Tesi di Laurea
FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico
IL CONTROLLO QUALITÀ NELLA
PRODUZIONE FARMACEUTICA
INDUSTRIALE: APPLICAZIONE DI UNA
METODICA PER L’ANALISI DEI
PROBIOTICI VALIDATA DALL’ISTITUTO
SUPERIORE DI SANITÀ
Relatore: Dott. Renzo Peressoni Correlatore: Dott. Franco Del Bianco Laureando: Luca Michelutti
CENNI STORICI
1892 Döderlein propone l’uso di lattobacilli nelle
infezioni vaginali
1900 Henry Tissier isola bifidobatteri da feci di neonati
allattati
1907 Metchnikoff teorizza l’uso di batteri utili nel
rimpiazzo di batteri dannosi nell’intestino umano
1917 Nissle tratta salmonellosi e shigellosi con un ceppo
di Escherichia coli non patogeno
Ad oggi numerosi sono i microrganismi batterici e non
definiti probiotici, e il numero è continuamente in
crescita
DEFINIZIONE
Microrganismi vitali che, somministrati
in quantità adeguate, apportano
benefici alla salute dell’ospite
(FAO/WHO, 2002)
IL MICROBIOTA INTESTINALE
L’apparato gastroenterico è colonizzato da 1013-1014 cellule
batteriche, con oltre 500 specie complessivamente
Oltre a batteri sono presenti
anche archeabatteri,
eucarioti e virus
Fornisce diversi contributi:
Attività metaboliche
Funzioni trofiche
Funzione protettiva
MICRORGANISMI PROBIOTICI
Un probiotico deve essere:
Sicuro per l’uomo
Vitale ed efficace nell’intestino umano
Conferire benefìci fisiologici
ALCUNI MICRORGANISMI PROBIOTICI
Bifidobacterium spp
Sono microrganismi
Gram-positivi, a morfologia
bastoncellare, anaerobi. Si
trovano in diverse nicchie
ecologiche tra le quali vi è
l’intestino umano.
Lactobacillus spp
Sono microrganismi Gram-positivi,
anaerobi facoltativi o microaerofili,
a morfologia prevalentemente
bastoncellare. Sono presenti anche
nell’uomo, soprattutto nel tratto
gastrointestinale e nel tratto
genitale femminile.
Si suddividono in base alle loro
caratteristiche in: omofermentanti
(L. acidophilus), eterofermentanti
facoltativi (L. paracasei) ed
eterofermentanti obbligati (L. reuteri)
Bacillus coagulans
È un microrganismo
Gram-positivo,
anaerobio tollerante,
sporigeno.
È una specie
ubiquitaria in natura
IL RAPPORTO ISTISAN 08/36
MATERIALI E METODO DI LAVORO
Prelievo e campionamento
Identificazione genetica
Conta batterica probiotica
Conferma genetica e conta differenziale
Controllo microbiologico
Carica totale, carica di lieviti e muffe, carica di
enterobatteri.
Presenza di Staphylococcus aureus, Escherichia coli e
Salmonella.
RISULTATI
Reagenti di PCR Concentrazione finale
H2O distillata sterile ----
Buffer 10X 1 X
MgCl2 25 mM 1,5 mM
dNTPs 2,5 mM 0,2 mM
Primer senso 100 µM 0,5 mM
Primer antisenso 100 µM 0,5 mM
DNA Da 1 µL a 5 µL
Taq DNA polymerase 5U/µL 1,25 U
Volume finale di 50 µL
Specie Primer Ciclo
iniziale
Denatu-
razione
Annealing Estensione Cicli
totali
Ciclo
finale
B.
coagulans Spo3 +
Spo4
95°C x
5 min
95°C x
1 min
65°C x 1
min
72°C x 1
min
30 72°C x
10 min
Bifidobac-
terium spp BifidF
+
BifidR
96°C x
2 min
94°C x
30 sec
63°C x
40 sec
72°C x 30
sec
35 72°C x
5 min
L.
acidophilus Idlc4F
+
Idl22R
94° C x
2 min
94°C x
20 sec
51°C x
40 sec
68°C x 30
sec
35 68°C x
7 min
L.
paracasei W2 +
Y2
94°C x
3 min
94°C x
45 sec
50°C x
45 sec
72°C x 1
min
45 72°C x
5 min
RISULTATI
Microrganismo Terreno
di
coltura
Condizioni
di
incubazione
Temperatura
di
incubazione
Tempo di
incubazione
Bifidobacterium
spp. MRS Anaerobiosi 37°C 72 h
HHD Anaerobiosi 37°C 72 h
Lactobacillus
acidophilus MRS Anaerobiosi 37°C 72 h
HHD Anaerobiosi 37°C 72 h
Lactobacillus
paracasei MRS Anaerobiosi 37°C 72 h
HHD Anaerobiosi 37°C 72 h
RISULTATI
Microrganismo Terreno
di coltura
Condizioni di
incubazione
Temperatura
di incubazione
Tempo
di incubazione
Bacillus coagulans
TSA Aerobiosi 37°C Almeno 24 h
Nutrient
Agar
Aerobiosi 37°C Almeno 24 h
GYE Aerobiosi 37°C Almeno 24 h
TSA Aerobiosi 44°C Almeno 24 h
Nutrient
Agar
Aerobiosi 44°C Almeno 24 h
GYE Aerobiosi 44°C Almeno 24 h
TSA Aerobiosi 50°C Almeno 24 h
Nutrient
Agar
Aerobiosi 50°C Almeno 24 h
GYE Aerobiosi 50°C Almeno 24 h
RISULTATI
Brodo di coltura Specie
HHD Bifidobacterium spp.
Lactobacillus spp.
MRS Lactobacillus spp.
TSB Bacillus coagulans
CONCLUSIONI
Aspetti positivi del metodo
Facilità d’utilizzo
Applicabilità per numerosi prodotti commerciali
Limiti del metodo
Tempi lunghi di analisi e metodiche superate
Protocolli non sempre adatti
Assenza di indicazioni per nuove specie
probiotiche