali dell’espressione cancro-
specifica dei microRNA. Infatti una più ampia delucidazione dei meccanismi
molecolari che agiscono a valle ed a monte potrebbero risultare di notevole interesse
per lo sviluppo di possibili future strategie diagnostiche e terapeutiche per la cura dei
tumori.
Le cause della deregolazione dell’espressione dei microRNA nello sviluppo tumorale
sembrano ancora scarsamente conosciute e probabilmente possono essere imputate
ad una serie di alterazioni che agirebbero singolarmente o insieme. Sono stati
descritti almeno tre differenti meccanismi che comprendono:
59
• la colocalizzazione di geni codificanti per microRNA e regioni genomiche
associate al cancro,
• la regolazione epigenetica,
• l’alterazione di proteine coinvolte nel processing e nella biogenesi dei
microRNA (Calin and Croce, 2006).
Più della metà dei geni che trascrivono per i microRNA risiedono in particolari regioni
genomiche che, nelle cellule cancerose, sono spesso soggette ad alterazioni (Calin
et al., 2004); possono comprendere regioni di LOH (loss of heterozigosity, perdità di
eterozigosità) che contengono geni onco-soppressori, regioni di amplificazione che
potrebbero contenere oncogeni, regioni comuni di rottura dei cromosomi e siti fragili
(FRA). I FRA rappresentano siti preferenziali di scambio fra cromatidi fratelli,
traslocazioni, delezioni, amplificazioni e integrazione di plasmidi a DNA e virus
associati al tumore come quello del papilloma umano (HPV) (Giarnieri et al., 2010).
Importanti evidenze hanno anche dimostrato un’associazione fra gli eventi
epigenetici e l’espressione dei microRNA; ad esempio Scott e collaboratori hanno
riportato che nelle cellule del carcinoma mammario l’inibizione dell’istone-deacetilasi
causa un’ ampia variazione dei livelli dei microRNA (Scott et al., 2006). Inoltre uno
studio condotto dal gruppo di Suzuki ha evidenziato tramite "microarray” che fra i
microRNA ipoespressi in cellule di cancro allo stomaco sottoposti a trattamenti con 5-
aza-2’deossicitidina e l’inibitore dell’istone deacetilasi acido 4-fenilbutirrico, spicca il
miR-34b/c. Il gene codificante per questo microRNA è localizzato all interno di
un’isola CpG. L’ipermetilazione del DNA nei dintorni del sito d’inizio della trascrizione
causa il silenziamento di questo specifico microRNA e ciò provoca un aumento nella
cancerogenesi del tessuto epatico (Suzuki et al., 2010).
Le alterazioni delle proteine che fanno parte del macchinario coinvolto nella
biosintesi dei microRNA producono effetti drammatici sull’espressione dei microRNA,
ed infatti è stato osservato che la mancanza del processing da parte di Drosha
potrebbe spiegare la ipoespressione dei microRNA osservata in molti tumori primari.
Anche la riduzione di Dicer nel tumore del fegato è stata associata ad una cattiva
prognosi con una ridotta sopravvivenza post-operatoria dei pazienti affetti da tale
neoplasia indicando che Dicer potrebbe essere in grado di prevenirne la
trasformazione maligna (Dedes et al., 2010). Le proteine Argonauta che, come è
stato detto precedentemente, sono componenti cruciali del complesso RISC, sono
state correlate con lo sviluppo di molti tipi di cancro. Tre geni di questa famiglia,
60
AGO3, AGO1 e AGO4, che si trovano in cluster sul cromosoma 1, sono spesso
deleti nei tumori di Wilms del rene e vengono frequentemente associati con i tumori
del neuroectoderma (Horikawa et al., 2008). Un altro gene della famiglia, HIWI1, che
è un ortologo umano del gene piwi di Drosophila melanogaster, mappa nella regione
genomica 12q24.33, che è un locus associato con il tumore delle cellule germinali
testicolari (Lee et al., 2006). Questo gene la cui espressione è specifica del testicolo,
è stato trovato sovraespresso in circa il 75% dei seminomi testicolari, che sono
tumori derivati da cellule germinali embrionali. Queste evidenze indicano che HIWI
potrebbe avere un attività oncogena e potrebbe normalmente funzionare nel controllo
della proliferazione ed il mantenimento delle cellule germinali.
Solamente una piccola parte dei microRNA fino ad oggi identificati è stata associata
con il proprio specifico ruolo biologico. Fra questi, molti dei microRNA che
presentano una variazione di espressione nei tumori, sembrerebbero essere coinvolti
nel controllo di vie di segnalazione intracellulare che hanno un’influenza diretta sulla
crescita cancerosa, come ad esempio la proliferazione e l’apoptosi e potrebbero
dunque funzionare da oncogeni o da oncosoppressori (Figura 22). E’ l’identificazione
del loro bersaglio molecolare che ci permette di distinguerli: in generale vengono
considerati miR oncosoppressori quei microRNA la cui riduzione di espressione,
rispetto ad una situazione fisiologica, causa la conseguente sovraespressione dei
livelli del loro bersaglio molecolare, un oncogene, direttamente implicato
nell’induzione di processi correlati con la trasformazione tumorale (Figura 22 b). Al
contrario gli oncomiR, come si può osservare nella figura 22 c , una volta attivati,
inibiscono specificamente degli oncosoppressori, impedendo quindi la loro funzione
di controllo delle normali attività cellulari, e causano l’ acquisizione da parte della
cellula di una o più caratteristiche neoplastiche.
61
Figura 22. I microRNA possono funzionare sia da oncosoppressori che da oncogeni. a) Nel tessuto non tumorale un equilibrio fisiologico di espressione dei microRNA conduce ad un normale tasso di crescita cellulare, di proliferazione, differenziamento e morte cellulare. b) La riduzione o la delezione di un microRNA che funziona da oncosoppressore induce lo sviluppo del tumore tramite l’inappropriata espressione della sua oncoproteina bersaglio. c) L’amplificazione del microRNA con ruolo oncogeno, elimina l’espressione del suo gene oncosoppressore “target", permettendo alla cellula l’acquisizione di una serie di caratteristiche neoplastiche quali l’aumento del tasso di crescita, dell’invasività e la resistenza all’apoptosi. Modificato da Esquela-Kerscher and Slack, 2006.
MicroRNA oncosoppressori
La prima evidenza che i microRNA potessero agire da oncosoppressori fu fornita dal
gruppo di Croce che dimostrò che pazienti affetti da una comune forma di leucemia,
la leucemia linfocitica cronica delle cellule B (CLL), presentano frequentemente
delezioni o ipoespressione del cluster intronico di microRNA comprendente miR-15a
e miR-16-1 (Calin et al., 2002). Il locus dove mappano questi due microRNA, il
13q14, risulta deleto in più del 65% dei casi di CLL come nel 16-40% dei mielomi
multipli ed il 60% dei carcinomi prostatici. In seguito è stato dimostrato che il miR-15a
62
e il miR-16-1 sopprimono il gene anti-apoptotico BCL2 la cui sovraespressione è
stata riscontrata in molti tipi di cancro incluse le leucemie ed i linfomi (Cimmino et al.,
2005). Dunque la delezione o la diminuizione dell’espressione di miR-15 e 16 induce
un’aumentata espressione del suo bersaglio molecolare, contribuendo allo sviluppo
della leucemia e del linfoma. Inoltre in alcuni pazienti è stata riscontrata una
mutazione ereditaria per sostituzione di una citosina in timidina sette basi a valle del
precursore del miR-16, che causa una riduzione dei livelli di espressione di questo
microRNA, rafforzando ancor di più il ruolo di miR-16 come oncosoppressore (Calin
et al., 2005). Recentemente (Aqeilan et al., 2010) è stato dimostrato che i miR-15 e
16 esercitano la loro azione di regolazione anche sull’espressione di altre proteine,
come la proteina antiapoptotica MCL1 che è essenziale per la sopravvivenza dei
neutrofili (Dzhagalov et al., 2007), la ciclina D1 (CCND1) che regola la progressione
del ciclo cellulare (Chen et al., 2008) e WNT3A che è una proteina implicata nella
progressione tumorale, stimolando sopravvivenza, proliferazione e invasione (Bonci
et al., 2008).
Anche i membri della famiglia dei microRNA Let-7, originariamente studiati per il loro
coinvolgimento nel processo di sviluppo del nematode C.elegans (Reinhart et al.,
2000), mostrano attività oncosoppressiva in quanto regolano l’espressione del noto
oncogene Ras. Le proteine Ras sono una famiglia di GTPasi di membrana che
regolano la crescita cellulare e il differenziamento. Circa il 15-30% dei tumori umani
presenta mutazioni di attivazione del gene Ras che inducono il processo di
trasformazione maligna (Esquela- Kerscher and Slack, 2006). I microRNA codificati
dalla famiglia let-7, che include dodici omologhi umani, sono considerati come
oncosoppressori poiché mappano su siti fragili correlati con il cancro del polmone,
della mammella, dell’utero e della cervice (Calin et al., 2004). Un’ancor più diretta
evidenza mostra che i trascritti di alcuni let-7 sono ipoespressi in maniera
significativa nel carcinoma polmonare e questa riduzione correla con una cattiva
prognosi (Takamizawa et al., 2004). In vitro, la somministrazione di let-7 inibisce la
proliferazione delle cellule di adenocarcinoma polmonare umano, tramite regolazione
specifica di Ras, suggerendo, per questo microRNA, un ruolo essenziale nel
prevenire lo sviluppo di tale neoplasia (Johnson et al., 2005). Nel loro complesso,
questi risultati, indicano che let-7 potrebbe rappresentare un promettente agente
terapeutico nel trattamento del carcinoma polmonare causato da mutazioni che
attivano il gene Ras. Un’ipotesi molto interessante è quella che l’ipoespressione di
63
let-7 possa rappresentare una caratteristica unica della progressione delle neoplasie
polmonari. Infatti un’analisi ad ampio spettro su tessuti prelevati da differenti tipi
tumorali, ha rivelato che la riduzione di let-7 è correlata prevalentemente con i
campioni di cancro polmonare e solo in maniera sporadica con gli altri tipi di tumori.
A supporto di questa ipotesi un’analisi per microarray ha mostrato anche che nessun
altro microRNA sembra così fortemente modulato nel carcinoma del polmone
(Johnson et al., 2005). Per queste ragioni, recentemente, attraverso l’uso di vettori
virali e nanoparticelle, si sta tentando di usare questo miRNA come potenziale
bersaglio terapeutico in vivo (Barh et al., 2010).
MicroRNA oncogeni
Numerose sono le evidenze riguardo al funzionamento dei microRNA come
oncogéni. Molte di queste sono associate all’alterazione di proteine ben note per il
loro coinvolgimento nella promozione dello sviluppo tumorale come ad esempio l
oncogene MYC. Quest’ultimo codifica per un fattore di trascrizione spesso mutato e
amplificato nei cancri umani, che è un importante regolatore della crescita cellulare
(Pelengaris et al., 2002). Una prima importante evidenza è stata suggerita dalla
scoperta che un tipo aggressivo di leucemia insorge quando MYC trasloca nel locus
del miR-142. Questa traslocazione inserisce il gene MYC immediatamente a valle
della sequenza codificante il pri-microRNA-142 e sotto il controllo dello stesso
promotore (Lagos-Quintana et al., 2003). La perdita di una regione conservata di
circa 20 nucleotidi che viene sostituita dalla traslocazione di MYC determina
l’abolizione del processing del miR, provocando l’incremento di espressione di MYC
e la trasformazione tumorale delle cellule di tipo B. Un altro noto microRNA, il miR-
155, è associato alla sovraespressione di MYC ed al cancro di questo tipo cellulare.
Questo microRNA è costituito da ventuno nucleotidi che sono parte del più ampio
RNA non codificante BIC (B-cell integration cluster), trovato sovraespresso nei
linfomi delle cellule di tipo B overesprimenti MYC (Wei et al., 2007). Il gruppo di
Metzler ha mostrato un incremento di espressione di circa cento volte del miR-155
nel linfoma di Burkitt, ed altri studi hanno dimostrato lo stesso andamento nel linfoma
di Hodgkin, e nel linfoma diffuso a cellule B grandi (Eis et al., 2005; Kluiver et al.,
2005; Van der Berg et al., 2003). Inoltre sembra che questo stesso microRNA possa
64
funzionare da oncogene in cooperazione con MYC nella tumorigenesi, mentre in
condizioni normali, durante la selezione delle cellule B, probabilmente inattiva geni
che contrastano l’azione di MYC. Un’overespressione di miR-155 è stata anche
osservata nel carcinoma mammario, in quello polmonare, della tiroide e del colon
(Eis et al., 2005; He et al., 2005; Volinia et al., 2006). Il meccanismo mediante il
quale BIC/miR-155 promuove lo sviluppo tumorale resta ancora sconosciuto.
Sebbene sia stato dimostrato che il recettore di tipo I dell’angiotensina II sia un
bersaglio molecolare del microRNA (Martin et al., 2006), non sembra che questo
possa essere il meccanismo regolatore essenziale per l’attività oncogenica del miR-
155, suggerendo che la ricerca di altri "target molecolari” sia importante
nell’individuare il suo specifico ruolo nella trasformazione maligna.
Due lavori hanno ulteriormente contribuito alla conferma della relazione fra miRNA,
espressione di MYC e cancro (He et al., 2005; O’Donnel et al., 2005; Mallana et al.,
2010). Dall’analisi di linee cellulari e tessuti di pazienti affetti da linfoma delle cellule
di tipo B è emerso che i microRNA maturi della famiglia 17-92, che comprende 7
microRNA i cui geni risiedono nell’introne 3 del gene C13orf25, mostrano un
sostanziale incremento di espressione rispetto a quella dei campioni di tessuti sani
(He et al., 2005). Allo stesso tempo è stato dimostrato che c-Myc induce
l’espressione di sei di questi stessi microRNA sul cromosoma 13, conducendo allo
sviluppo del linfoma umano (Mallana et al., 2010). Inoltre in cellule HeLa,
l’espressione del fattore di trascrizione E2F1 è regolata negativamente dal miR-17-
5p e dal mir-20, il che suggerisce un nuovo meccanismo mediante il quale MYC
contemporaneamente, attiva la trascrizione di E2F1 e allo stesso tempo ne limita la
traduzione, grazie alla induzione di miR-17-5p e di miR-20, esercitando così un
controllo molto fine sul segnale di proliferazione (Mallana et al., 2010). Woods e
collaboratori hanno proposto un modello in cui i microRNA del gruppo miR-17-92
promuovono la proliferazione cellulare spostando l equilibrio trascrizionale di E2F dal
ruolo antiapoptotico di E2F1 a quello proliferativo mediato da E2F3 (Woods et al.,
2007).
Anche per miR-21 è stato proposto e successivamente confermato dal punto di vista
biologico funzionale, un ruolo da "oncomir”. La prima evidenza è stata fornita dalla
forte sovraespressione riscontrata prima nel glioblastoma multiforme (Chan et al.,
2005) e poi nei campioni di tessuti di carcinoma della mammella rispetto a quelli sani.
L’inibizione del miR- 21 mediante utilizzo di specifici oligonucleotidi antisenso in
65
cellule di carcinoma mammario MCF-7 causa un aumento dell’apoptosi ed una
riduzione della crescita cellulare; questo è in parte dovuto alla deregolazione
dell’espressione di un target del miR-21, il fattore antiapoptotico Bcl-2 (Si et al.,
2007). Contemporaneamente un altro gruppo di ricerca ha dimostrato che nel
medesimo ambiente cellulare, miR-21 agisce ulteriormente andando ad inibire
direttamente l’espressione della tropomiosina 1, il cui ruolo fisiologico è quello di
ridurre la proliferazione cellulare (Zhu et al., 2007). L’incremento di espressione di
miR-21 è stata associata a molti altri tipi di tumori e allo stesso tempo sono stati
identificati molti altri bersagli molecolari come ad esempio l’ oncosoppressore PTEN
(Meng et al., 2006; Meng et al., 2007). Sembra infatti che l’azione oncogena di
questo microRNA sia ad ampio raggio e possa esplicarsi mediante un meccanismo
di regolazione pleiotropico, inibendo l’espressione di differenti oncosoppressori-
bersaglio nello stesso tipo di tumore od in tumori differenti (Selcuklu et al., 2009).
Altre evidenze riguardano il coinvolgimento dei microRNA e del loro ruolo oncogeno
negli stadi avanzati della progressione tumorale. Fra queste, sono di notevole
interesse quelle fornite dal gruppo di Weinberg che dimostrano il coinvolgimento del
miR-10b nell’indurre il processo di metastatizzazione del tumore della mammella;
infatti la sua iperespressione, in linee cellulari di carcinoma mammario non
metastatizzanti, causa un forte aumento del loro potenziale migratorio ed invasivo.
Questo microRNA, la cui espressione è indotta direttamente dal fattore di trascrizione
Twist, inibisce in maniera specifica la traduzione del mRNA di HOXD10, permettendo
così l’espressione di geni coinvolti nella risposta pro-metastatica (Ma et al., 2007).
Tutte queste osservazioni confermano che i microRNA possano essere classificati
come una famiglia di molecole direttamente attiva nella patologia del cancro,
essendo, come abbiamo visto, coinvolti in prima linea in molti dei processi e delle vie
molecolari che conducono allo sviluppo e progressione di un numero veramente
ampio di tipi tumorali. In futuro è lecito attendersi che la caratterizzazione di molti altri
microRNA e l’identificazione dei loro bersagli molecolari associati si rivelerà di
notevole importanza, non solo per la comprensione dei meccanismi molecolari che
sono alla base della trasformazione maligna, ma soprattutto per lo sviluppo di
strategie cliniche atte ad inibire la crescita tumorale.
66
SCOPO DELLA TESI Da numerosi dati di letteratura appare chiaro che la proteina antiapoptotica BclXL (al
pari di altre proteine implicate nel controllo dell’apoptosi) sia soggetta a
deamidazione. A differenza di quanto dimostrato in passato, a proposito di altre
proteine, la deamidazione di BclXL:
• non è sottostechiometrica, in quanto interessa una parte significativa delle
molecole di tale proteina presenti in un dato momento in una cellula.
• Non ha il significato di “danno molecolare” ma piuttosto di modifica post-
biosintetica che regola la funzione di tale proteina e, quindi dell’apoptosi.
A tale proposito è stato visto che la deamidazione di BclXL è innescata
specificamente da un meccanismo di iperespressione di una pompa protonica,
scatenata da condizioni di stress cellulare indotto da UV, in grado di alcalinizzare il
pH intracellulare, creando così un microambiente favorevole alla deamidazione
(Zhao et al., 2007). In accordo a tali considerazioni e sulla base di quanto
precedentemente dimostrato in un nostro recente lavoro (Cimmino et al., 2008), la
PCMT è in grado di riconoscere e riparare la proteina BclXL deamidata, spostando in
questo modo l’equilibrio del sistema verso l’antiapoptosi. In base a quanto detto
dunque, la PCMT non rappresenta semplicemente una metiltrasferasi di riparazione,
ma è un enzima che regola l’apoptosi (come mostrato in figura 23).
Figura 23. PROPRIETA’ REGOLATIVE DI PCMT NELL’APOPTOSI. Modificata Da: Cimmino et al PlosOne 2008.
67
Tale ipotesi comporta tre importanti implicazioni. La prima è che risulta fondamentale
individuare i meccanismi che, a loro volta, regolano l’espressione e l’attività
“antiapoptotica” della PCMT. La seconda considerazione riguarda l’importanza di
chiarire se tali meccanismi possano modulare efficacemente l’espressione della
PCMT e quindi la “riparazione regolativa” dei suoi substrati, incluso BclXL. L’ultimo
aspetto che merita di essere approfondito riguarda l’individuazione delle condizioni e
delle potenziali strategie per un futuro impiego di inibitori della PCMT, al fine di poter
agire sull’espressione di tale metiltrasferasi in cellule e tessuti patologici, in quanto,
ottenere una modificazione del pattern apoptotico può avere, in prospettiva, un
significato terapeutico.
Finora lo sviluppo d’inibitori enzimatici per la PCMT non ha portato a risultati di
rilievo, in quanto:
• l’adenosilomocisteina (AdoHcy) e i suoi analoghi e congeneri (es: 5’-
metiltioadenosina) sono poco selettivi e inibiscono tutte le metiltrasferasi
AdoMet-dipendenti (Perna et al., 1995; Perna et al., 1993), di conseguenza la
tossicità in vivo è spesso elevata e l’intervallo terapeutico alquanto ridotto.
• Gli isopeptidi e i loro analoghi sono poco stabili nelle cellule e non
particolarmente potenti come inibitori. Inoltre è possibile che siano in molti casi
tossici alle dosi efficaci (Murray et al.,1984; Lowenson et al.,1992).
• Gli oligonucleotidi antisenso, certamente utili come strumenti di ricerca,
probabilmente non offrono un buon approccio per una futura utilizzazione in
vivo, in quanto instabili e generalmente poco efficaci come agenti in grado di
reprimere l’espressione genica (Cimmino et al., 2008).
• I geni antisenso sono di difficile, se non impossibile, uso in vivo e sono poco
efficaci, al pari degli oligonucleotidi antisenso.
Quindi né gli oligonucleotidi antisenso, nè i geni antisenso sono possibili candidati di
regolazione dell’espressione in vivo della PCMT.
Per questi motivi abbiamo identificato nell’RNA interferenziale un potenziale
strumento di ricerca nella modulazione dell’espressione della PCMT. Infatti, i siRNA
offrono un valido approccio strumentale allo studio della regolazione della PCMT e
quindi delle funzioni a cui essa è preposta, in particolare al controllo dell’apoptosi. I
miRNA, d’altro canto, offrono un’importante possibilità di regolazione endogena della
PCMT, posto che vi siano i presupposti teorici, individuabili bioiformaticamente, per
un loro ruolo biologico in tal senso. Sia i siRNA (e i loro precursori) sia i miRNA,
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potrebbero, una volta dimostrata la loro capacità di regolare l’espressione della
PCMT, costituire la base per la messa a punto di utili strumenti di impiego futuro in
terapia genica.
Lo scopo di questa tesi e’ dunque quello di investigare e chiarire il potenziale ruolo dell’RNA interferenziale nella regolazione dell’espressione della PCMT,
nonché di definire, utilizzando modelli di biochimica cellulare, le basi molecolari, i limiti e le prospettive d’impiego di tali molecole, nonchè dei loro potenziali bersagli, nella modulazione dell’apoptosi in cellule tumorali.
69
MATERIALI E METODI Linee cellulari
Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando la linea cellulare di
epatocarcinoma umano (HepG2). Tali cellule sono state fatte crescere in DMEM
(Gibco) ad alto contenuto di glucosio, contenente 10% di Fetal Bovine Serum
(Gibco), 1% di glutammina (Gibco),1% di penicillina/streptomicina (Gibco), 1% di
fungizone (Gibco). Le colture sono state mantenute in un incubatore umidificato a
37°C al 5% di CO2.
Silenziamento transiente mediante la trasfezione di oligonucleotidi a doppio filamento short interfiring RNA (siRNA) o plasmidi contenenti short hairpin
RNA (shRNA) con HiPerFect Trasfection Reagent (Qiagen). La trasfezione è stata effettuata utilizzando cellule HepG2 piastrate in multiwell da 6
pozzetti. E’ stato applicato il Fast-Forward protocol (che consiste nel mettere in
coltura in piastra e contemporaneamente trasfettare le cellule), secondo le
indicazioni della casa produttrice. Brevemente, prima della trasfezione le cellule sono
state contate e, per ogni pozzetto della mutiwell da 6, sono state messe in piastra
circa 2,5×105 cellule in mezzo completo contenente siero ed antibiotici. Per il breve
lasso di tempo prima della trasfezione le cellule sono state incubate nelle normali
condizioni (a 37°C e 5% di CO2). Intanto è stata preparata la seguente soluzione:
-1µg di plasmide contenente gli shRNA o 150 ng di siRNA diluiti in 100 µl di DMEM
senza siero, (in questo modo i siRNA avranno una concentrazione finale 5nM).
-A questa soluzione sono aggiunti 12 µl di HiPerFect trasfection reagent.
Questa soluzione è lasciata ad incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente per
permettere la formazione del complesso.
La soluzione è aggiunta alle cellule in coltura e l’incubazione è continuata per 96 ore,
per permettere ai siRNA o agli shRNA di silenziare efficacemente la PCMT. Le
cellule sono quindi state raccolte ed analizzate mediante Real Time PCR e Western
Blotting.
L’esperimento è stato ripetuto in triplicato.
I siRNA (Qiagen) utilizzati contro il trascritto della PCMT sono i seguenti:
Il siRNA (Qiagen) utilizzato come controllo positivo contro il trascritto della MAPK1 è :
Hs_MAPK1 senso: UGCUGACUCCAAAGCUCUGdTdT
Hs_MAPK1 antisenso: CAGAGCUUUGGAGUCAGCAdTdT
Il siRNA random (Qiagen) utilizzato come controllo negativo era coniugato con
AlexaFluor488 per monitorare l’efficienza di trasfezione attraverso microscopio a
fluorescenza.
Estrazione dell’RNA L’estrazione dell’RNA è stata effettuata mediante metodica Trizol (Invitrogen).
Brevemente, dopo aver allontanato il mezzo di coltura, le cellule sono state lavate in
PBS e lisate con 1 ml di Trizol. Successivamente l’RNA è stato separato mediante
aggiunta di cloroformio, centrifugazione e successiva precipitazione in isopropanolo.
Il pellet è stato lavato in etanolo 70% e risospeso in H2O DEPC. La concentrazione è
stata determinata mediante lettura allo spettrofotometro UV/VIS Nanodrop ND-1000
(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).
Sintesi del cDNA
La reazione di retro-trascrizione permette di convertire, a partire da RNA totale
estratto dalle cellule, le molecole di mRNA in DNA complementare (cDNA), su cui è
poi possibile l’analisi dei livelli dei singoli messaggeri, attraverso reazioni di
amplificazione mediante PCR in tempo reale (real time PCR). La sintesi di cDNA è
stata eseguita utilizzando il kit QuantiTect reverse transcriptase (Qiagen) , secondo il
protocollo suggerito dal produttore, partendo da 1µg di RNA totale estratto.
Analisi del livello di silenziamento del gene PCMT mediante Real Time PCR La Real Time PCR è una metodica quantitativa che unisce alla PCR convenzionale
la rivelazione mediante fluorescenza del prodotto amplficato in tempo reale. In
questo modo il prodotto di amplificazione viene rivelato e quantificato
contemporaneamente alla sua sintesi. La misura viene quindi effettuata durante tutta
71
la fase esponenziale di amplificazione e il relativo risultato calcolato in una fase della
cinetica nella quale nessun reagente è limitante, risultando pertanto uniforme e
riproducibile. Gli esperimenti di real time PCR sono stati condotti utilizzando, quale
agente intercalante fuorescente, il SYBR GREEN, il quale si intercala
esclusivamente nel DNA a doppia elica ed emette fluorescenza solo quando è
incorporato nella doppia elica e non quando è libero. La fluorescenza emessa dal
SYBR GREEN legato al DNA amplificato è rivelata durante la fase di elongazione ad
ogni ciclo, e questo permette di monitorare l’accumulo del prodotto amplificato. Il
risultato di un esperimento di Real Time PCR viene riportato in un grafico in cui i
valori di fluorescenza sono messi in relazione al numero di cicli di amplificazione. Il
ciclo al quale la fluorescenza si innalza rispetto al background è definito ciclo soglia,
calcolato rispetto alla tangente al punto di flesso della curva all’inizio della fase
esponenziale, ed è inversamente proporzionale alla quantità del campione di
partenza. Maggiore è la quantità di cDNA iniziale, più basso è il numero di cicli
richiesto affinchè la fluorescenza si innalzi al di sopra del valore soglia. Le differenze
nell’espressione del gene oggetto di studio sono determinate in seguito a
normalizzazione rispetto ad un gene costitutivo scelto come riferimento; in questo
caso è stato utilizzato il gene codificante per la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi
(GAPDH).
Tutte le amplificazioni sono state condotte con il termociclatore iCycler (Bio-Rad),
con sistema di rilevazione della fluorescenza iCycler iQ real time PCR. La mix di
reazione contiene 1 µl di cDNA, 0,3 µM di ciascun primer, 12,5 µl della Master mix
QuantiTect SYBR GREEN (Qiagen) e H2O DEPC per un volume finale di 25 µl.
Le sequenze dei primer utilizzati sono state le seguenti:
GAPDH senso (5’- TTGGTATCGTGGAAGGACTCATG-3’)
GAPDH anti (5’- CAGTAGAGGCAGGATGATGTTC-3’)
Per PCMT è stato utilizzato il QuantiTect Primer Assay (Qiagen), contenente una mix
dei primers senso e antisenso specifici per la sequenza del gene.
Le condizioni di amplificazione sono state:
95°C per 15 min, seguito da 35 cicli di:
-95°C per 30 sec
-55°C per 30 sec
-72°C per 30 sec.
72
I valori ottenuti da misure effettuate in triplicato per il gene d’interesse (GOI) in
ciascun campione sono state normalizzate per i livelli dell’mRNA del gene costitutivo
GAPDH, anch’esse ottenute in triplicato, e secondo la formula:
Relative Expression = 2-(S ΔCt-C
ΔCt)
Laddove:
Ct = ciclo soglia (threshold cycle) misurato al punto di flesso dell’inizio della fase
logaritmica
ΔCt = GOI Ct –HKG Ct
S ΔCt-HKG ΔCt = Sample ΔCt-Control ΔCt
GOI (gene of interest)
HKG (Housekeeping gene)= GAPDH
L’espressione relativa della PCMT è stata quindi calcolata in campioni di cellule
HepG2, dopo trasfezione con due tipi di siRNA (Qiagen) contro PCMT. Ciascun
valore ottenuto è stato normalizzato per il controllo interno (gene HKG:GAPDH) e
quindi è stata calcolata l’espressione genica relativa, considerando come controllo
“C”, il livello di espressione della PCMT in cellule trasfettate con un siRNA random,
che rappresenta il controllo negativo in quanto le cellule subiscono lo stesso
trattamento (la trasfezione) ma non il silenziamento del gene di interesse (GOI =
PCMT).
Preparazione degli estratti cellulari Dopo la trasfezione (sia con i siRNA contro PCMT che con i pre-miRNA15-16 e gli
anti-miRNA15-16), le cellule di epatocarcinoma HepG2 sono state staccate
utilizzando uno screaper , quindi raccolte in PBS, centrifugate (1000 rpm per 5
minuti) in una cetrifuga 5810 (Eppendorf) e risospese in un tampone di lisi
contenente: Tris-HCl 10mM ph 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X 100 1%,
Glicerolo 10% ed un cocktail di inibitori delle proteasi 1x (Roche) per 30 minuti a 4°C.
Le cellule sono state poi omogeneizzate mediante sonicazione (Sonicator, Ultrasonic
processor XL). La concentrazione proteica è stata determinata secondo il metodo di
73
Bradford (1976), usando il reattivo Protein assay kit della Bio-Rad Laboratories
(Richmond, CA, USA).
Western Blotting Aliquote di lisati di cellule HepG2 corrispondenti a 40 µg di proteine totali, sono state
trattate mediante aggiunta di una soluzione contenente: Tris-HCl ph 6.8 2M, SDS
20%, β-mercaptoetanolo, glicerolo e blue di bromo fenolo 5% e denaturate 5 minuti a
95 °C. Le proteine sono state separate mediante elettroforesi verticale su gel di
poliacrilammide (SDS/PAGE) secondo Laemmli, utilizzando un resolving gel al 12%.
La corsa elettroforetica, avveniva in un tampone di corsa costituito da glicina 192
mM, Tris 25 mM ed SDS 0.1%. Dopo la separazione elettroforetica le bande
proteiche sono state elettrotrasferite su una membrana di nitrocellulosa (Hybond-
Extra, GE-Healthcare), in Trans-Blot system apparatus (Bio-Rad), a 100 V per 1h a
freddo, in lieve agitazione su piastra magnetica, impiegando, come tampone di
trasferimento, metanolo 20% e TrisGlicina 5%. Dopo il trasferimento la membrana di
nitrocellulosa è stata colorata con Rosso Ponceau per 5 minuti, decolorata e lavata in
acqua distillata e incubata overnight a 4°C sotto agitazione continua, in una
L’attività specifica della PCMT è stata determinata, in vitro, secondo la procedura del
saggio di diffusione di vapore descritta da MacFarlane (1984).
Il principio del saggio si basa sulla reazione catalizzata dalla PCMT:
PCMT
substrato metilaccettore prodotto metilato
AdoMet AdoHcy
Alla reazione sovracitata segue quella di idrolisi dei metilesteri con diffusione di
metanolo. La reazione si lascia avvenire per un tempo sufficientemente breve
affinché si mantenga la velocità iniziale e non vada a completezza, in presenza di
substrato e donatore di metili non limitanti per l’enzima; in questo modo, la quantità di
substrato metilato dipende esclusivamente dalla quantità d’enzima presente,
pertanto la quantità di metanolo derivante dall’idrolisi è direttamente proporzionale
alla quantità di PCMT; inoltre, in tali condizioni, la concentrazione
dell’adenosilomocisteina formatasi, che rappresenta ad alte concentrazioni un
competitore dell’enzima, è considerata trascurabile.
La miscela del saggio, il cui volume finale è di 40 µl, contiene:
• 20 µl di ovalbumina (80mg/ml) come substrato metil accettore
• 3 µl di AdoMet (substrato donatore di metili), radiomarcata nel gruppo metilico,
in concentrazioni saturanti (300 µM finale;100 cpm/pmol)
• tampone sodio citrato 0.1M a pH 6.0
• 17 µl di lisato cellulare (concentrazione proteica 3-7mg/ml) quale fonte di
enzima.
La reazione è interrotta dopo 10 minuti di incubazione a 37°C con l’aggiunta di un
egual volume (40µl) di soluzione 0.2M NaOH e SDS 1% (stop solution); in seguito 60
µl della miscela sono pipettati su filtrini di carta (Filter paper BioRad) e disposti in
fiale da scintillazione da 20 ml, contenenti 6 ml di liquido di scintillazione. Le fiale
sono chiuse rapidamente e lasciate ad incubare per 2 h a temperatura ambiente, in
75
modo da consentire l’idrolisi quantitativa dei metilesteri e la diffusione completa nella
fase liquida del metanolo radioattivo prodottosi. In tali condizioni, esiste una precisa
relazione stechiometrica tra l’incorporazione di gruppi metilici nella proteina metil
accettrice e il metanolo radiomarcato recuperato. Al termine dell’incubazione, i filtri
sono rimossi e l’attività metiltransferasica quantificata sulla base della misura della
radioattività del [metil14C] metanolo trasferito, per diffusione di vapore, nel liquido di
scintillazione. I risultati sono espressi come Unità di attività enzimatica (U) /mg di
proteina (1U=1pmol di metil esteri formati/minuto) e come DPM/mg di proteina.
Analisi di spettrometria di massa Incubazione dello standard BclXL in buffer di deamidazione e in buffer neutro.
Per riuscire a distinguere nella proteina standard BclXL la forma nativa da quella
deamidata si è proceduto alla preparazione di due campioni. Il primo campione è
stato deamidato in una soluzione altamente alcalina per 6h secondo il protocollo di
Aswad et al., 1993, l’altro campione è stato invece incubato per 6h in una soluzione
a ph neutro. I due campioni al termine dell’incubazione sono stati quindi liofilizzati per
la successiva analisi.
Digestione in soluzione dei campioni Dopo che i campioni sono stati liofilizzati, essi sono stati trattati a 37°C per 12 ore
con una soluzione 1mg/ml di tripsina (che taglia i residui Lis-Arg) in NH4CO3
(AMBIC) 50mM a pH 8 per dividere la proteina in peptidi. Successivamente il
campione viene bollito a 99°C per 5 minuti e nuovamente liofilizzato e lo si sottopone
ad una seconda reazione di idrolisi con una soluzione 1mg/ml di Asp/N in NH4CO3
(AMBIC) 50mM a pH 8 a cui si aggiunge al volume finale 10% di acetonitrile per
attivare l’enzima. L’enzima riconosce e taglia i residui iso-Asp delle proteine.
Analisi mediante Matrix Assisted Laser Desoption Ionizzation (Maldi/MS)
I peptidi ottenuti dall’idrolisi sono stati acidificati in acido trifluoroacetico (TFA) 20% e
caricati negli appositi pozzetti della piastra portacampioni dello spettrometro,
mescolati ad 1 ml di matrice (acido a-ciano-4-idrossicinnamico 10 mg/mL sciolto in
una miscela di 70% acetonitrile e 30% acido trifluoroacetico 0.2%).
La miscela peptidica è stata fatta essiccare all’aria per permettere la cristallizzazione
della matrice in cui il campione resta intrappolato.
La piastra è stata inserita nella camera di ionizzazione dove, in condizioni di elevato
vuoto, il campione è bombardato mediante un raggio laser.
76
L’intervallo di m/z analizzato è stato calibrato mediante standard interni aventi un
determinato valore di m/z. Gli spettri sono stati acquisiti tramite uno spettrometro di
massa MALDI Voyager DE-PRO (Applied Biosystems) che utilizza una sorgente di
ionizzazione laser equipaggiata con un analizzatore a tempo di volo in grado di
separare gli ioni in modalità reflectron.
Saggio di metilesterificazione delle proteine cellulari Il saggio di diffusione di vapore di MacFarlane (1984) descritto precedentemente è
stato utilizzato in questo caso per determinare la quantità di isoaspartili presenti nella
proteina BclXL standard dopo che quest’ultima è stata lasciata ad incubare in un
buffer altamente basico per indurne la deamidazione (Aswad et al., Protein science,
1993). I residui L-isoaspartilici nelle proteine infatti, possono essere rilevati
direttamente utilizzando la PCMT quale probe enzimatico specifico in saggi in vitro. I
residui amminoacidici danneggiati sono riconosciuti e metil esterificati specificamente
dalla PCMT che usa adenosilmetionina, marcata radioattivamente, quale donatore di
gruppi metilici. In questo caso però il saggio è stato eseguito incubando lo standard
proteico con PCMT ricombinante umana in presenza di un eccesso di
adenosilmetionina radiomarcata nel gruppo metilico e la reazione è stata fatta
avvenire per 90 minuti, in modo che andasse a completezza e che tutto il substrato
disponibile fosse metilato; in tali condizioni, la quantità di prodotto metilato marcato
rappresenta la quantità di proteine danneggiate presente nel campione cellulare,
pertanto, la quantità di metanolo prodotto nella successiva idrolisi, è direttamente
proporzionale alla quantità di proteine danneggiate presenti negli estratti cellulari.
PCMT ricombinante umana
estratto cellulare prodotto metilato
AdoMet AdoHcy
Il saggio è stato effettuato, in vitro, in un volume finale di 90 µl contenente :
• circa 1 µg di standard proteico
• 8U di enzima PCMT
• 47,07 µmol/l di [14C-metil]AdoMet
• 60 µl di tampone sodio citrato 0.4M, pH 6.0
77
La miscela è stata incubata a 37°C per 90 minuti e la reazione bloccata aggiungendo
90 µl di una soluzione 0.2 M NaOH ed SDS 1% (stop solution) . Sono stati poi
pipettati su filtrini di carta (filter paper BioRad) 135 µl della miscela e disposti in fiale
da scintillazione da 20 ml, contenenti 6 ml di liquido di scintillazione. Le fiale sono
chiuse rapidamente e lasciate incubare 2h a temperatura ambiente, in modo da
consentire l’idrolisi quantitativa dei metil esteri e la diffusione completa nella fase
liquida organica del metanolo radioattivo prodottosi. In tali condizioni, come nel
saggio precedente, esiste una relazione stechiometrica tra l’incorporazione dei
gruppi metilici nella proteina metil accettrice ed il metanolo marcato recuperato.
Terminata l’incubazione, i filtrini sono rimossi e l’attività metiltransferasica
quantificata sulla base della misura della radioattività del [14C-metil] metanolo
trasferito per diffusione di vapore nel liquido di scintillazione. A tal scopo è stato
utilizzato un contatore a scintillazione in fase liquida (Wallack, mod. LS 7800).
L’unità di attività enzimatica è stata definita come 1pmol di gruppi metilici
trasferiti/minuto. I risultati sono espressi in pmol di gruppi metilici incorporati/mg di
proteine.
Predizione bioinformatica per identificare i potenziali miRNA di cui la PCMT potesse essere il bersaglio. La PCMT come target molecolare dei microRNA15-a e microRNA-16-1 è stata
identificata utilizzando diversi software di predizione accessibili pubblicamente on
line. In particolare ho utilizzato i software TargetScan, MiRanda e PicTar.
Il software TargetScan combina la predizione di struttura (modeling) dell' eteroduplex
miRNA- mRNA, basata sulla termodinamica, con un' analisi comparativa di
sequenza, basata sulla conservazione tra specie.
Il software miRanda si compone di tre fasi fondamentali: a) l'identificazione di una
sequenza che può essere legata da un miRNA; b) il calcolo della energia libera per la
formazione dell' eteroduplex miRNA-mRNA; c) l'individuazione della conservazione
evolutiva.
Infine il software PicTar, in cui gli mRNA bersaglio vengono predetti prima in base a
una ottimale energia libera di legame, e vengono poi testati statisticamente usando
un allineamento del genoma di otto vertebrati per filtrare i falsi positivi.
78
Trasfezione transiente con pre-miRNA15/16 e antago-miRNA15-16 per
verificare e valutare l’entità dell’interazione tra la PCMT e i miRNA15-16. La trasfezione è stata effettuata utilizzando cellule HepG2 messe in piastra in
multiwell da 6 pozzetti. E’ stato utilizzato come reagente di trasfezione il TransIT-LT1
trasfection reagent MIRUS secondo le indicazioni della casa produttrice.
Brevemente, 24h prima della trasfezione le cellule sono state contate e, per ogni
pozzetto della mutiwell da 6 sono state piastrate circa 1,5×105 cellule in mezzo
completo contenente siero e antibiotici per ottenere il giorno seguente una
confluenza di circa il 60%. Le cellule sono state incubate overnight nelle normali
condizioni (a 37°C e 5% di CO2).
Il giorno seguente sono state preparate le seguenti soluzioni:
• A 250 µl di Optimem (Gibco) sono stati aggiunti 7,5 µl di TransIT-LT1
trasfection reagent e lasciati incubare per circa 20 minuti a temperatura
ambiente.
• Ciascun pre-miRNA 15 e 16 (hsa-miR-15 e hsa-miR-16 della Ambion) ed
antagomiRNA 15 e 16 (hsa-miR-15 e hsa-miR-16 della Exiqon) è stato diluito
in 250 µl di Optimem in un range di concentrazione di: 5-20-50-100 nM.
Come controllo negativo è stato utilizzato un miR-scramble (Exiqon).
Le due soluzioni sono state unite e lasciate in incubazione a temperatura ambiente
per 10 minuti.
Le soluzioni finali sono state aggiunte alle cellule e l’incubazione lasciata per 48-72-
96 ore, per effettuare un time course. Le cellule sono quindi state raccolte e
analizzate mediante Western Blotting. Ogni esperimento è stato ripetuto in triplicato.
Rapid amplification of cDNA ends (3’RACE) Visto che la seed sequence nella 3’UTR della PCMT per miRNA15-16 si trovava
eccessivamente vicina alla fine del trascritto, per poterla amplificare si è dovuto
ricorrere alla metodica della 3’RACE, utilizzando il protocollo della ditta produttrice
(3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Invitrogen). Questa metodica
sfrutta la presenza della coda di poly(A), naturalmente presente all’estremità 3’
dell’mRNA, come generico sito di attacco per un primer Anchor Oligo(dT) nella
reazione di retrotrascrizione del cDNA. Infatti la prima reazione prevede la sintesi del
primo strand di cDNA usando come primer l’Anchor primer (AP) Oligo(dT) che si lega
alla coda di poli(A) del trascritto. Dopo questo primo passaggio il template di mRNA
79
viene distrutto dall’aggiunta di RNasi H, che è specifica per gli eteroduplex
RNA:DNA. Segue l’amplificazione, che prevede l’utilizzo di due primer: uno è il gene
specific primer (GSP), l’altro è l’universal amplification primer (AUAP). Per generare
un prodotto di amplificazione specifico, è opportuno effettuare nuovamente la
reazione di amplificazione utilizzando un GSP nested.
I primer utilizzati sono stati i seguenti:
Adapter primer 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
Il prodotto finale di PCR contenente la seed sequence della PCMT è stato purificato
su gel di agarosio (GenElute Gel Extraction kit, SIGMA) ed è stato sequenziato
mediante il sistema di sequenziamento ABI PRISM DNA (Applied Biosystems)
presso la Seconda Università di Napoli – Laboratorio di Genetica Medica (Dir. Prof.
Vincenzo Nigro).
Tecniche di preparazione e manipolazione del DNA
Le tecniche di preparazione e clonaggio del DNA e di batteriologia utilizzate nel
corso del lavoro, sono state derivate da Sambrook et al., 1989.
Ceppi batterici Il ceppo DH5α di Escherichia coli (AMS Biotechnology) è stato utilizzato per
l’amplificazione dei plasmidi.
Mezzi di coltura LB (Luria-Bertani). Il mezzo di coltura liquido è stato preparato sciogliendo in acqua deionizzata 10g di
triptone, 5g di estratto di lievito e 10g di cloruro di sodio per litro di terreno mentre il
terreno solido è stato ottenuto dal mezzo liquido attraverso l’aggiunta di agar alla
concentrazione finale di 1,5% quale agente gelificante.
Antibiotici
L'ampicillina (Amp) è stata acquistata dalla Sigma e usata ad una concentrazione
finale, nei mezzi di coltura, di 100 µg/ml.
Vettori Il vettore utilizzato per il clonaggio è il pGL3TK promoter, gentilmente fornito dal Dott.
Giulio Piluso - Laboratorio di Genetica medica - Dip.to di Patologia generale e
Oncologia - Seconda Università di Napoli. Tale vettore contiene un gene per la
80
resistenza all’ampicillina, un’origine di replicazione batterica, necessaria per la sua
propagazione in cellule di E.coli, ed un promotore TK clonato a monte della
Luciferasi, che rappresenta il gene reporter per il saggio di chemiluminescenza.
Il plasmide pRLCMV è stato invece utilizzato come controllo interno di
normalizzazione negli esperimenti di Luciferasi, in quanto presenta il gene reporter
Renilla.
81
Il plasmide pRSshRNA vector (OriGene) è stato utilizzato per il silenziamento della
PCMT mediato da short hairpin RNA (shRNA).
82
Reazione di taglio endonucleolitico del DNA con enzimi di restrizione e
defosforilazione al 5’di frammenti di DNA La sequenza del prodotto di amplificazione di PCMT contenente la seed sequence è
stata sottoposta a doppia digestione ezimatica con le endonucleasi di restrizione SalI
e XbaI (Takara), che rispettivamente riconoscono e tagliano il DNA a livello delle
seguenti sequenze palindromiche:
Sal I Xba I
Il vettore di clonaggio pGL3TK è stato digerito con gli stessi enzimi e
successivamente defosforilato con l’enzima CIAP (Alkaline Phosphatase Calf
Intestinal, Takara), che catalizza l’idrolisi del residuo 5’-fosfato degli acidi nucleici,
prevenendo la ricircolarizzazione del vettore di clonaggio.
Reazione di ligasi e trasformazione batterica Si è proceduto con la reazione di ligazione tra la sequenza di PCMT contenente la
seed sequence e il plasmide pGL3TK digerito. Per aumentare l’efficienza della
reazione e ottenere un maggior numero di ricombinanti, l’inserto da clonare viene
aggiunto in un rapporto molare che è circa il doppio rispetto al vettore di clonaggio.
La reazione è stata condotta secondo il protocollo della T4 DNA Ligasi (Takara).
La ligasi del fago T4 catalizza il legame estereo covalente tra il fosfato in 5’ di una
base e l’ossidrile in 3’ della base successiva. Il prodotto della reazione è stato
utilizzato per la trasformazione, mediante protocollo heat-shock, delle cellule DH5α.
Le cellule trasformate sono state seminate in piastra su terreno di crescita LB-Agar,
contenente l’antibiotico ampicillina come marcatore di selezione, ed incubate a 37°C
per almeno 18h. Le cellule batteriche che hanno inglobato il vettore ricombinante
formano delle colonie che vengono prelevate dalla piastra e risospese in 3 mL di
terreno LB co ampicillina e fatte crescere per 12 ore a 37°C. Successivamente si
83
procede con l’estrazione del DNA plasmidico, effettuata con il GenElute Gel
Extraction kit (SIGMA) e per controllo si digerisce nuovamente il plasmide
ricombinante con gli enzimi di restrizione utilizzati per il protocollo di clonaggio. I
prodotti della digestione sono stati analizzati su gel di agarosio 1,2%.
Saggio di attività della luciferasi La seed sequence nella 3’UTR del gene umano di PCMT è stata amplificata tramite
3’RACE PCR (come descritto precedentemente), e clonata a valle del codone di
terminazione del gene di luciferasi nel vettore pGL3TK, creando il plasmide
ricombinante pGL3TK-3’UTR-PCMT. Le cellule HepG2 sono cresciute in multiwell da
6 pozzetti 24h prima della trasfezione. La trasfezione è stata effettuata secondo il
protocollo del TransLT1 trasfection reagent (descritto prima) . Le cellule sono state
co-trasfettate con 0.5 µg di plasmide ricombinante e 50 nM di premiRNa-15-a e
premiRNA-16-1. Come controlli negativi sono stati trasfettati i pre-miRNA-15-a e il
premiRNA-16-1 con il plasmide pGL3TK vuoto e il plasmide ricombinante con un
miRNA scramble. Per valutare l’efficienza di trasfezione e procedere alla
normalizzare, in ogni esperimento le cellule sono state cotrasfettate con 0.2 µg di
pRLCMV vector (Promega) che esprime la Renilla-luciferina 2-monoossigenasi, del
celenterato Renilla reniformis. Dopo 48h le cellule sono state raccolte e l’analisi
dell’attività luciferasica è stata testata con l’utilizzo del Dual Luciferase Assay
(Promega) in accordo con le specifiche della casa produttrice. L’esperimento è stato
condotto in triplicato .
84
RISULTATI E DISCUSSIONE EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DELLA PCMT INDOTTO DA siRNA IN COLTURE
CELLULARI DI EPATOCARCINOMA TRATTATE CON CISPLATINO
Per chiarire il significato funzionale della metilazione delle proteine, catalizzata dalla
PCMT, è stata messa in atto una strategia sperimentale basata sul silenziamento del
gene PCMT che codifica per entrambe le isoforme principali di questo enzima, nella
specie umana. Tale approccio costituisce la premessa essenziale per procedere allo
studio del ruolo di tale enzima nella regolazione dell’apoptosi nelle cellule di
epatocarcinoma.
Progettazione e messa a punto delle condizioni sperimentali per ottenere il silenziamento di PCMT, mediante siRNA, per studiarne gli effetti sull’apoptosi. In primo luogo si è dovuto procedere alla messa a punto di condizioni di
silenziamento efficaci per PCMT. A tale scopo sono stati effettuati diversi esperimenti
di silenziamento attraverso l’uso di siRNA diretti contro il trascritto della PCMT a
tempi differenti (time course), per individuare tempo di trattamento, e dose ottimale,
occorrente affinché il silenziamento risultasse efficace e la tossicità minima. Le
condizioni ottimali di silenziamento, in cellule HepG2, valutate mediante Real Time
PCR, corrispondono ad una concentrazione di siRNA pari a 5nM dopo 96 ore di
trattamento (figura 24). Il monitoraggio dell’efficienza di silenziamento mediante Real
Time PCR è utile, nel caso dei siRNA (e anche degli shRNA, come mostrato in
seguito), in quanto si basa sul loro meccanismo d’azione, che prevede la
degradazione del trascritto, mentre lo stesso non è necessariamente vero nel caso
dei miRNA che possono sequestrare l’mRNA da silenziare nei p-bodies, ritardandone
la degradazione. Di conseguenza, la Real Time PCR nel caso dei miRNA può non
essere una tecnica indicativa dell’efficienza di silenziamento di un determinato
trascritto.
Per confermare l’efficienza di silenziamento della PCMT da parte dei siRNA abbiamo
determinato, mediante saggio enzimatico radioisotopico in vitro,(come descritto nei
Metodi a pag.70), l’attività specifica della PCMT endogena nelle cellule silenziate per
questo enzima. I risultati, mostrati in figura 25, dimostrano che l’attività dell’enzima,
85
nelle cellule trattate con siRNA 3 e 5 diretti contro PCMT, è drammaticamente
diminuita, rispetto al controllo, trasfettato con un siRNA random, provando quindi che
la presenza di enzima biologicamente attivo nella cellula è trascurabile.
In secondo luogo si sono cercate le condizioni per indurre e monitorare l’apoptosi in
uno stadio iniziale. Come agente pro-apoptotico è stato utilizzato il Cisplatino, un
farmaco antitumorale largamente utilizzato nel trattamento di numerosi tumori, tra cui
l’epatoma, in polichemioterapia antiblastica o in trattamenti combinati. Si è dunque
monitorato il processo di apoptosi in risposta a variazioni del tempo di esposizione
(time course) ed alla dose del farmaco. Nelle condizioni sperimentali prese in
considerazione, usando una concentrazione di Cisplatino pari a 35mM per 6h, le
cellule non manifestavano segni di apoptosi significativi, mentre, usando il Cisplatino
alla stessa concentrazione per 18h, le cellule manifestavano apoptosi conclamata
(Figura 26).
86
Figura 24. SILENZIAMENTO DELLA PCMT VALUTATO ATTRAVERSO REAL TIME PCR Dopo aver trasfettato le HepG2 con due siRNA (siRNA3 e siRNA5) contro il trascritto della PCMT, i livelli dell’mRNA dell’enzima sono stati valutati attraverso analisi Real time PCR. CTsiRNArd: (controllo negativo) cellule trasfettate con un siRNA random siRNAMAPK:(controllo positivo) cellule trasfettate con siRNA contro il trascritto della MAPK siRNA3PCMT: cellule trasfettate con siRNA contro 3‘UTR del trascritto della PCMT siRNA5PCMT:cellule trasfettate con siRNA contro 5‘UTR del trascritto della PCMT
87
Figura 25. DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITA’ SPECIFICA DELLA PCMT NELLE CELLULE IN CUI E’ STATO EFFETTUATO IL SILENZIAMENTO DEL GENE CODIFICANTE PER QUEST’ENZIMA, MEDIANTE siRNA. L’attività specifica della PCMT nelle HepG2 trasfettate con i siRNA è stata valutata mediante saggio di diffusione di vapore (MacFarlane et al., 1984). I risultati sono espressi come percentuale di attività residua rispetto al controllo, pari al 100%. CT PCMT endogena: (controllo negativo) cellule trasfettate con un siRNA random siRNA3vsPCMT: cellule trasfettate con siRNA contro 3‘UTR del trascritto della PCMT siRNA5vsPCMT:cellule trasfettate con siRNA contro 5‘UTR del trascritto della PCMT
88
Di conseguenza si è scelto di silenziare la PCMT utilizzando siRNA 5nM per 96h e di
utilizzare il cisplatino a 6h di trattamento allo scopo di: a) ottenere un fenotipo
cellulare PCMT- in cui il gene della PCMT fosse completamente represso; b)
verificare se, nelle condizioni di apoptosi innescata ma non ancora irreversibile, la
mancanza dell’enzima influenzasse la comparsa dell’apoptosi.
Come marker apoptotico è stato utilizzato la Poli-ADP-Ribosio-Polimerasi (PARP)
(che è un enzima substrato della Caspasi 3, anch’essa utilizzata come marker di
apoptosi) che si può trovare in due forme: la forma attiva e quella inattiva. La forma
attiva è la forma funzionale dell’enzima (116 KDa) normalmente presente nelle
cellule sane, in quanto l’enzima ha la funzione di riparare il DNA danneggiato.
Quando le cellule vanno incontro ad apoptosi, come è possibile notare nella figura 26 la forma attiva dell’enzima man mano scompare per fare posto alla sua forma
inattiva (di 23 KDa) che è presente quando l’apoptosi è ormai ad uno stadio avanzato
e dunque irreversibile.
Figura 26. MESSA A PUNTO DELLE CONDIZIONI SPERIMENTALI DI APOPTOSI Cellule HepG2 trattate con cisplatino 35mM per 6h (condizioni di apoptosi iniziale), Cellule trattate con cisplatino 35mM per 18h (apoptosi conclamata). Si è usato come marker di apoptosi l’enzima PARP: PoliADP-Ribosio-Polimerasi PARP 116 KDa è la forma attiva dell’enzima PARP 23 KDa è la forma inattiva dell’enzima
89
Caratterizzazione della forma nativa e deamidata di BclXL Uno dei principali problemi sperimentali è stato il monitoraggio dei livelli di
deamidazione di BclxL, un effettore anti-apoptotico della famiglia delle proteine Bcl2
che, come abbiamo dimostrato in un nostro precedente lavoro (Cimmino et al., 2008)
è un substrato della PCMT.
Una serie di lavori precedenti (Deverman et al., 2003; Takehara et al., 2003; Zhao et
al., 2008) hanno riportato la comparsa di una forma deamidata di BclXL. In tali lavori
si afferma che la deamidazione comporta la perdita di funzione della proteina,
causando apoptosi e che tale modificazione consiste nella conversione di due residui
Asn della proteina nativa in due residui isoAsp della proteina deamidata. In questi
lavori le due forme della proteina sono riconosciute su gel di poliacrilammide,
secondo un pattern in cui la banda superiore viene considerata la frazione proteica
deamidata, mentre la banda inferiore rappresenta la forma nativa (Figura 27).
Tuttavia in nessuno di tali lavori si accenna chiaramente alla caratterizzazione
strutturale delle due forme di BclXL ma si dà per scontato che le due bande della
proteina, rappresentino la forma deamidata e quella nativa di BclXL. Per questo
motivo, in collaborazione con il prof. Piero Pucci, del CEINGE di Napoli si è deciso di
caratterizzare le due forme di BclXL che abbiamo parallelamente identificato
immunometricamente su Western blot a seguito del silenziamento della PCMT.
Attraverso l’utilizzo di una proteina BclXL standard e mediante analisi di
spettrometria di massa (figura 28 e tabella III), si è potuto confermare che le due
forme della proteina rappresentano effettivamente la forma deamidata (la banda
superiore) e la forma nativa (banda inferiore) di BclXL (figura 27) . Come ulteriore
conferma, abbiamo rilevato, attraverso saggio radioenzimatico in vitro, i residui
isoaspartilici che si trovano esclusivamente nella forma deamidata di BclXL standard
(figura 29).
Dall’insieme di queste metodiche è stato possibile evidenziare quindi che
la proteina BclXL, se soggetta a deamidazione, presenta residui
isoaspartilici al posto dei normali residui di asparagina.
90
Figura 27. FORMA NATIVA E DEAMIDATA DI BCLXL L’esperimento è stato condotto su un campione di BclXL standard sottoposto a deamidazione mediante il protocollo di Aswad et al., 1993. Il Western blotting dello standard proteico di BclXL mostra che: Lane 1: forma nativa di BclXL Lane 2: forma deamidata di BclXL
Figura 28 CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA MALDI-TOFF DELLE FORME NATIVA E DEAMIDATA DI BclXL L’esperimento è stato condotto su un campione di BclXL standard sottoposto a deamidazione per 6h mediante il protocollo di Aswad et al., 1993. Dopo l’incubazione nel buffer di deamidazione il campione è prima digerito con tripsina, che idrolizza i legami peptidici sul lato cabossilico di lisina e arginina generando vari peptidi poi ulteriormente idrolizzati con l’enzima endoproteinasi AspN, che riconosce e taglia i legami peptidici dal lato amminico di residui aspartilici (compresi gli isoAsp). Lo spettro di massa della proteina BclxL standard deamidata mostra che la proteina, sottoposta a deamidazione e digerita con tripsina e endoproteinasi AspN, presenta i residui 52 e 66 deamidati. I residui 52 e 66 soggetti a deamidazione sono evidenziati in rosso. L’analisi è stata condotta mediante la tecnica MALDI-TOFF, i segnali m/z evidenziati in rosso si riferiscono ai ioni molecolari di peptidi contenenti i residui 52 e 66 che rappresentano i siti deamidati in vivo, compresi nella sequenza di peptidi ottenuti dalla frammentazione proteolitica della proteina intatta.
91
Tabella III. “PEPTIDE MASS FIGERPRINT” DI BclXL DEAMIDATA Confronto tra gli ioni molecolari ottenuti dall’analisi mediante spettrometria di massa MALDI-TOFF (Vedi Figura 28) ed i valori teorici attesi per gli stessi peptidi ottenuti dalla doppia idrolisi (tripsina e endoproteinasi AspN) della proteina nativa e deamidata e contenenti in posizione 52 e 66 rispettivamente Asn o isoAsp/Asp.
92
Figura 29 . QUANTIFICAZIONE DEI RESIDUI ISOASPARTILICI NELLA PROTEINA BclXL STANDARD L’esperimento è stato condotto su un campione di BclXL standard sottoposto a deamidazione mediante il protocollo di Aswad et al., 1993. La percentuale di deamidazione dei residui Asn-Gly che generano isoAspartato è stata determinata mediante saggi radioenzimatici in vitro, utilizzando l’enzima PCMT ricombinante umano come reagente specifico in grado di riconoscere e modificare selettivamente i residui isoaspartilici presenti nelle proteine.
93
Effetti del silenziamento della PCMT sull’apoptosi indotta dal Cisplatino
La caratterizzazione strutturale, mediante spettrometria di massa, ha permesso di
caratterizzare strutturalmente le forme nativa e deamidata di BclXL, fornendo così la
base metodologica per poter procedere, routinariamente, al monitoraggio della
deamidazione di tale proteina, mediante rilevazione delle quantità relative delle due
forme attraverso immunoblotting.
Il passo successivo è stato dunque quello di verificare come, nelle cellule trasfettate
con siRNA contro PCMT, in cui l’espressione di questa meltiltrasferasi è soppressa,
la banda deamidata di BclxL risulti maggiormente rappresentata rispetto al controllo,
dove l’enzima può esercitare la sua attività di riparazione (figura 30).
Dalla figura 30 infatti appare evidente che:
• L’espressione di PCMT risulta efficacemente repressa sia dal siRNA
disegnato contro la 3’UTR del trascritto PCMT (siRNA3) che da quello contro
la sua 5’UTR (siRNA5).
• Ove manca l’enzima, BclXL è chiaramente presente prevalentemente in forma
deamidata che è inattiva in senso anti-apoptotico (Zhao et al., 2007).
• I marker di apoptosi (Caspasi 3 e PARP) indicano (lane 2 e 3) che nei
campioni trattati con siRNA (in cui PCMT è represso) l’apoptosi è attivata dal
trattamento col Cisplatino. In particolare, mentre nel controllo (lane 1) il
trattamento con Cisplatino non innesca l’apoptosi se non in forma assai
iniziale (caspasi è prevalentemente in forma attiva, PARP in forma non
clivata), nelle cellule tumorali invece, in cui PCMT è soppressa, si osserva
unincremento drammatico della sensibilità allo stimolo pro-apoptotico.
Riassumendo, in cellule trattate con cisplatino 35mM per 6h e trasfettate
con siRNA3 oppure con siRNA5 contro il trascritto della PCMT, in cui
quindi l’espressione della metiltrasferasi è soppressa, la proteina BclXL
appare significativamente più deamidata che nel controllo, dove l’enzima
può esercitare la sua attività riparativa. I marker di apoptosi (Caspasi3 e
PARP), inoltre, dimostrano effettivamente un’aumentata suscettibilità allo
stimolo apoptotico nelle cellule in cui l’enzima è stato silenziato.
94
Figura 30. EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DELLA PCMT SULL’APOPTOSI INDOTTA DA CISPLATINO IN CELLULE HEPG2 L’esperimento è stato condotto in cellule trattate con cisplatino 35mM per 6h e trasfettate con siRNA3 e siRNA5 contro il trascritto della PCMT, in cui quindi l’espressione della metiltrasferasi è soppressa. Le frecce blu indicano la posizione di BclXL nativa (banda inferiore) e deamidata (banda superiore). Come marker di apoptosi sono stati utilizzati Caspasi3 e PARP. C siRNA RD: cellule trasfettate con siRNA random (controllo negativo) siRNA3 : cellule trasfettate con siRNA contro la 3’UTR della PCMT siRNA5 : cellule trasfettate con siRNA contro la 5’UTR della PCMT
95
Silenziamento della PCMT mediante short hairpin RNA (shRNA)
Nelle cellule di mammifero il fenomeno dell’RNA interference può essere innescato
da siRNA, costituiti da RNA double strand (senso e antisenso), che provocano una
forte ma instabile inibizione dell’espressione di uno specifico gene (Elbashir et al.,
2001). I siRNA possono essere sintetizzati e trasfettati nelle cellule, causando
l’effettiva soppressione dell’espressione genica. L’unico difetto nell’utilizzo di questa
metodica sta nel fatto che questa inibizione è transiente. Al contrario, gli short hairpin
RNA (shRNA), essendo i precursori dei siRNA, sono in grado di abolire l’espressione
di un gene per un lungo periodo di tempo, attraverso la continua espressione di RNA
duplex che viene processato dal macchinario di silenziamento cellulare
(Brummelkamp et al., 2002; Paddison et al., 2002). Uno shRNA è un RNA che
contiene la sequenza senso, uno spacer (di 5-6 basi) e la sequenza antisenso.
Questo RNA avrà una struttura a "forcina" (detta hairpin). Per questo motivo, oltre
che al silenziamento con i siRNA, come precedentemente descritto, siamo ricorsi
all’uso di un plasmide contenente sequenze che codificano per diversi shRNA contro
la sequenza della PCMT. Anche in questo caso sono stati effettuati diversi
esperimenti di silenziamento a tempi differenti (time course), per individuare il tempo
di trattamento occorrente affinché il silenziamento risultasse efficace. Le condizioni
ottimali di silenziamento, valutate mediante Real Time PCR si hanno dopo 96 ore di
trattamento (figura 31). Come nel caso dei siRNA, per confermare l’efficienza di
silenziamento della PCMT da parte degli shRNA utilizzati, abbiamo determinato,
mediante saggio radioenzimatico in vitro l’attività specifica della PCMT nelle cellule
silenziate per questo enzima. I risultati, mostrati in figura 32, dimostrano anche in
questo caso che l’attività dell’enzima, nelle cellule silenziate con shRNA contro
PCMT, diminuisce drasticamente, rispetto al controllo, trasfettato con un shRNA
random.
Le condizioni per indurre e monitorare l’apoptosi chiaramente si sono mantenute
identiche all’esperimento precedente, per cui si è utilizzato il Cisplatino a una
concentrazione pari a 35 mM per 6h di trattamento. Quindi, dopo 96h di trasfezione
con 4 plasmidi pGFP-V-RS contenenti 4 diversi shRNA contro il trascritto di PCMT
abbiamo trovato gli stessi risultati riscontrati dopo il trattamento con siRNA; infatti
dalla figura 33 appare evidente che:
96
• Si ottiene una buona efficienza di silenziamento di PCMT con tutti gli shRNA
utilizzati
• Anche in questo caso ove manca l’enzima, BclXL è chiaramente presente
prevalentemente in forma deamidata che è inattiva in senso anti-apoptotico.
• I marker di apoptosi (Caspasi 3 e PARP) indicano (lane 2-3-4-5) che nei
campioni in cui la PCMT è stata silenziata con shRNA, si manifesta una
maggiore sensibilità allo stimolo pro-apoptotico indotto dal Cisplatino. Al
contrario, nel controllo (lane 1) il trattamento con Cisplatino non innesca
dell’apoptosi se non in forma assai iniziale (caspasi è prevalentemente in
forma attiva, PARP in forma non clivata).
Il fatto che questa metodica sia altrettanto efficace, aggiunto al fatto che tali shRNA
vengono veicolati da un plasmide ci offre un approccio più efficace e concreto, come
prospettiva futura, allo scopo di rendere la trasfezione stabile, onde ottenere un
fenotipo cellulare stabilmente PCMT-. SI prevede che ciò possa determinare notevoli
vantaggi circa la possibilità di effettuare un più ampio ventaglio di esperimenti in
condizioni tali da ottenere un silenziamento prolungato ed efficace e risultati ancora
più accurati e riproducibili. Nella scelta degli shRNA da utilizzare saremmo propensi
a utilizzare gli shRNA contro l’ORF di PCMT (lane 4 e 5 in Figura 33) piuttosto che
quelli contro l’UTR (lane 2 e 3 in Figura 33) del trascritto, benché entrambi gli
approcci si siano dimostrati parimenti efficaci nel reprimere l’espressione del target.
Come affermato nell’introduzione infatti, per scongiurare possibili effetti “off-target”
bisogna evitare che gli shRNA di base si combinino esclusivamente con l’ UTR
dell’mRNA.
Nella tabella IV sono messe a confronto le due metodiche di RNA interference
utilizzate.
97
Figura 31 . SILENZIAMENTO DELLA PCMT MEDIANTE shRNA VALUTATO ATTRAVERSO REAL TIME PCR Dopo aver trasfettato le HepG2 con shRNA contro il trascritto della PCMT, i livelli dell’mRNA dell’enzima sono stati valutati attraverso analisi Real time PCR. C shRNA RD vector : cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA random shRNA contro 5’UTR PCMT (a) : cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza della 5’UTR di PCMT shRNA contro ORF PCMT (a) : cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza nella ORF (open reding frame) di PCMT shRNA contro 5’UTR PCMT (b): cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza della 5’UTR di PCMT shRNA contro ORF PCMT (b) : cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza nella ORF (open reding frame) di PCMT
98
Figura 32 .DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITA’ SPECIFICA DELLA PCMT IN CELLULE SILENZIATE PER PCMT CON shRNA L’attività specifica della PCMT nelle HepG2 trasfettate con plasmidi contenenti shRNA è stata valutata mediante saggio di diffusione di vapore (MacFarlane et al., 1984). Le HepG2 trasfettate con gli shRNA contro PCMT mostrano un’attività enzimatica significativamente più bassa rispetto alle cellule trasfettate con un plasmide contenente shRNA random. CT PCMT endogena: (controllo negativo) cellule trasfettate con un shRNA random shRNA contro 5’UTR PCMT (a) : cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza della 5’UTR di PCMT shRNA contro ORF PCMT (a): cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza della 5’UTR di PCMT shRNA contro 5’UTR PCMT (b): cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza nella ORF (open reding frame) di PCMT shRNA contro ORF PCMT (b) : cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza nella ORF (open reding frame) di PCMT
99
Figura 33. EFFETTI DEL SILENZIAMENTO INDOTTO DA shRNA SULLA PCMT In cellule trattate con cisplatino 35mM per 6h e trasfettate con shRNA contro il trascritto della PCMT, in cui quindi l’espressione della metiltrasferasi è soppressa, la proteina BclXL è più deamidata che nel controllo, dove l’enzima può esercitare la sua attività riparativa. I marker di apoptosi (Caspasi3 e PARP) inoltre, indicano un’aumentata suscettibilità allo stimolo apoptotico nelle cellule in cui l’enzima è stato silenziato. 1-C shRNA RD vector : cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA random 2-shRNA contro 5’UTR PCMT (a): cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza della 5’UTR di PCMT 3- shRNA contro 5’UTR PCMT (b): cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza della 5’UTR di PCMT 4-shRNA contro ORF PCMT (a): cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza nella ORF (open reding frame) di PCMT 5-shRNA contro ORF PCMT (b) : cellule trasfettate con plasmide contenente shRNA contro una sequenza nella ORF (open reding frame) di PCMT
100
TABELLA IV Confronto tra siRNA ed shRNA in termini di caratteristiche ed attività biologica.
shRNA in
pGFP-V-RS
vector
siRNA3’UTR
siRNA5’UTR
EFFICIENZA
DI
TRASFEZIONE
BUONA
OTTIMA
OTTIMA
TRASFETTANTI
STABILI
SI
NO
NO
EFFICIENZA
SILENZIAMENTO
PCMT
OTTIMA
OTTIMA
OTTIMA
DEAMIDAZIONE
DI BclXL
PRESENTE
PRESENTE
PRESENTE
FIGURA 34 . ANALISI DENSITOMETRICA DELLE BANDE DI PCMT NEI WESTERN BLOT DI CELLULE SILENZIATE CON siRNA e CON shRNA
101
Allo scopo di valutare comparativamente l’efficienza di silenziamento ottenuto con
siRNA ed shRNA rispettivamente, è stata effettuata un’analisi densitometrica della
bande di PCMT dei western blot delle cellule silenziate coi due metodi siRNA e
shRNA. La figura 34 rivela chiaramente che, con entrambe le metodiche utilizzate,
l’efficienza del silenziamento è alta in quanto si rileva un segnale di banda talmente
debole da essere trascurabile in tutte le lane in cui le cellule sono state silenziate per
PCMT, mentre nei controlli si rileva un segnale intenso e significativamente più
evidente delle cellule in cui PCMT è represso con entrambi i metodi.
Il silenziamento della PCMT: un possibile approccio terapeutico per il trattamento dei tumori e per contrastare il fenomeno della resistenza ai chemioterapici antiblastici. I risultati finora ottenuti dimostrano chiaramente che la PCMT è un enzima
fondamentale nella regolazione apoptotica delle cellule di epatocarcinoma, infatti la
sua assenza comporta la mancata riparazione della forma deamidata di BclXL.
Poichè quest’ultima non è funzionalmente attiva in senso antiapoptotico ne deriva
che la cellula diviene più facilmente suscettibile all’apoptosi.
La PCMT ha dunque un compito fondamentale: regolare l’equilibrio tra apoptosi ed
antiapoptosi prevenendo l’accumulo di BclXL deamidato nelle cellule tumorali. Il
silenziamento della PCMT rappresenta dunque un potenziale strumento per indurre
l’apoptosi in tessuti danneggiati, attraverso la regolazione della ripartizione tra la
forma nativa (attiva) e deamidata (inattiva) di BclxL nonché, potenzialmente, di altri
substrati della PCMT (Cimmino et al, 2008).
L’apoptosi infatti è uno dei meccanismi cellulari maggiormente deregolato nei tumori.
La deregolazione dell’apoptosi nei tumori può determinare due ordini d’implicazioni:
a) la capacità delle cellule tumorali di manifestare resistenza all’apoptosi rispetto alle
corrispondenti cellule normali. Molti lavori hanno infatti dimostrato che il fenomeno
della resistenza in vivo coinvolge una serie di proteine implicate nelle regolazione del
ciclo cellulare e dell’apoptosi. Hanada e collaboratori infatti (Hanada et al., 2010)
hanno dimostrato che la resistenza al mirplatino delle cellule di epatocarcinoma di
ratto A109A/MP10, è associata con l’acquisita capacità di queste cellule di
iperesprimere Bcl2. Similmente, l’espressione della p38MAPK nelle HepG2 aumenta
a seguito della somministrazione di farmaci antitumorali (Tang et al., 2010)
dimostrando quindi che le cellule cancerose attivano, in risposta al trattamento con
102
farmaci pro-apoptotici, il macchinario di proliferazione cellulare per continuare a
crescere. b) la capacità delle cellule tumorali di sviluppare resistenza all’apoptosi
nell’ambito di un meccanismo di resistenza alla chemioterapia. Una delle
problematiche maggiormente dibattute è infatti la resistenza di molti tipi di tumori ai
chemioterapici che hanno proprio la funzione di indurre apoptosi nelle cellule
tumorali, che presentano al contrario una crescita incontrollata. La resistenza ai
farmaci antitumorali da parte delle cellule neoplastiche è all’origine dell’insuccesso
terapeutico nella maggior parte dei casi. Essa può essere responsabile della recidiva
del tumore primitivo e/o della comparsa e progressione di metastasi, anche in
pazienti che siano stati sottoposti ai protocolli standard di chemioterapia (Krol et al.,
2010). Tale fenomeno è dovuto a cambiamenti genetici ed epigenetici che si
verificano nella cellula cancerosa e che la rendono insensibile all’azione tossica dei
chemioterapici normalmente usati per trattare le diverse neoplasie. Tra i vari
meccanismi responsabili dell’insorgere della resistenza, uno dei più rilevanti è quello
per cui la cellula malata diviene capace di produrre in gran quantità delle proteine,
localizzate nella sua membrana, che fungono da “pompe”, cioè che sono capaci di
trasportare il chemioterapico antitumorale fuori dalla cellula stessa, impedendogli
così di espletare la sua azione citotossica. Tra i vari trasportatori la glicoproteina P
(P-gp) è la più studiata, in quanto capace di estrudere dalla cellula molti dei più
comuni farmaci antitumorali (Zhou et al., 2010). Si tratta di una proteina che assume
la forma di un vero e proprio canale, che si estende per tutta la profondità della
membrana cellulare, attraverso cui, con un meccanismo non completamente chiarito,
vengono eliminati farmaci di struttura diversa tra cui anche il Cisplatino (Liu et al.,
2009). Sulla base di tali considerazioni si potrebbe ipotizzare un potenziale
trattamento combinato di chemioterapici associati all’uso di terapia genica (attraverso
la veicolazione di siRNA nel tessuto tumorale). Nel caso dell’epatocarcinoma quindi,
l’uso del cisplatino e la veicolazione di siRNA specifici contro la PCMT potrebbe
permettere una più agevole induzione di apoptosi nel tessuto tumorale. Ciò appare
tanto più fattibile in quanto spesso nella chemioterapia dell’epatoma si utilizza il
Cisplatino in mono o polichemioterapia (col 5-fluorouracile), mediante instillazione
loco regionale del farmaco, attraverso un catetere inserito nell’arteria epatica (Oh et
al., 2009; Kim et al., 2010; Kasai et al., 2010; Yamasaki et al., 2010). Un altro tipo di
approccio, ugualmente interessante, sarebbe quello di utilizzare siRNA antiPCMT
non per via sistemica, ma loco-regionale per rendere la sua azione ancora più mirata
103
ed efficace. Tali risultati dunque, in prospettiva, potrebbero permettere l’impiego di
tale approccio per la modulazione dell’apoptosi in cellule tumorali con conseguenze
importantissime per il controllo della resistenza all’apoptosi indotta da farmaci
antiblastici.
La possibilità di associare la terapia genica all’uso di chemioterapici potrebbe infatti
presentare importanti vantaggi da un punto di vista terapeutico. La terapia genica,
grazie alla sua azione, potrebbe aumentare la percentuale d’inattivazione delle
cellule tumorali ampliando la maneggevolezza di farmaci come il cisplatino,
migliorandone l’intervallo terapeutico di utilizzo. E’ ormai noto che, quanto più la
somministrazione di un farmaco antiblastico ricade all’interno del suo intervallo
terapeutico, tanto più ci sarà efficacia terapeutica associata a effetti collaterali minori,
e dunque una migliore tolleranza al farmaco, con immensi benefici per la
sopravvivenza del paziente.
REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE DELLA PCMT INDOTTA DA MICRORNA
La PCMT è un potenziale target dei miRNA-15-a e del miRNA-16-1 La scoperta dei miRNA ha introdotto un nuovo paradigma nei sistemi di regolazione
genica. L'identificazione dei geni regolati dai miRNA e' un punto cruciale nella
comprensione del ruolo funzionale dei miRNA stessi, e delle complesse reti
molecolari alla base della regolazione genica. La complessità nell'identificazione
degli mRNA bersaglio dei miRNA e' dovuta innanzitutto al fatto che i miRNA hanno
sequenze molto corte e dall'imperfezione del loro appaiamento con il target
molecolare. Negli ultimi anni, si è cercato di estrapolare, dagli studi sperimentali, i
principi alla base di questa interazione, al fine di sviluppare numerosi algoritmi
matematici su cui si basano i software di predizione, accessibili in rete, per la
predizione degli ipotetici mRNA bersaglio. Tali principi comprendono: (a) la
complementarità imperfetta tra il miRNA e il 3' UTR del target e il forte legame tra i 6-
8 nt della regione "seed" al 5' dei miRNA rispetto al 3' degli mRNA, (b) la
conservazione evolutiva tra le specie delle sequenze bersaglio al 3' del target; (c) la
stabilità termodinamica del duplex miRNA-mRNA;
104
Buona parte dei risultati ottenuti con questi algoritmi sono stati validati
sperimentalmente, e ciò ha permesso di migliorare notevolmente le prestazioni per la
predizione dei target di miRNA.
Per il presente lavoro sono state utilizzate le banche dati di predizione TargetScan,
MIRanda e PicTar. Tutte queste banche dati si basano sui parametri descritti, ma
ognuna di esse ne considera maggiormente uno. Il sofware Targetscan è il più
completo in quanto determina un contex score dalla predizione di struttura
(modeling) dell'eteroduplex miRNA-mRNA, basata sulla stabilità termodinamica, e
dall’analisi comparativa di sequenza, basata sulla conservazione tra specie. Quanto
più il contex score (cioè il valore numerico che ne risulta) è negativo, tanto più la
probabilità che esista una reale interazione tra un miRNA ed un mRNA è alta. Il
software MiRanda determina un aligment score in quanto è stato progettato per
predire target in base all’allineamento di sequenza basato sulla conservazione
filogenetica del sito di legame tra specie anche relativamente lontane.Di
conseguenza, quanto più il valore dell’aligment score è alto, tanto più significa che
esiste una buona conservazione filogenetica tra specie, indice di una buona
probabilità di interazione tra miRNA ed mRNA. Il software PicTar determina un
parametro di structure energy (espressa in kcal/mol) in quanto considera il guadagno
energetico derivante dall’appaiamento tra le basi e quindi la stabilità del complesso e
l’accessibilità del sito di legame all’interno della struttura secondaria del messaggero.
Quanto più l’energia libera di legame che si forma tra un putativo miRNA ed un
mRNA è bassa, in termini energetici, tanto più il valore di predizione è positivo. Dal
confronto tra queste tre banche-dati sono stati selezionati i microRNA identificati con
i migliori score da tutti e tre gli algoritmi. Il risultato di tali analisi ha permesso dunque
di predire come PCMT sia effettivamente un potenziale gene bersaglio dei miRNA-
15a e miRNA-16-1 (figura 35).
105
Figura 35. INDIVIDUAZIONE DI POTENZIALI microRNA IN GRADO DI RICONOSCERE PCMT QUALE TARGET. La predizione bioinformatica con i software Targetscan, Miranda e Picar, ha permesso l’identificazione della PCMT come potenziale bersaglio di regolazione da parte di miRNA-15-a e miRNA-16-1.
E’ importante sottolineare che questo cluster di miRNA regola l’espressione di una
serie di effettori antiapoptotici, come Bcl2 e MCL1 (Cimmino et al., 2005; Dzhagalov
et al., 2007). Evidenze a riguardo suggeriscono come la deregolazione dei miRNA-
15-16 svolga un ruolo-chiave nella fisiopatologia di vari tipi di cancro tra cui leucemie
e linfomi (Calin et al., 2008). Questi miRNA sono infatti soppressi da mutazioni o
deregolati nella maggioranza delle leucemie linfocitiche croniche (CLL) e ciò
106
comporta l’iperespressione di Bcl2, che causa resistenza all’induzione dell’apoptosi
(Aqeilan et al., 2010). Queste considerazioni, assieme all’analisi bioinformatica, ci
hanno spinto a verificare la presenza di questa putativa interazione, in quanto in linea
con l’azione anti-apoptotica della PCMT.
I miRNA-15-a/16-1 inibiscono l’espressione di PCMT in cellule di epatocarcinoma.
Sono stati realizzati diversi esperimenti per verificare gli effetti dell’interazione tra i
miRNA-15-a/16-1 e il trascritto di PCMT, in termini di downregulation
dell’espressione del gene che codifica per questa metiltrasferasi. Per ottenere
l’iperespressione dei miRNA-15 e 16 le cellule HepG2 sono state trasfettate con pre-
miRNA-15a e pre-miRNA-16-1, a dosi e tempi differenti, e per valutare gli effetti
sull’espressione della PCMT, si è proceduto attraverso analisi per Western Blotting,
usando un anticorpo anti-PCMT. Come si evince dalla figura 37, in seguito al
trattamento le HepG2 mostrano una significativa diminuzione dose-dipendente
dell’espressione della PCMT endogena, senza produrre alcun effetto significativo sui
livelli di RNA messaggero codificante per PCMT, confermando un effetto di tipo post-
trascrizionale, che compare già dopo 48h di trattamento, alla concentrazione di 50 e
100 nM di pre-miRNA15 e 16, mantenendosi poi stabile nel tempo alle stesse
concentrazioni. Come già accennato prima infatti, mentre i siRNA/shRNA nel loro
meccanismo d’azione prevedono la degradazione del trascritto, i miRNA invece
tendono a sequestrare l’mRNA da silenziare nei p-bodies, ritardandone la
degradazione. Di conseguenza, la Real Time PCR nel caso dei miRNA, come
dimostra la figura 36 , può non essere una tecnica indicativa dell’efficienza di
silenziamento di un determinato trascritto.
Un ulteriore approccio è consistito nel reprimere l’espressione endogena di miR15 e
16, utilizzando degli antagonisti specifici dei suddetti miR (antago miR 15 e 16),
disegnati seguendo il principio del base-pairing con i loro specifici miRNA agonisti.
Tale approccio si basa sul meccanismo di formazione, intra-cellularmente, di
strutture miR:antagomiR che da un lato impediscono che il microRNA possa dirigersi
verso il gene target, dall’altro facilitano la degradazione del miR stesso. Si è dunque
proceduto alla trasfezione per 48h di anti-miR15 e 16, capaci di silenziare
specificamente i miRNA-15 e 16. Come è mostrato nella (figura 38) , l’analisi della
PCMT mediante Western blotting, dimostra che già a partire da 48h l’inibizione dei
107
miR-15 e 16 induce un aumento nelle colture dell’espressione della PCMT
endogena. Questi esperimenti danno una prima dimostrazione dell’effettiva
interazione esistente tra questo cluster di miRNA ed il trascritto di PCMT.
A
B
Figura 36. EFFETTI DELLA TRASFEZIONE CON miRNA-15/16 SULL’ESPRESSIONE DELL’mRNA DI PCMT DOPO 48h La trasfezione dei miRNA-15/16 non varia significativamente l’espressione del trascritto della PCMT in cellule HepG2, valutata mediante real time PCR.
108
Figura 37.EFFETTI DELLA TRASFEZIONE CON pre-miRNA-15-a e pre-miRNA-16-1 SUI LIVELLI DI ESPRESSIONE DI PCMT Sono stati eseguiti esperimenti di trasfezione time-course (48-72-96h) utilizzando i pre-miRNA15 e 16.L’ espressione della PCMT diminuisce sempre dopo la trasfezione, a partire dalle concentrazioni di 50-100nM di questi pre-miRNA utilizzati negli esperimenti. PANNELLO I: Western blotting PANNELLO II: Analisi densitometrica delle bande
109
Figura 38. REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE DEI miRNA-15 e 16 SULLA PCMT:EFFETTI DEGLI ANTAGO-miRNA Già a partire da 48h dopo la trasfezione, la PCMT risulta iperespressa rispetto al controllo trasfettato con un miRNA scramble . A) Western blotting B) Analisi densitometrica delle bande
110
Caratterizzazione del meccanismo d’azione dei miRNA15-a/16-1 attraverso
l’interazione e la regolazione negativa della 3’UTR di PCMT Per avere la prova diretta dell’interazione di miR15 e 16 a livello della seed sequence
della 3‘UTR della PCMT con formazione del complesso miR:mRNA e conseguente
regolazione negativa si è proceduto come segue. La seed sequence della 3‘UTR
della PCMT è stata clonata nel plasmide pGL3TK a valle del gene della luciferasi.
Come si evince dalla figura 39 nelle cellule co-trasfettate con il plasmide
ricombinante pGLpcmt e i miRNA-15-16, l’attività luciferasica è significativamente
ridotta, mentre nei controlli l’attività luciferasica risulta invariata, dimostrando
chiaramente la diretta interazione del trascritto di PCMT con i due miRNA-15 e 16.
Figura 39. PROVA DIRETTA DELL’INTERAZIONE TRA PCMT E miRNA-15 e 16 Per l’esperimento di luciferasi, la 3‘UTR della PCMT è stata amplificata attraverso 3‘RACE PCR da un cDNA umano, ed inserito nel vettore pGL3TK, a valle del gene della luciferasi. I risultati del saggio mostrano che il cluster miRNA-15-16 regola in maniera diretta la PCMT. pGLpcmt/miR15:cellule co-trasfettate con il plasmide ricombinante contenente la 3‘UTR della PCMT e il pre-miRNA-15 pGLpcmt/miR16: cellule co-trasfettate con il plasmide ricombinante contenente la 3‘UTR della PCMT e il pre-miRNA-16 CONTROLLI: pGLCT/miR15: cellule co-trasfettate con il plasmide controllo e il pre-miRNA-15 pGLCT/miR16: cellule co-trasfettate con il plasmide controllo e il pre-miRNA-16 pGLpcmt/miRNARD RD:cellule co-trasfettate con il plasmide ricombinante contenente la 3‘UTR della PCMT ed un miRNA random
111
Questi risultati dimostrano chiaramente che i miRNA-15 e 16 sono capaci di
modulare l’espressione della PCMT, che a sua volta, è un enzima che abbiamo visto
possedere proprietà regolative nell’apoptosi attraverso la “riparazione” della forma
deamidata di BclXL, in cellule tumorali. Possiamo quindi affermare che in cellule di
epatocarcinoma i miRNA15 e 16 si comportano da oncosoppressori, in quanto
controllano e regolano l’apoptosi, un fondamentale meccanismo per l’omeostasi
cellulare. I nostri risultati quindi, non solo dimostrano che la PCMT è regolata al
livello post-trascrizionale da specifici miRNA, ma sono in accordo rispetto al ruolo
che questo cluster di miRNA ha nei tumori. Infatti, come ampiamente dimostrato, il
cluster si comporta da oncosoppressore, nel caso di Bcl2 (Cimmino et al., 2005). I
nostri dati dimostrano che il cluster esercita la stessa funzione nel caso di PCMT.
Infatti i risultati dei nostri esperimenti fanno ipotizzare che i miRNA-15 e 16 possano
regolare l’apoptosi non solo attraverso l’inibizione di Bcl2, ma anche attraverso
PCMT che dunque rappresenta un nuovo checkpoint che si trova a valle della
regolazione post-trascrizionale di Bcl2, in quanto agisce su PCMT e dunque in
maniera indiretta sulla regolazione di BclXL. Possiamo dunque ipotizzare che nelle
cellule di epatocarcinoma, mentre la PCMT ha la funzione di promuovere la
sopravvivenza del tumore riparando BclXL, al contrario miRNA15 e 16, in presenza
di cisplatino, inducono apoptosi silenziando Bcl2 e PCMT determinando quindi
l’effetto opposto. Questa considerazione può avere importanti implicazioni in campo
bio-medico in quanto, capire i meccanismi che stanno alla base di fenotipi patologici
può aiutare grandemente la ricerca scientifica nel contrastare tali alterazioni. Dal
momento che si è dimostrato che questi miRNA sono eliminati attraverso mutazioni o
deregolati nella maggioranza delle leucemie linfocitarie croniche (CLL), comportando
l’iperespressione di Bcl2, che causa resistenza all’apoptosi, si potrebbe ipotizzare
che, ad aggravare il fenomeno, ci sia anche l’iperespressione della PCMT che
comporta un aumento dell’attività di riparazione di proteine anti apoptotiche come
BclXL, e ciò potrebbe contribuire alla resistenza all’apoptosi che si riscontra i questi
tipi di tumore.
112
Figura 40. RUOLO ONCOSOPPRESSIVO DEI miRNA15/16 NEI TUMORI
I dati ottenuti inoltre pongono le basi per studiare il possibile ruolo patogenetico di
alterazioni dei miRNA15/16 anche in diverse malattie non neoplastiche che sono
associate a deregolazione dell’apoptosi. In particolare l’apoptosi è coinvolta in molti
dei meccanismi che conducono al danno e alla perdita funzionale neuronale che
sono alla base delle malattie neurodegenerative come l’Alzheimer (Yaguchi et al.,
2010; Leuner et al., 2010), il Parkinson e la Sclerosi laterale amiotrofica (Reyes et
al., 2010). La graduale perdita di neuroni in diverse parti del cervello caratterizza
gran parte delle patologie neurodegenerative. Poiché il sistema nervoso centrale
(SNC) durante lo sviluppo è sede di un’intensa attività apoptotica e nel periodo adulto
la sopravvivenza cellulare dipende dall’espressione di geni antiapoptotici quali Bcl-xL
113
si è ipotizzato che il SNC sia particolarmente suscettibile ai difetti dei pathway
apoptotici (Tarawneh et al., 2010). Tale ipotesi è avvalorata da numerose evidenze
sperimentali che mostrano un coinvolgimento dell’apoptosi nello sviluppo di diverse
malattie del SNC (Uchida et al., 2010).
Le lesioni tipiche della malattia di Alzheimer comprendono le placche amiloidi
(placques) e i grovigli neurofibrillari (tangles). Il coinvolgimento del processo
apoptotico nella malattia di Alzheimer è stato osservato a livello delle placche beta
amiloidi, aggregati proteici insolubili caratteristici della patologia che, accumulandosi
nel tessuto cerebrale, causano la degenerazione neuronale in intere aree del
cervello. In linee cellulari neuronali si è osservato che i peptidi delle placche beta
amiloidi sono in grado di inibire la trascrizione dei geni antiapoptotici (Bcl-2, BclXL) e
di stimolare invece quella di geni proapoptotici (Bax), rendendo i neuroni più
suscettibili alla morte, soprattutto in risposta allo stress ossidativo (Ikeda et al.,
2010). Anche nella malattia di Parkinson si sta elucidando il ruolo dell’apoptosi nel
determinare la progressiva perdita dei neuroni dopaminergici nigrostriatali. In
particolare sono state effettuate interessanti scoperte sulle proprietà della selegilina
(Lees et al., 2001), farmaco storico utilizzato nel trattamento della malattia per la sua
capacità di inibire in modo irreversibile la monoamina ossidasi B (MAO-B), uno dei
due enzimi principali che catabolizzano le catecolammine (l’altro è la catecol-O-metil
trasferasi; COMT). Le MAO catalizzano la deaminazione ossidativa delle
catecolammine (compresa la dopammina), attraverso l’intervento dell’ossigeno.
Le MAO sono dunque enzimi coinvolti anche nell’induzione di stress ossidativo e
quindi, possibilmente, nella patogenesi della malattia. E’ stato quindi scoperto che la
selegilina (e la rasagilina) esercitano il loro effetto neuroprotettivo alterando
l’espressione, tra gli altri, dei geni antiapoptotici Bcl-2 e Bcl-xL (Weinreb et al., 2005;
Dietz et al., 2008; Thiruchelvam et al., 2008; Tarrants et al., 2010). Nella sclerosi
laterale amiotrofica infine è stata evidenziata l’ipoespressione di Bcl2 associata
all’iperespressione di Bax che nei motoneuroni attiva più rapidamente il pathway
114
apoptotico mitocondriale che contribuisce alla degenerazione neuromuscolare
(Reyes et al., 2010).
Di conseguenza appare chiaro che in questi tipi di patologie un possibile approccio
potrebbe comprendere:
• Lo studio delle alterazioni dell’espressione di miRNA 15/16 in queste
condizioni patologiche (analogamente a ciò che è stato fatto nei tumori); onde
verificare se tale cluster è espresso correttamente e se in queste patologie
subisce modificazioni che si traducono nella mancata regolazione dei suoi
target come Bcl2 e PCMT che, non a caso, nel tessuto nervoso presenta il
massimo livello di espressione (Bidinosti et al., 2010).
• La messa a punto di modelli sperimentali per trovare condizioni per un
impiego di siRNA /shRNA/pre/antagomiRNA per PCMT e verificare la loro
capacità di indurre modificazioni compensative dell’espressione di questo
enzima e dunque, indirettamente, dell’espressione di BclXL in forma nativa,
attiva in senso antiapoptotico.
• La progettazione di strategie per un potenziale impiego di tali molecole in vivo.
115
CONCLUSIONI E PROSPETTIVE
I risultati di questa tesi dimostrano che:
1) Sia i siRNA che i shRNA esercitano una potente ed efficace azione di
silenziamento sull’espressione della PCMT in cellule di epatocarcinoma. L’addizione
di Cisplatino (quale agente pro-apoptotico) alle HepG2 silenziate per PCMT
determina una maggiore sensibilità di queste cellule alla presenza di questo farmaco
che si manifesta con una minore resistenza all’apoptosi. Difatti, mentre in condizioni
normali il trattamento delle HepG2 con Cisplatino 35 mM per 6h non scatena forti
segnali pro-apoptotici, nelle condizioni in cui lo stesso trattamento è eseguito in
cellule silenziate per PCMT la risposta pro-apoptotica è forte e rapida. Queste
considerazioni possono rivelarsi molto utili nel trattamento dei tumori, soprattutto per
contribuire a risolvere il problema della resistenza agli antiblastici e della insorgenza
di effetti collaterali anche alle dosi terapeutiche. La finestra terapeutica infatti è
l’intervallo di concentrazione del farmaco nel quale si ottiene un buon risultato
terapeutico senza che si manifestino effetti collaterali. Per un farmaco antitumorale la
dose tossica e la dose efficace si trovano in un range di dosaggio terapeutico
talmente stretto che la comparsa di effetti collaterali, spesso anche gravi, si
accompagna con elevata frequenza al trattamento. La possibilità di combinare
all’approccio chemioterapico la terapia genica, tramite il silenziamento di geni–chiave
per la regolazione di fenomeni cellulari come l’apoptosi può rappresentare una valida
opportunità per migliorare la somministrazione di farmaci come il Cisplatino,
normalmente utilizzato per il trattamento di numerose neoplasie, compreso
l’epatocarcinoma.
Il silenziamento della PCMT in cellule trattate con Cisplatino quindi potrebbe
rappresentare un potenziale strumento terapeutico per contribuire all’induzione dell’apoptosi in tessuti patologici in quanto l’assenza dell’enzima comporta la mancata riparazione di BclXL provocando l’inizio della cascata apoptotica.
116
La PCMT quindi è un potenziale target di approccio terapeutico per la
modulazione dell’apoptosi in cellule tumorali per migliorate l’efficacia dei farmaci antiblastici.
2) I miRNA-15-16 esercitano una specifica azione di regolazione sull’espressione
della PCMT. La PCMT quindi rappresenta un potenziale bersaglio di deregolazione
in malattie proliferative in cui questi miRNA sono a loro volta deregolati. Di
conseguenza, studiare, attraverso l'uso dei miRNA15-16, il ruolo regolatore di questo
enzima può rivelarsi molto utile al fine di ottenere un quadro più chiaro della
deregolazione dell’apoptosi nel cancro.
Per ciò che concerne la potenziale applicazione terapeutica di questo risultato però,
è importante sottolineare che, mentre gli effetti off-target (OTE) sono prevenibili
disegnando opportunamente i siRNA (o shRNA), lo stesso non è possibile nel caso
dei miRNA, in quanto gli effetti pleiotropici (rispetto al target voluto PCMT) sono da
considerarsi senz’altro fisiologici per questa classe di molecole. Così, mentre miR15
e 16 hanno fisiologicamente vari target, lo stesso non è vero per i siRNA ( e gli
shRNA) se disegnati con caratteristiche adeguate. Ciò vuol dire che possiamo
ritenere che pur esplicando miRNA 15 e 16 la loro azione su diversi altri target, una
parte almeno degli effetti sull’apoptosi sia effettivamente mediata, nel modello
utilizzato, dalla loro azione di silenziamento di PCMT, che è stata chiaramente
dimostrata. Dunque possiamo concludere che:
A) i risultati ottenuti mediante shRNA e siRNA danno ulteriore supporto al ruolo di
regolazione effettuato da miR 15 e 16 su PCMT in quanto il silenziamento,
comunque ottenuto, di tale gene, si riflette in un fenotipo cellulare caratterizzato da
una maggiore sensibilità all’apoptosi.
B) siRNA (e shRNA) rappresentano probabilmente il migliore approccio per ottenere
il silenziamento di PCMT in vivo, in quanto sono più selettivi dei miR 15 e 16 rispetto
al target PCMT, perchè non si può escludere che manipolazioni della concentrazione
intracellulare di detti miRNA possano riflettersi in alterazioni pleiotropiche
dell’espressione di altri geni e proteine regolative dell’apoptosi.
117
Nel complesso questi risultati in prospettiva suggeriscono un uso futuro dell’RNA interferenziale come potenziale approccio alla terapia genica del cancro, attraverso l’inibizione dell’espressione della PCMT nei tessuti patologici.
I nostri risultati inoltre pongono le basi per studiare il possibile ruolo patogenetico di alterazioni dei miRNA15/16 anche in malattie non neoplastiche caratterizzate dalla deregolazione dell’apoptosi, quali l’Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e il Parkinson in cui la PCMT potrebbe giocare un
ruolo-chiave per la sopravvivenza del tessuto nervoso.
118
Figura 41. SCHEMA RIASSUNTIVO DEL RUOLO DEI siRNA/shRNA E DEI miRNA15/16 NELLA REGOLAZIONE DI PCMT NEL CANCRO.
119
RINGRAZIAMENTI
Sono molte le persone che desidero ringraziare per aver contribuito, con ruoli diversi
ma ugualmente importanti, al lavoro di ricerca di questi tre anni di dottorato. Il primo
e più importante grazie va al Prof. Diego Ingrosso e alla Prof.ssa. Patrizia Galletti,
supervisori della presente tesi. E` complicato esprimere, senza risultare formali, la
riconoscenza al loro costante impegno nell’accompagnarmi e spesso guidarmi nei
meandri della ricerca scientifica. Quel che vorrei riuscire a trasmettere qui, è un
ringraziamento che va al di là dell’ufficialità del rito, perchè assieme agli
insegnamenti scientifici sono stati prodighi di tempo, attenzione e pazienza.
Voglio inoltre ringraziare il Prof. Maurizio D’Esposito, controrelatore della presente
tesi, per i preziosi consigli e le interessanti osservazioni volti a migliorare la stesura
della presente tesi. Un grazie speciale va alla Dott.ssa Rosanna Capasso per la sua
versatilità scientifica e per la sua infinita disponibilità. E` poi doveroso ringraziare
tutte le ragazze del Lab 2, Filomena Flora, Marianna Raimo, Sofia Salemme e
Adriana Pirozzi per l’affetto e la simpatia che mi hanno dimostrato in questi anni di
lavoro in laboratorio. Un contributo decisivo (non me ne vogliano gli amici biochimici)
ma non esattamente di tipo scientifico è stata la presenza dei tanti amici che mi
hanno accompagnata in questi anni, supportandomi e sopportandomi. Non credo sia
necessario fare l’elenco dei nomi, spero che ognuno di loro si riconoscerà in questi
ringraziamenti, che rendo stringati solo per contenere la mia smodata tendenza al
sentimentalismo. Un grazie speciale va ad Alfredo, che ha un posto unico e speciale
nel mio cuore. Infine, ma solo in ordine di apparizione in questo spazio, un
ringraziamento infinito va alla mia famiglia, che ogni giorno mi fa sentire fortunata,
coccolata ed amata.
120
BIBLIOGRAFIA
Aagaard L, Rossi JJ. (2007) RNAi therapeutics: principles, prospects and challenges. Adv Drug Deliv Rev.;59(2-3):75-86. Review.
Agostini M, Pucciarelli S, Calore F, Bedin C, Enzo M, Nitti D.(2010) miRNAs in colon and rectal cancer: A consensus for their true clinical value. Clin Chim Acta.;411(17-18):1181-6. Review.
Ambros V. (2004) The functions of animal microRNAs. Nature. 431(7006):350-5.
Aqeilan RI, Calin GA, Croce CM. (2010) miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death Differ;17(2):215-20. Review.
Aritomi M, Kunishima N, Inohara N, Ishibashi Y, Ohta S, Morikawa K. (1997) Crystal structure of rat Bcl-xL. Implications for the function of the Bcl-2 protein family. J Biol Chem.272(44):27886-92.
Arya R, Mallik M, Lakhotia SC (2007) Heat shock genes–integrating cell survival and death. J Biosci 32: 595–610.
Aswad D.W. (1984). Stoichiometric methylation of porcine adenocorticotropin by protein carboxyl methyltrasferase requires deamidation of asparagines 25. Evidence for methylation at the alpha carboxyl group of atypical L-isoaspartyl residues. J.Biol. Chem., 259(17):10714-21.
Bala S, Marcos M, Szabo G. (2009) Emerging role of microRNAs in liver diseases. World J Gastroenterol.;15(45):5633-40.
Barber J.R., Clarke S. (1985). Demethylation of protein carboxyl methyl ester: a non enzymatic process in human erytrocites? Biochemistry, 24:4867-4871. Barh D, Malhotra R, Ravi B, Sindhurani P. (2010) Microrna let-7: an emerging next-generation cancer therapeutic. Curr Oncol. 17(1):70-80.
Bartel DP. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism and function. Cell. 116:281-97. Baulcombe, D.C. (1999). Fast forward genetics based on virusinduced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2, 109–113
121
Beere HM (2004)‘‘The stress of dying’’: the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J Cell Sci 117: 2641–2651.
Beezhold KJ, Castranova V, Chen F. (2010) Microprocessor of microRNAs: regulation and potential for therapeutic intervention. Mol Cancer.;9:134. Review.
Bentwich I., Avniel A., Karov Y., Aharonov R., Gilad S., Barad O., Barzilai A., Einat P., Einav U., Meiri E., Sharon E., Spector Y., Bentwich Z. (2005) Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37(7):766-70.
Bernstein E, Caudy AA, Hammond SA, and Hannon GJ. (2001).Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409:363-366 Bhagavathi S, Czader M. (2010) MicroRNAs in benign and malignant hematopoiesis. Arch Pathol Lab Med.;134(9):1276-81.
Bidinosti M, Martineau Y, Frank F, Sonenberg N. (2010) Repair of isoaspartate formation modulates the interaction of deamidated 4E-BP2 with mTORC1 in brain. J Biol Chem. Jun 18;285(25):19402-8.
Boatright KM, Salvesen GS. (2003) Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. Dec;15(6):725-31. Review. Böhme L, Hoffmann T, Manhart S, Wolf R, Demuth HU. (2008) Isoaspartate-containing amyloid precursor protein-derived peptides alter efficacy and specificity of potential beta-secretases. Biol Chem. Aug;389(8):1055-66.
Böhme L, Bär JW, Hoffmann T, Manhart S, Ludwig HH, Rosche F, Demuth HU. (2008) Isoaspartate residues dramatically influence substrate recognition and turnover by proteases.Biol Chem. Aug;389(8):1043-53.
Bonci D, Coppola V, Musumeci M, Addario A, Giuffrida R, Memeo L, D'Urso L, Pagliuca A, Biffoni M, Labbaye C, Bartucci M, Muto G, Peschle C, De Maria R. (2008) The miR-15a-miR-16-1 cluster controls prostate cancer by targeting multiple oncogenic activities. Nat Med.;14(11):1271-7.
Bratton DL, Fadok VA, Richter DA, Kailey JM, Guthrie LA, Henson PM. (1997) Appearance of phosphatidylserine on apoptotic cells requires calcium-mediated nonspecific flip-flop and is enhanced by loss of the aminophospholipid translocase. J Biol Chem. Oct 17;272(42):26159-65.
Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science.;296(5567):550-3.
122
Burchard J, Jackson AL, Malkov V, Needham RH, Tan Y, Bartz SR, Dai H, Sachs AB, Linsley PS. (2009) MicroRNA-like off-target transcript regulation by siRNAs is species specific. RNA.;15(2):308-15. Calin GA, Croce CM. (2006) MicroRNAs and chromosomal abnormalities in cancer cells. Oncogene.;25(46):6202-10. Review.
Calin GA, Liu CG, Sevignani C, Ferracin M, Felli N, Dumitru CD, Shimizu M, Cimmino A, Zupo S, Dono M, Dell'Aquila ML, Alder H, Rassenti L, Kipps TJ, Bullrich F, Negrini M, Croce CM. (2004) MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101(32):11755-60. Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, Bichi R, Zupo S, Noch E, Aldler H, Rattan S, Keating M, Rai K, Rassenti L, Kipps T, Negrini M, Bullrich F, Croce CM. (2002) Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A.;99(24):15524-9.
Campochiaro PA. (2006) Potential applications for RNAi to probe pathogenesis and develop new treatments for ocular disorders. Gene Ther. Mar;13(6):559-62. Review. Carmell MA. and Hannon GJ. (2004) RNase III enzymes and the initiation of gene silencing. Nature Struct. Mol. Biol. 11:214-18. Catalucci D, Gallo P, Condorelli G. (2009) MiRNAs in Cardiovascular Biology and Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet,; 4:402-408. Cerutti, L., Mian, N. And Bateman A.(2000).Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain. Trends Biochem. Sci. 25: 481-482 Chan JA., Krichevsky AM., Kosik KS. (2005) MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res. 65(14):6029-33.
Chan WM, Kalkanoglu AE, Ward BM. (2010) The inability of vaccinia virus A33R protein to form intermolecular disulfide-bonded homodimers does not affect the production of infectious extracellular virus. Virology.
Chang F, Steelman LS, Shelton JG, Lee JT, Navolanic PM, Blalock WL, Franklin R, McCubrey JA. (2003) Regulation of cell cycle progression and apoptosis by the Ras/Raf/MEK/ERK pathway.Int J Oncol. Mar;22(3):469-80. Review. Cimmino A, Capasso R, Muller F, Sambri I, Masella L, Raimo M, De Bonis ML, D'Angelo S, Zappia V, Galletti P, Ingrosso D. (2008) Protein isoaspartate methyltransferase prevents apoptosis induced by oxidative stress in endothelial cells: role of Bcl-Xl deamidation and methylation.PLoS One. Sep 22;3(9):e3258.
123
Cimmino A, Calin GA, Fabbri M, Iorio MV, Ferracin M, Shimizu M, Wojcik SE, Aqeilan RI, Zupo S, Dono M, Rassenti L, Alder H, Volinia S, Liu CG, Kipps TJ, Negrini M, Croce CM. (2005) miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2.nProc Natl Acad Sci U S A;102(39):13944-9. Epub 2005 Sep 15. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A.;103(7):2464.
Calin GA, Ferracin M, Cimmino A, Di Leva G, Shimizu M, Wojcik SE, Iorio MV, Visone R, Sever NI, Fabbri M, Iuliano R, Palumbo T, Pichiorri F, Roldo C, Garzon R, Sevignani C, Rassenti L, Alder H, Volinia S, Liu CG, Kipps TJ, Negrini M, Croce CM. (2005) A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. nN Engl J Med;353(17):1793-801. Erratum in: N Engl J Med. 3;355(5):533. Chen RW, Bemis LT, Amato CM, Myint H, Tran H, Birks DK, Eckhardt SG, Robinson WA. (2008) Truncation in CCND1 mRNA alters miR-16-1 regulation in mantle cell lymphoma. Blood.;112(3):822-9.
Clarke S. (2003). Aging as war between chemical and biochemical processes: protein methylation and the recognition of age-damaged proteins for repair. Ageing Res. Rev., 2(3):263-285.
Cogoni C, Irelan JT, Schumache, M, Schmidhauser T, Selker EU, and Macino G. (1996). Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J 15: 3153-3163.
Corti A, Curnis F, Arap W, Pasqualini R. (2008) The neovasculature homing motif NGR: more than meets the eye.Blood. Oct 1;112(7):2628-35. Review.
Curnis F, Cattaneo A, Longhi R, Sacchi A, Gasparri AM, Pastorino F, Di Matteo P, Traversari C, Bachi A, Ponzoni M, Rizzardi GP, Corti A. (2010) Critical role of flanking residues in NGR-to-isoDGR transition and CD13/integrin receptor switching. J Biol Chem. Mar 19;285(12):9114-23.
Curnis F, Sacchi A, Gasparri A, Longhi R, Bachi A, Doglioni C, Bordignon C, Traversari C, Rizzardi GP, Corti A. (2008) Isoaspartate-glycine-arginine: a new tumor vasculature-targeting motif. Cancer Res. Sep 1;68(17):7073-82.
Dedes KJ, Natrajan R, Lambros MB, Geyer FC, Lopez-Garcia MA, Savage K, Jones RL, Reis-Filho JS. (2010) Down-regulation of the miRNA master regulators Drosha and Dicer is associated with specific subgroups of breast cancer. Eur J Cancer.
Deng W, Lin H. (2002) Miwi, a murine homolog of piwi, encodes a cytoplasmic protein essential for spermatogenesis. Dev Cell2(6):819-30.
124
Deverman B.E., Cook B.L., Manson S.R., Niederhoff R.A., Langer E.M., Rosova I (2002). Bcl-xL deamidation is a critical switch in the regulation of the response to DNA damage. Cell, 111:1-20.
Desagher S, Martinou JC. (2000) Mitochondria as the central control point of apoptosis. Trends Cell Biol. Sep;10(9):369-77. Review.
Dietz V, Michel J. (2008) Locomotion in Parkinson's disease: neuronal coupling of upper and lower limbs. Brain.;131(Pt 12):3421-31. DiGiusto DL, Krishnan A, Li L, Li H, Li S, Rao A, Mi S, Yam P, Stinson S, Kalos M, Alvarnas J, Lacey SF, Yee JK, Li M, Couture L, Hsu D, Forman SJ, Rossi JJ, Zaia JA.(2010) RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med.;2(36):36ra43. Dinkins RD, Majee SM, Nayak NR, Martin D, Xu Q, Belcastro MP, Houtz RL, Beach CM, Downie AB. (2008) Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. Plant J. Jul;55(1):1-13.
Doench JG, Sharp PA. (2004) Specificity of microRNA target selection in translational repression. Genes Dev.;18(5):504-11.
Drummond MJ, McCarthy JJ, Sinha M, Spratt HM, Volpi E, Esser KA, Rasmussen BB. (2010) Aging and MicroRNA Expression in Human Skeletal Muscle: A Microarray and Bioinformatics Analysis. Physiol Genomics. Eis PS., Tam W., Sun L., Chadburn A., Li Z., Gomez MF., Lund E., Dahlberg JE. (2005) Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. PNAS 102:3627-32. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. (2001) RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs.Genes Dev.;15(2):188-200.
Ellis PA, Smith IE, Dowsett M. (1996) Apoptosis--its role in tumour growth and therapy. Cytopathology. Jun;7(3):201-3. Review.
Elmore S. (2007) Apoptosis: a review of programmed cell death.Toxicol Pathol.35(4):495-516. Review.
Esquela-Kerscher, A. and Slack, F.J. (2006)Oncomirs-microRNAs with a role in cancer. Nat. Rev. Cancer 6:259-269.
125
Fang P, Li X, Wang J, Xing L, Gao Y, Niu L, Teng M. (2010) Crystal structure of the protein L-isoaspartyl methyltransferase from Escherichia coli. Cell Biochem BiophysDec;58(3):163-7.
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC.(1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature.;391(6669):806-11. Fox S, Leitch AE, Duffin R, Haslett C, Rossi AG.(2010) Neutrophil apoptosis: relevance to the innate immune response and inflammatory disease. J Innate Immun.;2(3):216-27. Epub 2010 Feb 11. Review.
Friedman JM, Jones PA. (2009) MicroRNAs: critical mediators of differentiation, development and disease. Swiss Med Wkly. 139(33-34):466-72. Review. Galletti P., Ingrosso D., Manna C., Zappia V. (1995) Protein damage and methylation-mediated repair in the erytrocyte. Biochem.J., 306:313-325
Gardai SJ, McPhillips KA, Frasch SC, Janssen WJ, Starefeldt A, Murphy-Ullrich JE, Bratton DL, Oldenborg PA, Michalak M, Henson PM. (2005) Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell. Oct 21;123(2):321-34.
Gatta L, Cardinale A, Wannenes F, Consoli C, Armani A, Molinari F, Mammi C, Stocchi F, Torti M, Rosano GM, Fini M. (2009) Peripheral blood mononuclear cells from mild cognitive impairment patients show deregulation of Bax and Sod1 mRNAs. Neurosci Lett. Mar 27;453(1):36-40.
Giarnieri E, Zanesi N, Bottoni A, Alderisio M, Lukic A, Vecchione A, Ziparo V, Croce CM, Mancini R. (2009) Oncosuppressor proteins of fragile sites are reduced in cervical cancer. Cancer Lett. 2010 Mar 1;289(1):40-5. Grimaud R., Ezraty B., Mitchell j.K., Lafitte D., Briand C., Derrick P.J., Barras F. (2001). Repair of oxidized proteins: identification of a new methionine sulfoxide reductase. J. Biol. Chem., 276:48915-48920.
Grimm D, Kay MA.(2007) Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time? J Clin Invest.;117(12):3633-41. Review.
Grishok A, Tabar H, and Mello CC. (2000).Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science 287: 2494-2497
126
Guo S, and Kempheus KJ. (1995) Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81: 611-620 .
Ha I., Wightman B., Ruvkun G. (1996) A bulged lin-4/lin-14 RNA duplex is sufficient for Caenorhabditis elegans lin-14 temporal gradient formation. Genes Dev. 10:3041-50. Hanafy SM, Shehata OH, Farahat NM. (2010) Expression of apoptotic markers BCL-2 and Bax in chronic hepatitis C virus patients. Clin Biochem. Sep;43(13-14):1112-7 Hanada M, Takasu H, Kitaura M. (2010) Acquired resistance to miriplatin in rat hepatoma AH109A/MP10 is associated with increased Bcl-2 expression, leading to defects in inducing apoptosis. Oncol Rep.;24(4):1011-8.
Hake S (2003). MicroRNAs: a role in plant development. Curr. Biol. 13:851-52.
He L., Hannon GJ. (2004) MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat. Rev. Genet. 5(7):522-31.
He L., Thomson JM., Hemann MT., Hernando-Monge E., Mu D., Goodson S., Powers S., Cordon-Cardo C., Lowe SW., Hannon GJ., Hammond SM. (2005) A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435:828-33. Herranz H, Cohen SM. (2010) MicroRNAs and gene regulatory networks: managing the impact of noise in biological systems. Genes Dev;24(13):1339-44.
Higuchi Y, Kawakami S, Hashida M. (2010) Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs.;24(3):195-205. Hoyer D.(2007) RNA interference for studying the molecular basis of neuropsychiatric disorders. Curr Opin Drug Discov Devel.;10(2):122-9.
Horikawa Y, Wood CG, Yang H, Zhao H, Ye Y, Gu J, Lin J, Habuchi T, Wu X. (2008) Single nucleotide polymorphisms of microRNA machinery genes modify the risk of renal cell carcinoma. Clin Cancer Res.;14(23):7956-62.
Huebscher K.J., Lee J., Rovelli G., ludin B., Matus A., Stauffer D., (1999). Protein isoaspartyl methyl transferase protects from bax-induced apoptosis. Gene, 240:333-341.
Hutvagner G, McLachlan J, Pasquinelli AE, Balint E, Tuschl T, and Zamore PD. (2001).A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science 293:834-838
127
Ingrosso D., D’Angelo S., Di Carlo E., Perna A.F., Zappia V., Galletti P. (2000). Increased methyl esterification of altered aspartyl residues in erythocyte membrane proteins in response to oxidative stress. Eur. J. Chem., 267, 4397-4405.
Ingrosso D., Cimmino A., D’Angelo S., Alfinito F., Zappia V., Galletti P. (2002). Protein methylation as a marker of aspartate damage in G6PD-deficient erytrocytes. Role of oxidative stress. Eur. J. Biochem. 269:2032-2039.
Ingrosso D., fowler A.V., bieibaum J., Clarke S. (1989). Sequenze of the D-aspartyl/L-isoaspartyl methyltransferase from human erythrocytes: common sequenze motif for protein, DNA, RNA and small molecole S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase. J. Biol. Chem., 264:20131-20139.
Ingrosso D., Kagan R.M., Clarke S. (1991). Human erythrocyte D-aspartyl/L-isoaspartyl methyltransferase: enzymes that age-damaged proteins. In Red Blood Cell aging. M. Magnani, A. De Flora, Editors Plenum Press, New York, USA 263-276.
Ikeda T, Yamada M. (2010) [Risk factors for Alzheimer's disease] Brain
Nerve.;62(7):679-90.
Irrcher I, Park DS. (2009) Parkinson's disease: to live or die by autophagy. Sci Signal. Apr 7;2(65):pe21. Review.
Jezek D, Kozina V. (2009) Apoptosis during embryo development Acta Med Croatica. Oct;63 Suppl 2:37-41. Review.
Johnson B.A., Langmack E.L., Aswad D.W. (1987). Partial repair of deamidation-damaged calmodulin by protein carboxyl methyltransferase. J. Biol. Chem. 262:12283-12287.
Johnson SM, Grosshans H, Shingara J, Byrom M, Jarvis R, Cheng A, Labourier E, Reinert KL, Brown D, Slack FJ. (2005) RAS is regulated by the let-7 microRNA family.Cell.;120(5):635-47. Jorgensen RA, Cluster PD, English J, Que Q, and Napoli CA. (1996).Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol 31: 957-973.
Kaji Y. (2009)Ocular diseases caused by accumulation of proteins with post-translational modifications. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. Mar;113(3):424-42; discussion 443. Review.
128
Kasai K, Ushio A, Sawara K, Miyamoto Y, Kasai Y, Oikawa K, Kuroda H, Takikawa Y, Suzuki K. (2010) Transcatheter arterial chemoembolization with a fine-powder formulation of cisplatin for hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol.16(27):3437-44.
Kataoka Y, Takeichi M, Uemura T. (2001) Developmental roles and molecular characterization of a Drosophila homologue of Arabidopsis Argonaute1, the founder of a novel gene superfamily. Genes Cells.;6(4):313-25.
Kenny GD, Kamaly N, Kalber TL, Brody LP, Sahuri M, Shamsaei E, Miller AD, Bell JD.(2010) Novel multifunctional nanoparticle mediates siRNA tumour delivery, visualisation and therapeutic tumour reduction in vivo.J Control Release.
Kerr JF. (2002) History of the events leading to the formulation of the apoptosis concept. Toxicology. Dec 27;181-182:471-4. Review.
Khvorova A., Reynolds A. and Jayasena SD. (2003) Functional siRNA and miRNAs exhibit strand bias. Cell. 115:209-16.
Kim VN. (2005) Small RNAs: classification, biogenesis, and function. Mol Cells.
19(1):1-15.
Kim E., Lowenson J.D., MacLaren D.C., Clarke S. & Young S.G. (1997). Deficiency of a protein-repair enzyme results in the accumulation of altered proteins,retardation of growth, and fatal seizures in mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:6132-6137.
Kim E., Lowenson J.D., MacLaren D.C., Clarke S. & Young S.G. (1999). Phenotypic analysis of seizure-prone mice lacking L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase. J. Biol. Chem. 274:20671-20678. Kim BK, Park JY, Choi HJ, Kim DY, Ahn SH, Kim JK, Lee DY, Lee KH, Han KH. (2010) Long-term clinical outcomes of hepatic arterial infusion chemotherapy with cisplatin with or without 5-fluorouracil in locally advanced hepatocellular carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol.
Kim DH, Rossi JJ. (2007) Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet;8(3):173-84. Review.
Kloosterman WP, Plasterk RH. (2006) The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Dev Cell. 11(4):441-50.
129
Kossiakoff A.A. (1988). Tertiary structure is a principal determinant to protein deamidation. Science,240:191-193.
Krysko DV, Vanden Berghe T, Parthoens E, D'Herde K, Vandenabeele P. (2008) Methods for distinguishing apoptotic from necrotic cells and measuring their clearance. Methods Enzymol.;442:307-41. Krysko DV, Vanden Berghe T, D'Herde K, Vandenabeele P.(2008) Apoptosis and necrosis: detection, discrimination and phagocytosis. Methods. Mar;44(3):205-21. Review.
Król M, Pawłowski KM, Majchrzak K, Szyszko K, Motyl T. (2010) Why chemotherapy can fail? Pol J Vet Sci.;13(2):399-406. Review.
Lagos-Quintana., Rauhunt R., yalcin A., Meyer J., Lendeckel W., Tuschl T. (2002) Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Curr. Biol. 12:735-39.
Lanthier J, Desrosiers RR. (2004) Protein L-isoaspartyl methyltransferase repairs abnormal aspartyl residues accumulated in vivo in type-I collagen and restores cell migration.Exp Cell Res. Feb 1;293(1):96-105.
Lanthier J, Bouthillier A, Lapointe M, Demeule M, Béliveau R, Desrosiers RR. (2002) Down-regulation of protein L-isoaspartyl methyltransferase in human epileptic hippocampus contributes to generation of damaged tubulin.J Neurochem. Nov;83(3):581-91.
Landen CN, Goodman BW, Katre AA, Steg AD, Nick AM, Stone R, Miller L, Vivas-Mejia PE, Jennings NB, Gershenson DM, Bast RC Jr, Coleman RL, Lopez-Berestein G, Sood AK. (2010) Targeting Aldehyde Dehydrogenase Cancer Stem Cells in Ovarian Cancer. Mol Cancer Ther.
Lee Y., Ahn C., Han J., Choi H., Kim J., Yim J., LeeJ., Provost P., Radmark O., Kim S., Kim VN. (2003) The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature. 425:415-19. Lee EJ., Gusev Y., Jiang J., Nuovo GJ., Lerner MR., Frankel WL., Morgan DL., Postier RG., Brackett DJ., Schmittgen TD. (2006) Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. Int J Cancer. 120:1046-54. Lee RC., Feinbaum RL and Ambros V. (1993) The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75:843-54 Lees AJ, Katzenschlager R, Head J, Ben-Shlomo Y (2001) Ten-year follow-up of three different initial treatments in de-novo PD: a randomized trial. Neurology.;57(9):1687-94.
130
Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. (2005) Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.Cell. 120(1):15-20.
Leucci E, Cocco M, Onnis A, De Falco G, van Cleef P, Bellan C, van Rijk A, Nyagol J, Byakika B, Lazzi S, Tosi P, van Krieken H, Leoncini L. (2010) MYC translocation-negative classical Burkitt lymphoma cases: an alternative pathogenetic mechanism involving miRNA deregulation. J Pathol;216(4):440-50. Leuner K, Kurz C, Guidetti G, Orgogozo JM, Müller WE( 2010) Improved mitochondrial function in brain aging and Alzheimer disease - the new mechanism of action of the old metabolic enhancer piracetam. Front Neurosci.;4. pii: 44.
Li X, Lin C, O'Connor PB. (2010) Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. May 1;82(9):3606-15. Lingel A., Simon B., Izaurralde E. and Sattler M. (2003) Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain. Nature. 426:465-69.
Lim LP, Lau NC, Weinstein EG, Abdelhakim A, Yekta S, Rhoades MW, Burge CB, Bartel DP. (2003) The microRNAs of Caenorhabditis elegans.Genes Dev. 17(8):991-1008.
Li P.(2010) MicroRNAs in cardiac apoptosis. J Cardiovasc Transl Res.;3(3):219-24. Epub 2010 Mar 19. Review.
Liu J, Rivas FV, Wohlschlegel J, Yates JR 3rd, Parker R, Hannon GJ. (2005) A role for the P-body component GW182 in microRNA function.Nat Cell Biol. 2005 Dec;7(12):1261-6. Erratum in: Nat Cell Biol. 2006 Jan;8(1):100.
Liphaus BL, Kiss MH. (2010) The role of apoptosis proteins and complement components in the etiopathogenesis of systemic lupus erythematosus. Clinics (Sao Paulo). Mar;65(3):327-33.
Louis ED, Goldman JE, Powers JM, Fahn S. (1995) Parkinsonian features of eight pathologically diagnosed cases of diffuse Lewy body disease. Mov Disord. Mar;10(2):188-94. Review. Lowenson JD, Clarke S. (1992) Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. J Biol Chem.;267(9):5985-95. Lowenson JD, Kim E, Young SG, Clarke S. (2001) Limited accumulation of damaged proteins in l-isoaspartyl (D-aspartyl) O-methyltransferase-deficient mice. J Biol Chem. Jun 8;276(23):20695-702.
131
Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ. (2001) The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell. Feb 23;104(4):487-501. Review.
Lukiw W.J. (2007) Micro-RNA speciation in fetal, adult and Alzheimer's disease hippocampus. Neuroreport, 18:297-300.
Lüsebrink J, Schildgen V, Schildgen O. (2009) Novel therapies for an old virus: treatment of RSV infections in the 21st Century. Expert Rev Anti Infect Ther.;7(9):1125-9. Review.
Ma L., Teruya-Feldestein J. and Weinberg RA. (2007)Tumor invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer. Nature. 449:682-89.
Macfarlane DE. (1984) Inhibitors of cyclic nucleotide phosphodiesterases inhibit protein carboxyl methylation in intact blood platelets. J Biol Chem.;259(2):1357-62.
Mallanna SK, Rizzino A. (2010) Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol.;344(1):16-25. Epub 2010 May 15. Review.
Martin SS, Vuori K. (2004) Regulation of Bcl-2 proteins during anoikis and amorphosis. Biochim Biophys Acta. Jul 5;1692(2-3):145-57.
Martin MM., Lee EJ., Buckenberger JA., Schmittgen TD., Elton TS. (2006) MicroRNA-155 regulates human angiotensin II type 1 receptor expression in fibroblasts. J Biol Chem 281:18277-84.
Matzke M., Aufsatz W, Kanno T, Daxinger L, Papp I, Mette MF, Matzke AJ. (2004) Genetic analysis of RNA-mediated transcriptional gene silencing. Biochim. Biophys. Acta, 1677, 129-141.
Mcfadden M. (1995) Owning death. Hum Life Rev. 21(4):37-45.
McFarland TJ, Zhang Y, Appukuttan B, Stout JT.(2004) Gene therapy for proliferative ocular diseases. Expert Opin Biol Ther. 4(7):1053-8. Review.
Melki MT, Saïdi H, Dufour A, Olivo-Marin JC, Gougeon ML.(2010) Escape of HIV-1-infected dendritic cells from TRAIL-mediated NK cell cytotoxicity during NK-DC cross-talk--a pivotal role of HMGB1.PLoS Pathog. 6(4):e1000862.
Meng F., Henson R., Lang M., Wehbe H., Maheshwari S., Mendell JT., Jiang J., Schmittgen TD., Patel T. (2006) Involvement of human micro-RNA in growth and response to chemotherapy in human cholangiocarcinoma cell lines. Gastroenterology. 130:2113-29.
132
Meng F., Henson R., Wehbe-Janek H., Ghoshal K., Jacob ST., Patel T. (2007) MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer. Gastroenterology. 133:647-58.
Metzstein MM, Stanfield GM, Horvitz HR. (1998) Genetics of programmed cell death in C. elegans: past, present and future.Trends Genet. Oct;14(10):410-6. Review.
Mihara M, Erster S, Zaika A, Petrenko O, Chittenden T, Pancoska P, Moll UM. (2003) p53 has a direct apoptogenic role at the mitochondria. Mol Cell. Mar;11(3):577-90.
Mizuguchi M, Sohma O, Takashima S, Ikeda K, Yamada M, Shiraiwa N, Ohta S. (1996) Immunochemical and immunohistochemical localization of Bcl-x protein in the rat central nervous system.Brain Res.;712(2):281-6.
Moll UM, Zaika A. (2001) Nuclear and mitochondrial apoptotic pathways of p53. FEBS Lett. Mar 30;493(2-3):65-9. Review.
Moss EG., Lee RC., Ambros V. (1997) The cold shock domain protein LIN-28 controls developmental timing in C. elegans and is regulated by the lin-4 RNA. Cell. 88:637-46. Mukherjee R, Adhikary L, Khedkar A, Iyer H. (2010) Probing deamidation in therapeutic immunoglobulin gamma (IgG1) by 'bottom-up' mass spectrometry with electron transfer dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. Apr 15;24(7):879-84.
Murphy FJ, Hayes I, Cotter TG. (2003) Targeting inflammatory diseases via apoptotic mechanisms. Curr Opin Pharmacol. Aug;3(4):412-9.
Murray ED Jr, Clarke S. (1984) Synthetic peptide substrates for the erythrocyte protein carboxyl methyltransferase. Detection of a new site of methylation at isomerized L-aspartyl residues. J Biol Chem.;259(17):10722-32.
Murray E.D. Jr, Clarke S. (1986). Metabolism of a synthetic L-isoaspartyl-containing hexapeptide in erythrocyte extracts. Enzymatic methylesterification is followed by non enzymatic succinimide formation. J. Biol. Chem., 261:306-312.
Nagata S, Hanayama R, Kawane K. (2010) Autoimmunity and the clearance of dead cells. Cell. Mar 5;140(5):619-30. Review.
Najbauer J, Orpiszewski J, Aswad DW. (1996) Molecular aging of tubulin: accumulation of isoaspartyl sites in vitro and in vivo. Biochemistry. Apr 23;35(16):5183-90.
133
Ni W, Dai S, Karger BL, Zhou ZS. (2010) Analysis of isoaspartic Acid by selective proteolysis with Asp-N and electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal Chem. Sep 1;82(17):7485-91. Nielsen K, Sparre T, Larsen MR, Nielsen M, Fey SJ, Mose Larsen P, Roepstorff P, Nerup J, Karlsen AE. (2004) Protein expression changes in a cell system of beta-cell maturation reflect an acquired sensitivity to IL-1beta. Diabetologia.;47(1):62-74. Nielsen CB, Shomron N, Sandberg R, Hornstein E, Kitzman J, Burge CB.(2007) Determinants of targeting by endogenous and exogenous microRNAs and siRNAs. RNA.;13(11):1894-910.
Nykanen A, Haley B, and Zamore PD. (2001).ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107:309-321 Noguchi S. (2010) Isomerization mechanism of aspartate to isoaspartate implied by structures of Ustilago sphaerogena ribonuclease U2 complexed with adenosine 3'-monophosphate. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. Jul;66(Pt 7):843-9. Noma K. Sugiyama T, Cam H, Verdel A, Zofall M, Jia S, Moazed D, Grewal SI.(2004) RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing. Nat. Genet, 36:1174-1180
Novakova J, Slaby O, Vyzula R, Michalek J. (2009) MicroRNA involvement in glioblastoma pathogenesis. Biochem Biophys Res Commun.;386(1):1-5. O’Donnel KA., Wentzel EA., Zeller KI., Dang CV., Mendell JT. (2005) C-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature. 435:839-43.
Ogé L, Bourdais G, Bove J, Collet B, Godin B, Granier F, Boutin JP, Job D, Jullien M, Grappin P. (2008) Protein repair L-isoaspartyl methyltransferase 1 is involved in both seed longevity and germination vigor in Arabidopsis. Plant Cell. 20(11):3022-37.
Oh YJ, Park YM, Kim BH, Kim MJ, Cho JH, Cha CW, Park SJ, Yeon JW.(2009) A case of hepatocellular carcinoma with pulmonary metastases treated successfully with a combination of repeated hepatic arterial infusion epirubicin and Cisplatin chemotherapy and systemic low-dose infusion of 5-Fluorouracil. Gut Liver.;3(4):343-8.
Okamura K, Ishizuka A, Siomi H, Siomi MC. (2004) Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18(14):1655-66. Orrenius S, Zhivotovsky B, Nicotera P. (2003) Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link.Nat Rev Mol Cell Biol. Jul;4(7):552-65. Review.
134
Ota I.M., Clarke S. (1991). The function and enzymology of protein D-aspartyl/L-isoaspartyl methyltransferase in eukaryotic and procariotic cells. In Protein Methylation W.K. Paik,S.Kim,editors. CRC Press., Boca Raton,Florida,USA. 179-194. Paddison PJ, Caudy AA, Hannon GJ. (2002) Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A.;99(3):1443-8.
Pallante P, Visone R, Croce CM, Fusco A.(2010) Deregulation of microRNA expression in follicular-cell-derived human thyroid carcinomas. Endocr Relat Cancer;17(1):F91-104.
Pandit, N.N. and Russo V. (1992).Reversible inactivation of foreign gene, hph, during asexual cycle in Neurospora crassa trasformants. Mol.Gen. Genet. 234, 412-422.
Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F, Martindale MQ, Kuroda MI, Maller B, Hayward DC, Ball EE, Degnan B, Müller P, Spring J, Srinivasan A, Fishman M, Finnerty J, Corbo J, Levine M, Leahy P, Davidson E, Ruvkun G.(2000) Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408(6808):86-9.
Pelengaris S., Khan M. and Evan GI. (2002) Suppression of Myc-induced apoptosis in س�cells exposes multiple oncogenic properties of Myc and triggers carcinogenic progression. Cell. 109:321-34. Pepperkok R, Hotz-Wagenblatt A, König N, Girod A, Bossemeyer D, Kinzel V. (2000) Intracellular distribution of mammalian protein kinase A catalytic subunit altered by conserved Asn2 deamidation. J Cell Biol. Feb 21;148(4):715-26. Perna AF, Ingrosso D, De Santo NG, Galletti P, Zappia V. (1995) Mechanism of erythrocyte accumulation of methylation inhibitor S-adenosylhomocysteine in uremia. Kidney Int;47(1):247-53.
Perna AF, Ingrosso D, Zappia V, Galletti P, Capasso G, De Santo NG. (1993) Enzymatic methyl esterification of erythrocyte membrane proteins is impaired in chronic renal failure. Evidence for high levels of the natural inhibitor S-adenosylhomocysteine. J Clin Invest;91(6):2497-503. Petersen CP., Bordeleau ME., Pelletier J., Sharp PA. (2006) Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Mol Cell. 21(4):533-42.
Piñon JD, Labi V, Egle A, Villunger A. (2008) Bim and Bmf in tissue homeostasis and malignant disease. Oncogene. Dec;27 Suppl 1:S41-52. Review.
135
Ploner C, Kofler R, Villunger A. (2008) Noxa: at the tip of the balance between life and death. Oncogene. Dec;27 Suppl 1:S84-92. Review.
Potter SM, Henzel WJ, Aswad DW. (1993) In vitro aging of calmodulin generates isoaspartate at multiple Asn-Gly and Asp-Gly sites in calcium-binding domains II, III, and IV. Protein Sci.;2(10):1648-63. Prakash S, Malhotra M, Rengaswamy V. (2010) Nonviral siRNA delivery for gene silencing in neurodegenerative diseases. Methods Mol Biol;623:211-29.
Provencio M, Mart X00ed N P, Garc X00ed A V, Candia A, S X00e1 Nchez AC, Bellas C. (2010) Caspase 3a: new prognostic marker for diffuse large B-cell lymphoma in the rituximab era. Leuk Lymphoma. Pulukuri S.M. and Rao J.S. (2007) Small interfering rna-directed reversal of urokinase plasminogen activator demethylation inhibits prostate tumor growth and metastasis. Cancer Res. 67:6637-6646.
Rana TM. (2007) Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol. 8(1):23-36. Review. Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinelli AE, Bettinger JC, Rougvie AE, Horvitz HR, Ruvkun G. (2000) The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature.;403(6772):901-6.
Reissner KJ, Aswad DW. (2003) Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals?Cell Mol Life Sci. Jul;60(7):1281-95. Review.
Reissner KJ, Paranandi MV, Luc TM, Doyle HA, Mamula MJ, Lowenson JD, Aswad DW.(2006) Synapsin I is a major endogenous substrate for protein L-isoaspartyl methyltransferase in mammalian brain. J Biol Chem Mar 31;281(13):8389-98.
Reyes NA, Fisher JK, Austgen K, VandenBerg S, Huang EJ, Oakes SA. (2010) Blocking the mitochondrial apoptotic pathway preserves motor neuron viability and function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Clin Invest. 120(10):3673-9 Rodriguez A., Griffiths-Jones S., Ashurst JL., Bradley A. (2004) Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14:1902-1910.
Rogers S., Reichsteiner M. (1988). Degradation of structurally characterized proteins injected into HeLa cells. J.Biol.Chem.263:19850-19862.
136
Romano, N., and Macino, G. (1992).Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by trasformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 6, 3343-3353.
Robinson N.E., Robinson A.B. (2004). Deamidation of asparaginyl and glutaminyl residues in peptides and proteins. Proc. NAtl. Acad. Sci. USA 63 (5): 437-439. Ruan H., Tang X.D., Chen M.L., Joiner M.L.A., Sun G., Brot N., Weissbach H., Heinemann S.H., Iverson L., Wu C.F., Hoshi T. (2002). High quality life extension by the enzyme peptide metionine sulfoxide reductase. Proc.Natl. Acad. Sci.USA. 99:2748-2753. Ruchalski K, Mao H, Li Z, Wang Z, Gillers S (2006) Distinct hsp70 domains mediate apoptosis-inducing factor release and nuclear accumulation. J Biol Chem 281: 7873–7880.
Rutherford K, Daggett V. (2009) The V119I polymorphism in protein L-isoaspartate O-methyltransferase alters the substrate-binding interface. Protein Eng Des Sel. Dec;22(12):713-21. Saelens X, Festjens N, Vande Walle L, van Gurp M, van Loo G, Vandenabeele P.(2004) Toxic proteins released from mitochondria in cell death. Oncogene. Apr 12;23(16):2861-74. Review.
Sambrook J, Gething MJ. (1989) Protein structure. Chaperones, paperones. Nature;342(6247):224-5.
Sargaeva NP, Lin C, O'Connor PB. (2009) Identification of aspartic and isoaspartic acid residues in amyloid beta peptides, including Abeta1-42, using electron-ion reactions. Anal Chem. Dec 1;81(23):9778-86.
Schiene C., Fischer G. (2000). Enzymes that catalyze the restructuring of proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 10:40-45.
Schwarz, D. S., Hutvagner, G., Haley, B. & Zamore, P. D. (2002).Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Mol. Cell 10, 537–548
Schwarz DS, Ding H, Kennington L, Moore JT, Schelter J, Burchard J, Linsley PS, Aronin N, Xu Z, Zamore PD. (2006) Designing siRNA that distinguish between genes that differ by a single nucleotide. PLoS Genet. ;2(9):e140. Schwarz DS., Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore PD. (2003) Asimmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell. 115(2):199-208.
137
Scorrano L, Korsmeyer SJ. (2003) Mechanisms of cytochrome c release by proapoptotic BCL-2 family members. Biochem Biophys Res Commun. May 9;304(3):437-44. Review. Scott GK, Mattie MD, Berger CE, Benz SC, Benz CC.(2006) Rapid alteration of microRNA levels by histone deacetylase inhibition. Cancer Res.;66(3):1277-81.
Sebastian S, Azzariti A, Silvestris N, Porcelli L, Russo A, Paradiso A. (2010). p53 as the main traffic controller of the cell signaling network. Front Biosci. Jun 1;15:1172-90. Review. Selcuklu SD, Donoghue MT, Spillane C. (2009) miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochem Soc Trans.;37(Pt 4):918-25. Review
Shimizu T, Ikegami T, Ogawara M, Suzuki Y, Takahashi M, Morio H, Shirasawa T. (2002) Transgenic expression of the protein-L-isoaspartyl methyltransferase (PIMT) gene in the brain rescues mice from the fatal epilepsy of PIMT deficiency. J Neurosci Res. Aug 1;69(3):341-52.
Sharp PA, and Zamore PD. (2000).RNA Interference. Science 287: 2431-2433
Sijen, T. (2001). Transcriptional and posttranscriptional gene silencing are mechanistically related. Curr. Biol. 11, 436–440
Sionov RV, Haupt Y. (1999). The cellular response to p53: the decision between life and death. Oncogene. Nov 1;18(45):6145-57.
Si ML., Zhu S., Wu H., Lu Z., Wu F., Mo YY. (2007) miR-21-mediated tumor growth. Oncogene. 26:2799-2803.
Sohma O, Mizuguchi M, Takashima S, Yamada M, Ikeda K, Ohta S. (1996) High expression of Bcl-x protein in the developing human cerebellar cortex. J Neurosci Res.;43(2):175-82.
Song JJ., Liu J., Tolia NH., Schneiderman J., Smith SK., Martienssen RA. (2003) The crystal structure of the Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding motif in RNAi effector complexes. Nature Struct. Biol. 10:1026-32.
Song JJ., Smith SK., Hannon GJ., Joshua-Tor. (2004) Crystal structure of the Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science. 305:1434-1437.
Stephenson R.C., Clarke S. (1989). Succinimide formation from aspartyl and asparaginyl peptides as a model for the spontaneous degradation of protein. J. Biol. Chem. 264:6164-6170.
138
Suzuki H, Yamamoto E, Nojima M, Kai M, Yamano HO, Yoshikawa K, Kimura T, Kudo T, Harada E, Sugai T, Takamaru H, Niinuma T, Maruyama R, Yamamoto H, Tokino T, Imai K, Toyota M, Shinomura Y. (2010)Methylation-associated silencing of microRNA-34b/c in gastric cancer and its involvement in an epigenetic field defect. Carcinogenesis.
Tang YA, Wen WL, Chang JW, Wei TT, Tan YH, Salunke S, Chen CT, Chen CS, Wang YC. (2010) A novel histone deacetylase inhibitor exhibits antitumor activity via apoptosis induction, F-actin disruption and gene acetylation in lung cancer. PLoS One. Sep 14;5(9):e12417.
Tang P, Chen WQ, Shen WY (2010) [Effectiveness of p38MAPK activity during drug resistance against HepG2]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi.;18(8):604-8.
Takehara T. and Takahashi H. (2000). Asparagine deamidation as a novel post translational modification of Bcl-x L. Gastroenterology. 118 [4 Suppl.2,1]: AGA A443
Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, Tomida S, Osada H, Endoh H, Harano T, Yatabe Y, Nagino M, Nimura Y, Mitsudomi T, Takahashi T. (2004) Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res;64(11):3753-6.
Tarawneh R, Galvin JE. (2010) Potential future neuroprotective therapies for neurodegenerative disorders and stroke. Clin Geriatr Med.;26(1):125-47. Review.
Tarrants ML, Denarié MF, Castelli-Haley J, Millard J, Zhang D. (2010) Drug therapies for Parkinson's disease: A database analysis of patient compliance and persistence. Am J Geriatr Pharmacother.;8(4):374-83.
Thiruchelvam M, Prokopenko O, Cory-Slechta DA, Buckley B, Mirochnitchenko O. (2008) Overexpression of superoxide dismutase or glutathione peroxidase protects against the paraquat + maneb-induced Parkinson disease phenotype. J Biol Chem. 2008 Nov 7;283(45):31268.
Uchida Y.(2010) Molecular mechanisms of regeneration in Alzheimer's disease brain. Geriatr Gerontol Int.;10 Suppl 1:S158-68. Review.
Vigneswara V, Lowenson JD, Powell CD, Thakur M, Bailey K, Clarke S, Ray DE, Carter WG. (2006) Proteomic identification of novel substrates of a protein isoaspartyl methyltransferase repair enzyme. J Biol Chem. Oct 27;281(43):32619-29.
Vlasak J, Bussat MC, Wang S, Wagner-Rousset E, Schaefer M, Klinguer-Hamour C, Kirchmeier M, Corvaïa N, Ionescu R, Beck A. (2009) Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody.Anal Biochem. Sep 15;392(2):145-54.
139
Volinia S., Calin GA., Liu CG., Ambs S., Cimmino A., Petrocca F., visone R., Iorio M., Roldo C., Ferracin M., Prueitt RL., Yanaihara N., Lanza G., Scarpa A., Vecchione A., Negrini M., harris CC., Croce CM. (2006) A microRNA expression segnature of human solid tumors defines cancer gene targets. PNAS. 103:2257-61.
Wägner AM, Cloos P, Bergholdt R, Boissy P, Andersen TL, Henriksen DB, Christiansen C, Christgau S, Pociot F, Nerup J. (2007) Post-translational protein modifications in type 1 diabetes: a role for the repair enzyme protein-L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase? Diabetologia.;50(3):676-81.
Wei K, Chen J, Akrami K, Galbraith GC, Lopez IA, Chen F. (2007) Neural crest cell deficiency of c-myc causes skull and hearing defects.Genesis 45(6):382-90.
Weinreb O, Amit T, Bar-Am O, Chillag-Talmor O, Youdim MB. (2005) Novel neuroprotective mechanism of action of rasagiline is associated with its propargyl moiety: interaction of Bcl-2 family members with PKC pathway. Ann N Y Acad Sci.;1053:348-55. Review. Wightman B., Ha I., Ruvkun G.(1993) Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75:855-62.
Woods K., Thomson JM., Hammond SM. (2007) Direct regulation of an oncogenic micro-RNA cluster by E2F transcription factors. J Biol Chem. 282:2130-34. Wright H.T. (1991). Sequence and structure determinants of the non enzymatic deamidation of asparagines and glutamine residues in proteins. Protein Eng. 4:238-294.
Wright JA, Richer JK, Goodall GJ. (2010) microRNAs and EMT in mammary cells and breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia;15(2):213-23.. Review. Xie H., Lim B., Lodish HF. (2009) MiRNAs Induced During Adipogenesis that Accelerate Fat Cell Development Are Downregulated in Obesity. Diabetes, , 58:1060-1067.
Yamazaki Y, Fujii N, Sadakane Y, Fujii N. (2010) Differentiation and semiquantitative analysis of an isoaspartic acid in human alpha-Crystallin by postsource decay in a curved field reflectron.Anal Chem. Aug 1;82(15):6384-94.
140
Yamasaki T, Hamabe S, Saeki I, Harima Y, Yamaguchi Y, Uchida K, Terai S, Sakaida I.(2010)A novel transcatheter arterial infusion chemotherapy using iodized oil and degradable starch microspheres for hepatocellular carcinoma: a prospective randomized trial. J Gastroenterol.
Yang ML, Doyle HA, Gee RJ, Lowenson JD, Clarke S, Lawson BR, Aswad DW, Mamula MJ.(2006) Intracellular protein modification associated with altered T cell functions in autoimmunity.J Immunol. Oct 1;177(7):4541-9. Erratum in: J Immunol. 2006 Dec 15;177(12):8878.
Yenpetch W, Packdibamrung K, Zimmermann W, Pongsawasdi P. (2010) Evidence of the Involvement of Asparagine Deamidation in the Formation of Cyclodextrin Glycosyltransferase Isoforms in Paenibacillus sp. RB01. Mol Biotechnol.
Zamore, P.D.. (2002).Ancient pathways programmed by small RNAs. Science 296: 1265-1269
Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, and Bartel DP. (2000). RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101: 25-33 Zeng Y. and Cullen BR. (2003) Sequence requirements for microRNA processing and function in human cells. RNA. 9:175-79.
Zhao R., Oxley D., Smith T., Follows G., Green A., Alexander D. (2007). DNA Damage-Induced Bcl-xL Deamidation Is Mediated by NHE-1 Antiport Regulated Intracellular pH. Plos Biol. 19;5(1):e1
Zhao R., Oxley D., Smith T., Follows G., Green A., Alexander D. (2007). DNA Damage-Induced Bcl-xL Deamidation Is Mediated by NHE-1 Antiport Regulated Intracellular pH. Plos Biol. 19;5(1):e1
Zhou Y, Ling XL, Li SW, Li XQ, Yan B. (2010) Establishment of a human hepatoma multidrug resistant cell line in vitro. World J Gastroenterol. 14;16(18):2291-7. Zhu S., Si ML., Wu H., Mo YY. (2007) MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene Tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem. 282:14328-36.
Zhu H, Yang W, Lu W, Zhang J, Shaw GM, Lammer EJ, Finnell RH. (2006) A known functional polymorphism (Ile120Val) of the human PCMT1 gene and risk of spina bifida. Mol Genet Metab. Jan;87(1):66-70.
Zhu JX, Doyle HA, Mamula MJ, Aswad DW. (2006) Protein repair in the brain, proteomic analysis of endogenous substrates for protein L-isoaspartyl methyltransferase in mouse brain.J Biol Chem. Nov 3;281(44):33802-13.
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ABBREVIAZIONI
• AdoHcy: adenosil omocisteina • AdoMet o SAM: adenosil metionina
