Il DNA ed il flusso dell’informazione genetica
Sequenza di residui (nucleotidi)
composti da basi azotate (pirimidine
o purine), legate al D-Ribosio (RNA) o
al Desossiribosio (DNA) (nella forma
ciclica), polimerizzate mediante
legami 3’,5’-fosfodiestere.
• Le catene polinucleotidiche hanno
una direzione - Per convenzione va
dal carbonio 5' del ribosio al
carbonio 3‘.
(5’ 3’)
P P
3' 3' 3'
OH
5' 5' 5'
HO
DNA/RNA struttura 1°a
struttura 2°a del DNA
• doppia elica destrogira - catene antiparallele con asse comune.
• il piano delle basi è perpendicolare all'asse – i ribosi e gruppi fosfato sono esterni, e le
basi interne all’elica (interazioni idrofobiche).
• Le basi interagiscono in maniera SPECIFICA (G:C o A:T) mediante legami-H
(NB specificità determina replicazione/traduzione)
fosfati
ribosi
basi
(5’ 3’)
(3’ 5’)
struttura 2°a del DNA (cont.)
• elica con diametro 20Å – basi impilate ogni 3.4 Å con torsione di 36°, 1
giro/10 res.
• struttura dinamica (Forma B A e Z ) a secondo delle condizioni
• l’OH sul C2’ impedisce doppie eliche stabili di forma B per l’RNA. La
doppia elica ibrida RNA/DNA è più stabile.
• Il DNA presenta due scanalature avvolte attorno all'asse (solco
maggiore e solco minore), foderati dai lati esterni delle basi, che
possono formare legami-H con proteine (portano ad interazioni
specifiche riconoscimento di specifiche sequenze ).
• Le due catene del DNA sono complementari - si associano per
interazioni specifiche e cooperative. La sequenza di basi codifica
l’informazione genetica (catena codificante e catena stampo)
• la replicazione è semiconservativa +
• la grandezza del DNA è misurata in kilobasi o megabasi.
struttura 3°a del DNA
• Le molecole di DNA possono essere lineari o circolari (es. cromosomi procariotici, plasmidi).
In questo caso, se sono troppo o poco avvolte ( 10 res./giro), per ragioni energetiche
(rilassamento dello strain) formano strutture topologiche superiori (strutture superavvolte).
• Il superavvolgimento è comunque necessario per impaccare queste grandi molecole in uno
spazio ristretto e, ovviamente, ha un effetto sulla loro interazione con altre molecole.
• Il superavvolgimento può essere negativo e positivo (dipende dal senso d’avvolgimento)
• Le topoisomerasi possono fare variare il grado di superavvolgimento effettuando tagli
transienti a livello di uno od entrambe i filamenti di DNA
Il codice genetico
• Ci sono 20 AA. Un codice genetico basato su singole basi codificherebbe per solo 4, uno
basato so doppiette di basi per 16. Si deve quindi basare almeno su triplette di basi, che
permette 43 = 64 diverse unità di informazione. C’è ridondanza nel codice genetico.
• Il codice genetico è UNIVERSALE. Cambia di pochissimo nei diversi organismi. Solo i
mitocondri hanno un codice lievemente diverso.
Esempi
UUU o UUC = codoni per Phe
UCU, UCC, UCA, UCG, AGU,
AGC = codoni per Ser
AUG = codone per Met
AUG = codone START
UAA,UAG,UGA = codoni STOP
6 x Leu, Ser, Arg
4 x Val, Pro, Thr, Ala, Gly
3 x Ile, Stop
2 x Phe, Tyr, His, Asn, Lys, Asp
Glu, Gln, Cys
1 x Start, Met, Trp
GUCGCCCCAUGGGGCGUGAUAUACAGCCCGCUUAACGCCAU___
Val
___
Ala
___
Pro
___
Trp --- --- ---___
Ser
___
Pro
___
His
___
Gly --- --- --- --- ---___
Arg
___
Pro
___
Met
___
Gly
3 cornici di lettura___
Arg
___
Asp
___
Ile
___
Gln
___
Pro
___
Gly
___
Stop
GUCGCCCCAUGGGUCGUGAUAGACAGCCCGCUUAACGCCAU___
Met
___
Gly
___
Arg
___
Asp
___
Arg
___
Gln
___
Pro
___
Gly
___
Stop
Mutazioni puntiformesinonime / non sinonime
___
Ala……
GUCGCCCCAUGGGGGUGAUAUACAGCCCGCUUAACGCCAU___
Met
___
Gly
___
Val
___
Ile
___
Cys
___
Ser
___
Pro
___
Leu
___
Asn
Inserzione/Delezioneslitta la cornice di lettura
stop prematuroGUCGCCCCAUGGGGCGUGAUAUAUAGCCCGCUUAACGCCAU___
Met
___
Gly
___
Arg
___
Asp
___
Stop
___
Ile
le diverse forme di RNA
L'RNA MESSAGGERO (mRNA)
• copia del DNA codificante, quindi complementare al DNA stampo, con U al posto di T.
• molecola transiente, viene prodotta, utilizzata e degradata/sequestrata rapidamente.
• la lunghezza dipende dalla lunghezza del gene trascritto.
• si associa con i ribosomi, complessi proteici che leggono la sua sequenza e producono il
polipeptide codificato ( cioè, funge da stampo per il ribosoma)
L'RNA DI TRANSFER (tRNA)
• molecole adattatrici: da un lato portano una
sequenza che riconoscere una specifica
tripletta sul mRNA, da un altro portano
l’amminoacido codificato
• hanno un’architettura comune con topologia
a trifoglio. I terminali 3' e 5' sono vicini. Il
ribosio sul terminale 3' porta l'ammino acido
legato all’idrossile 2' o 3'.
• L’ansa centrale del trifoglio porta la tripletta
che riconosce il codone (ansa del
anticodone). = metilinosina
pseudouridina
diidrouridina
dimetilguanina
metilguanina
An
sa
An
sa
braccio extra
Ansa
• contengono diverse basi inusuali, derivate da A,U,C e G, che
formano appaiamenti non-WK, con ruoli strutturali e funzionali.
• G fosforilato al 5' - CCA al 3’ (AA legato all'adenosina).
• l'ansa dell’anticodone è composta da 7 residui; con i tre residui
centrali che rappresentano l'anticodone – sono complementari alla
tripletta codone presente sul mRNA.
Ansa
RNA DELLO SPLICEOSOMA (sRNA)
presente in complessi che processano l’RNA nucleare ad RNA maturo negli eucarioti.
(nhRNA mRNA)
Ansa
Ansa
3’-ACC
5’-pG
• la struttura secondaria dell’ tRNA è a
forma di L. Una singola catena di 73 - 93
nucleotidi si ripiega su se stessa in modo
che ca. metà dei residui formino legami-H.
• Le zone a doppia elica corrispondono agli steli
nella topologia a trifoglio. Le zone a singolo
filamento corrispondono alle anse.
tRNA (cont.)
RNA RIBOSOMIALE (rRNA)
catene di RNA di diverse misure necessarie sia per la strutturazione che per
l’attività catalitica dei ribosomi. Strutture complesse con forcine ed anse.
• flusso di informazione genetica: DNA mRNA ribosomi.
- La replicazione = duplicazione del DNA (due molecole identiche)
- La trascrizione = DNA mRNA con sequenza identica (T U)
- La traduzione = sequenza nucleotidica (mRNA) sequenza amminoacidica
le sequenze dei geni e delle proteine che codificano sono COLINEARI.
• la trascrizione inizia nella vicinanza di specifiche sequenze conservate, i cosiddetti "SITI
PROMOTORI" e termina a livello di sequenze specifiche note come "SITI TERMINATORI"
• la traduzione è governata dai specifici segnali di start e stop presenti nel mRNA. I segnali
start sono preceduti da specifiche sequenze che legano l’apparato proteico necessario per la
traduzione. I segnali stop sono riconosciuti da proteine note come fattori di rilascio, che
staccano l'RNA dal ribosoma.
flusso dell’informazione genetica – il dogma centrale
TTGACA TATAAT
-35 -10 1
startPribnow boxregione -35
GGNCAATCT TATAAA
-75 -25 1
startTATA boxregione -75
Procarioti
Eucarioti
sequenzaenhancer
stop
stop
• negli eucarioti, i geni sono discontinui: sono formati da varie sequenze codificanti (esoni),
intercalate alle quali ci sono sequenze non codificanti (introni)
• l’RNA trascritto è una copia esatta dell’intero gene con introni ed esoni (RNA nucleare
eterogeneo, nhRNA). Gli introni sono rimossi (splicing) da complessi proteina/RNA noti
come spliceosomi e l’RNA ricongiunto come catena unicamente codificante (maturo,
mRNA). I spliceosimi riconoscono specifici segnali intronici e li rimuovono ricucendo l’mRNA
con solo la sequenza codificante.
• Un esone spesso corrisponde ad un dominio strutturale o funzionale nella proteina
• Proteine con nuove funzioni si sviluppano durante l'evoluzione per ricombinazione di esoni
che codificano elementi strutturali discreti. Lo splicing differenziato di mRNA genera
proteine correlate ricomponendo l'RNA nascente in diverse maniere.
flusso dell’informazione genetica (cont.)
esone 1 esone 2 esone 3
introne 1 introne 2
trascritto primario nhRNA
ribosomipolipeptide
splicing
mRNA
• il materiale genetico umano è organizzato in 23 paia di cromosomi, ciascuno formato da una
lunghissimo dsDNA (>2 m tot., spesso 20 Å) impaccato nel nucleo della cellula (5 - 10 m).
struttura del cromosoma
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
x
x
• Per ottenere questo grado di
impaccamento il DNA è avvolto
attorno a complessi proteici a
diversi livelli (cromatina).
•5 diversi tipi di proteine basiche, istoni,
formano l’ottamero del nucleosoma attorno al
quale si avvolge inizialmente il doppio
filamento di DNA, formando una superelica
sinistrogira.
• i nucleosomi si impaccano a forma di
solenoide (6 per giro) e formano un filamento
• a sua volta questo si organizza attorno al
complesso proteico della matrice (a mo di
anse).
• Una ventina di anse si dispongono in una a
minibanda,
• queste formano la sezioni del cromosoma.
struttura dei cromosomi
DNA
NUCLEOSOMA
SOLENOIDE
(6 nucleosomi / giro)
ANSE
(50 giri /ansa)
CROMOSOMA
(minibande
impaccate)
cromosoma interfasico
cromosoma duplicato metafasico / cellula in divisione
MINIBANDE
(18 anse/minibanda)
eucromatina
centromero
matrice
ottamero istonico
nucleosoma ca. 200 bp solenoide ca. 1200 bp ansa 60-150 kb,
minibanda 1-3 megabasim cromosoma tipico 106 minibande.
• il DNA può essere facilmente deformato
• i solchi minore e maggiore espongono siti di riconoscimento specifici per la formazione di
legami-H multipli fra atomi nelle basi e nelle catene laterali di proteine che agiscono sul DNA.
• 4 tipi di enzimi agiscono sul DNA:
- NUCLEASI (idrolisi del legame fosfodiestere in oligonucleotidi)
- LIGASI (formazione del legame fosfodiestere fra due oligonucleotidi)
- TOPOISOMERASI (GIRASI, ELICASI) (variazione di superavvolgimenti)
- POLIMERASI (polimerizzazione mediante la condensazione di nucleotidi)
• questi enzimi spesso si agganciano e scorrono lungo la molecola di DNA come su una
rotaia (diffusione monodimensionale) finchè non raggiungono un sito di riconoscimento,
dove si fermano ed iniziano la loro attività
enzimi che agiscono sul DNA
LE NUCLEASI:
enzimi che idrolizzano il legame fosfodiesterico in una catena di DNA (DNAsi) o di RNA (RNAsi)
endonucleasi - tagliano una catena all'interno
esonucleasi - staccano nucleotidi dalle estremità della catena
endonucleasi di restrizione batteriche
Sito di taglio di EcoRV (E. coli Restrict. Endonucl. V)
TIPO II
5’—GATATC—3’||||||
3’—CTATAG—5’
• Sistema di difesa dei batteri contro virus (FAGI), che agiscono solo su DNA di origine
esogena. I batteri proteggono il loro DNA mediante la metilazione di basi.
• Importantissimi strumenti per la ricerca (tecniche ricombinanti, clonaggio ecc.).
• Tre tipi di ER: I, II e III. 1) Tipo I aspecifici; 2) Tipo II specifici per sequenze palindromiche e
non necessitano ATP; 3) Tipo III specifici e necessitano ATP
• Gli ER sono proteine omodimeriche simmetriche che riconoscono un bersaglio simmetrico.
• Inseriscono anse nel solco maggiore e scorrono lungo il doppio filamento di DNA
fermandosi in corrispondenza al sito palindromico (riconoscono uno specifico pattern di basi).
• Sia l'enzima che il DNA subiscono mutamenti conformazionali - l'enzima lega Mg++,
necessario per la sua attività; il DNA si piega, poi avviene il taglio.
endonucleasi di restrizione (cont.)
• le endonucleasi di restrizione tagliano entrambe i filamenti della molecola di DNA
• alcune tagliano in modo netto (BLUNT end) (es. Ecor V, Sma 1)
• altre tagliano in modo sfilacciato (STICKY end) (es. Bam H1, Kpn 1)
tagli netti (blunt end)
tagli sfilacciati (sticky)
5’—G-A-T-A-T-C—3’| | | | | |
3’—C-T-A-T-A-G—5’
Ecor V -G-A-T A-T-C-| | | | | |
-C-T-A T-A-G-
endonucleasi di restrizione (cont.)
• l'utilizzo di ER con diverse specificità permette di mappare il DNA, cioè di generare una
serie caratteristica di frammenti, che risulta in un pattern elettroforetico tipico. Nel DNA
proveniente da diversi individui, la presenza o assenza di siti di taglio, da luogo a mappe
uniche e distinguibili
• Le ER sono anche utilizzate per inserire frammenti di DNA in plasmidi e quindi per clonare
quei particolari frammenti
Gen
e
Gen
e
Plasmide
vettore
trasfettare
• Enzimi che congiungono catene di DNA - catalizzano la formazione di un legame
fosofodiestere fra un ossidrile al 3' di un frammento con il fosfato sul 5' di un altro.
• Agiscono su dsDNA, chiudendo rotture su una delle due catene. ATP è usato come attivatore
dagli eucarioti, NAD+ dai batteri. Si forma un intermedio nel quale una unità di AMP si lega al
fosfato 5' di un frammento e lo attiva per la formazione del legame con OH sul 3’ dell’altro
frammento.
Le DNA ligasi
DNA1–3'OH + O-P-O–5'–DNA2
O
O
-
-
ligasi
ATP(NAD+)
PPi(AMP)
DNA1–3'–O-P-O–5'–DNA2
O
O-
ligasi + ATP ligasi
PPi
AM- P
NHNH2
fosfoammide
+ O-P-O–5'–DNA2
O
O
-
-
-P-O–5'–DNA2
O
O-AM- P
DNA1–3'OH
DNA1–3'–O-P-O–5'–DNA2
O
O-
• quelle di tipo I rilassano il DNA superavvolto. tagliando solo un filamento, e permettendo lo
srotolamento dell’altro (processo energicamente favorevole che non richiede l’idrolisi di ATP).
In seguito, ricongiungono il filamento tagliato. Riducono così lo strain, localmente, per tratti di
doppia elica sovra- o sottoavvolti
le DNA topoisomerasi
• quelle di tipo II (girasi) tagliano entrambe i
filamenti e permettono il passaggio di un altro
tratto della doppia elica attraverso il taglio.
Aggiungono superavvolgimenti negativi, un
processo richiede l’idrolisi di ATP.
• Per entrambe i tipi, durante il taglio si forma un legame fosfoesterico con una tirosina
enzimatica, ed è liberato l’OH 5’, che poi attacca la fosfotirosina dopo lo srotolamento.
• Le topoisomerasi e girasi sono necessarie durante la replicazione o trascrizione del
DNA, per evitare crisi topologiche a monte e/o a vale del DNA localmente disavvolto.
• la girasi batterica è bersaglio di antibiotici (novobiocina, acido nalidixico, ciprofloxacina) e la
topoisomerasi di tipo I umana e bersaglio per l’agente antitumorale camptotecina
le DNA polimerasi
le polimerasi sono enzimi coinvolti nella sintesi del DNA durante la sua replicazione.
DNA POLIMERASI I di E. coli:
sintetizza singoli filamenti di DNA utilizzando monodesossinucleotidi trifosfati (dNTP = dATP,
dGTP, dCTP o dTTP (nucleotidi attivati))
DNA –3'–OH + polimerasi
dNTP
Mg++
5' 3' polimerasi (la catena si allunga in direzione del 3')
DNA –3'–O – P – 5' – dN – 3'-OH
• è un enzima processivo, aggiunge in media 20 dN prima di staccarsi (un enzima distributivo si lega
e stacca ad ogni ciclo).
• mostra anche due distinte attività di idrolasi, una che funziona su basi male appaiate (non W-C) come
meccanismo di auto-correzione. L’idrolisi avviene in senso opposto alla polimerizzazione (3' 5’
esonucleasi). L’altra serve per completare l’opera di replicazione ed agisce in direzione ( 5' 3’ ).
la DNA polimerasi I
• la DNA polimerasi I richiede un FILAMENTO
STAMPO, a catena singola di DNA, sul quale
agire, e sintetizza una catena esattamente
complementare allo stampo (appaiamento
Watson-Crick corretti fra la base entrante e quella
dello stampo
• richiede anche una catena PRIMER (che può
essere DNA o RNA) con un terminale 3'-OH libero
sulla quale innestare il primo dNTP (NB: le DNA
polimerasi richiedono un primer, le RNA polimerasi no ).
• Si lega alla catena stampo al sito di origine della
sintesi.
• La polimerasi:
- raramente inserisce basi male appaiate (dominio 5’3’ polimerasi molto fedele)
- controlla l'appaiamento dopo ogni accopiamento
- elimina residui con basi appaiate incorrettamente (dominio 3’5’ esonucleasi)
- contiene una ulteriore attività di idrolasi, con funzione 5'3‘ esonucleasi, che
serve per rimuovere la sequenza primer alla fine della sintesi.
dNTP
• questo enzima riunisce le tre attività catalitiche in una struttura relativamente piccola e a
singola catena polipeptidica. La tripsina taglia questa proteina in due subunità autonomamente
attive, con la 5'3'-esonucleasi nel dominio N-terminale. Il frammento C-terminale contiene
l'attività 3'5'-esonucleasi e polimerasi (frammento di Klenow).
La DNA polimerasi I - meccanismo di editing
• Il sito attivo del dominio esonucleasi 3'
5' è molto vicino a quello della
polimerasi, e permette lo scanning per la
correzione del DNA nascente, senza che
la catena di DNA si debba staccare
dall'enzima, permettendo una elevata
processività
P P
ruolo della DNA polimerasi III oloenzima (E. coli ) nella replicazione
• La replicazione (duplicazione) inizia con la formazione di un complesso proteico, il
primosoma, ai siti di origine della duplicazione, dove il dsDNA si apre nella forcella di
replicazione. Questo complesso è composto, fra altre proteine, anche da girasi ed elicasi che
servono per risolvere “crisi topologiche” a monte della forcella.
Primosoma topoisomerasi
DNA parentaleinizio framento
di Okazaki
DNA polimerasi sul
filamento leader
proteine
SSB
DNA elicasi
primasi
catena leader
catena ritardata
primer
di
RNA
nuovo frammento
Okazaki
unità di
caricamento
(macchinario di
looping)
forcella di
replicazione
direzione
srotolamentofilamento nuovo
• La sintesi è svolta da un unico oloenzima (la polimerasi III), che utilizza primer di RNA
aggiunti da una specifica RNA polimerasi (la primasi, che non richiede un primer). Questa si
lega al apparato proteico d’inizio (primosoma).
• entrambe i filamenti fungono da stampo, e la replicazione procede nella direzione di
srotolamento. Procede in maniera ininterrotta per la catena stampo (3'5’ = catena guida).
Un complesso processo di looping del DNA orienta l’altro filamento per brevi tratti con
direzione 3'5’ parallela. I frammenti sintetizzati formano la catena ritardata.
• Il replisoma è un complesso multimerico composto da molte subunità di diverso tipo -
girasi/elicasi, primasi, primosoma, SSBP, le due di subunità di polimerasi III (due copie di
subunità a pinza all’interno delle quali scorrono i filamenti di DNA, e siti catalitici per la
condensazione e l’editing - esonucleasi 3’5’) ed il macchinario di looping per il filamento
lento. Ha una sovrastruttura dimerica asimmetrica.
DNA polimerasi III oloenzima (E. coli ) (cont.)
catena lenta
primer di RNAelicasi
5’
3’
3’
5’
5’
3’
primasi
la nuova pinza si
aggancia a livello del
nuovo primer
nuovo primer
di RNA
pinza nuova
pinza nuova
pinza scartatapinza successiva
DNA polimerasi III oloenzima (E. coli ) processo di looping
3) l’elicasi disavvolge la doppia elica
4) la primasi aggiunge un nuovo primer a RNAsulla catena lenta
5) la pinza vuota aggancia il filamento lento a livello del nuovo primer
catena veloce
complesso per il
posizionamento della pinza
1) La DPIII copia la catena velocemuovendosi in direzione 3’ 5’
2) Copia solo la parte della catena lentanel loop con direzione 3’5’
6) Il segmento lento già copiato si stacca dalla DPIII
7) Ila pinza con il segmento col nuovo primer siaggancia alla DPIII
torna a 2)
• DNA polimerasi III - il filamento veloce richiede un solo primer di RNA all’inizio della
replicazione, mentre quello lento richiede l’aggiunta ripetitiva di primer ogni ca. 1000 residui di
DNA aggiunti (ogni volta che si forma un loop).
le DNA polimerasi I e III collaborano nella replicazione
• la DNA polimerasi I poi
rimuove i primer RNA
presenti sui frammenti di
Okazaki (esonucleasi 5‘3‘)
e riempie lo spazio rimasto
fra due frammenti sucessivi
(polimerasi 5‘3‘). Una ligasi
congiunge i frammenti per
formare un filamento
ininterrotto.
• il complesso della DNA
polimerasi III è ALTAMENTE
PROCESSIVO e MOLTO
EFFICIENTE. Aggiunge ca.
1000 dN/sec. con alta fedeltà,
e non molla il DNA stampo
fino a replicazione completa.
L’aciclovir inibisce selettivamente le DNA polimerasi virali
aciclovir
chinasi virale
chinasi cellulari
aciclo-GMP
polimerasi virale
polimerasi cellulari
aciclo-GTP
chinasi cellulari
terminazione
• eventualmente riconosce segnali di terminazione e si stacca, terminando la trascrizione
• la sua attività è modulata da fattori di trascrizione (proteine regolatrici)
• negli eucarioti sono presenti diverse polimerasi; tipo I per rRNA, tipo II per mRNA ed sRNA e
tipo III per rRNA e tRNA (II e III sono inibite dall’a-amantidina)
• l’RNA polimerasi batteriche sono il bersaglio per la rifampicina e l’actinomicina
• l’enzima cerca i siti di inizio sul DNA
(siti promotori). L'iniziazione della
trascrizione richiede la formazione di
complessi multiproteici a livello di
queste specifiche sequenze, a monte
della sequenza codificante.
• srotola un breve tratto di doppia elica
(ca 17 residui) liberando la catena
stampo
• procede con la polimerizzazione,
utilizzando gli NTP corretti (azione
completamente processiva)
• Si forma una doppia elica ibrida
DNA/RNA per ca 8 residui
RNA polimerasi e la trascrizione
DNA
riavvolgimento
disavvolgimento
bolla di trascrizionetopoisomerasi
P P P
ibrido DNA/RNAsito attivo
Direzione di trascrizione
filamento
codificante
filamento
stampo
mRNA nascente
RNA polimerasi – meccansimo d’azione
AspAsp
Asp
• l’oloenzima RNA polimerasi di E. coli è una proteina complessa e multimerica, composta da
subunità che legano il DNA, subunità che legano gli NTP, subunità che riconoscono
specifiche sequenze promoter nel DNA da trascrivere, e subunità che mediano
l'assemblaggio e la regolazione del complesso.
• scorre liberamente lungo la molecola di DNA finché non trova la sequenza del promotore,
dove forma un complesso con la doppia elica (complesso del promotore chiuso). Qui un
breve tratto (~12 basi) si srotola (complesso del promotore aperto) e la sintesi inizia senza
necessità di primer, utilizzando un ATP o GTP (5' trifosfato).
• dopo ~6-10 nucleotidi aggiunti, il complesso perde la subunità che lo lega alla sequenza del
promotore e la polimerasi continua la trascrizione lungo la catena. La cosiddetta "bolla di
trascrizione" procede con l’aiuto di topoisomerasi che evitano crisi topologiche. ~12 residui di
RNA nascente sono legati al DNA nella bolla.
• la polimerasi si muove lungo la catena stampo (o catena antisenso), in direzione 3' 5‘, e
l'RNA messaggero è sintetizzato in direzione 5‘3', nella stessa direzione della catena
codificante (o catena senso), della quale è una copia esatta (U al posto di T).
• la RNA polimerasi non ha meccanismi di autocorrezione, la fedeltà di trascrizione è inferiore
a quella nella replicazione
• nei batteri, la terminazione di trascrizione può essere indotta da sequenze di DNA che
quando trascritte nell'mRNA causano la formazione di una forcina (inverted repeats). Sono
attive anche proteine che aiutano la terminazione.
RNA polimerasi di E. coli e la trascrizione del DNA
le polimerasi come strumento di ricerca
POLIMERASI STAMPO PRODOTTO PRIMER NUCLEOTIDE
DNA polimerasi DNA DNA DNA o RNA dNTP
RNA polimerasi DNA RNA - NTP
trascrittasi inversa RNA DNA RNA/tRNA dNTP
• l’mRNA presente in una cellula in un dato momento rappresenta tutti i geni che sono in fase
di trascrizione in quel momento (trascrittoma).
• l’mRNA, non essendo una molecola molto stabile, non e però adatta per lo studio del
trascrittoma.
• può essere riconvertita a DNA, in laboratorio, utilizzando la trascrittasi inversa (DNA copia o
cDNA).
• librerie di cDNA sono molto utili per studiare le attività cellulari, specialmente con le nuove
tecnologie DNA Chip.
Librerie di cDNA
La biosintesi di proteine è svolta dai ribosomi. Questi hanno un’architettura caratteristica.
Sono organizzati in due subunità principali: la cosiddetta subunità piccola (30S in E. coli / 40S
Eucarioti) è formata da 21/33 catene proteiche e da 1 catena di rRNA. Quella grande
(50S/60S) da 31/49 catene proteiche e da 2/3 catene di rRNA.
IF-1,2,3 (fattori d’iniziazione)
tRNA
start
30S
i ribosomi e la biosintesi di proteine - la traduzione
GTP
assemblaggio
GDPPi
50S
AUG GAA GCU GGU
M
UAC
sito P sito A
(70S)
sito E
streptomicina
neomicina,
kantamicina,
gentamicina
sito E sito P sito A
mRNA
tRNA
scarico
tRNA
con peptide
crescente
tRNA
con amminoacido
entrante
i ribosomi e la biosintesi di proteine - meccanismo di traduzione
fattore di
allungamento peptidiltrasferasi
cloranfenicolo
traslocazione
eritromicina
Met Glu Arg
nuovo ciclo di
allungamento
puromicina
Signal sequence
1) Il «singnal recognition particle» (SRP) si lega al peptide segnale e arresta la traduzione
2) SRP guida il ribosoma al traslocatore Sec, guidato dal recettore per SRP
3) Il signal peptide si inserisce nel traslocatore e SRP si stacca
4) Il ribosoma riprende la traduzione
5) Proteine idrosolubili traslocano nel lumen del ER dove vanno incontro a PTM
6) Poi sono inserite in vescicole che si staccano dall’ER e sono inviate alla membrana citoplasmatica via apparato di Golgi
7) Le proteine di membrana sono inserite direttamente nella membrana a livello delle sequenze TM
Proteine solubili non citoplasmatiche
1) Il signal peptide guida la catena
nascente in Sec
2) Il signal peptide rimane legato a Sec
mentre il resto della catena trasloca
3) l’enzima signal peptidase associato
a Sec rimuove il peptide segnale
4) La catena si ripiega e va incontro
a PTM
Proteine di membrana
1) Il signal peptide guida la catena
nascente in Sec
2) Il signal peptide rimane legato a Sec
mentre il resto della catena trasloca
4) l’enzima signal peptidase associato
a Sec rimuove il peptide segnale
5) Il segmento TM passa attraverso un varco
laterale in Sec ed entra nella membrana
6) Questo si ripete per ogni altro segmento TM
3) Il primo segmento TM entra in SEC
