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IL DNA fingerprinting umano oggi Prof.ssa Claudia Donnini, Università di Parma Bologna, 7 settembre 2005
IL DNA fingerprinting umano oggiProf.ssa Claudia Donnini, Università di Parma
Bologna, 7 settembre 2005
1) Che cosa significano sigle e numeri?
2) Come si è arrivati all’uso di questa tipologia di profilo e perché?
Campione XY Campione YZ
Sesso Femminile Sesso Maschile
TH01 8-9 TH01 6-7
D21S11 30.2-31 D21S11 28-32.2
D18S51 13-19 D18S51 16-19
vWA 16-18 vWA 18-18
FGA 21-21 FGA 21-23
D8S1179 8-10 D8S1179 11-12
TPOX 8-8 TPOX 11-11
CSF1PO 11-12 CSF1PO 10-10
D16S539 10-12 D16S539 8-13
D7S820 7-12 D7S820 11-11
D13S317 9-12 D13S317 10-12
D5S818 12-13 D5S818 11-13
D3S1358 14-16 D3S1358 16-18
D19S433 13-14 D19S433 14-16
D2S1338 16-23 D2S1338 18-20
Il DNA nucleare della specie Homo sapiens
è costituito da:
23 cromosomi nelle cellule della linea germinale,
contenuto in DNA: circa 3x109 paia di basi (bp)
23 coppie di cromosomi nelle cellule somatiche,
contenuto in DNA: circa 2x3x109 paia di basi (bp)
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25.000 caratteri
1985. Il Dr Alec Jeffreys i suoi collaboratori, dell’Università di Leicester, in Inghilterra,
- mettono in evidenza l’esistenza di profili individuali (il fingerprinting del DNA) e
- dimostrano, con le loro analisi, l’esistenza di una relazione familiare cioè di una compatibilità ereditaria risolvendo una disputa in un caso di immigrazione
(Jeffeys et al., 1985, Nature 314: 67-73; Jeffeys et al, 1985 Nature 316: 76-9 ; Jeffrey et al., 1985, Nature 317: 818-9)
Jeffreys e coll. scoprono che
esistono nel DNA umano delle regioni
(minisatelliti/VNTR= Variable Number Tandem Repeat)
in cui brevi sequenze di DNA (da 10 - 15 bp)
vengono ripetute in tandem numerose volte e
in più loci sui cromosomi e
che il numero di ripetizioni è altamente variabile nei diversi
individui
da Brooker, Genetica, ed. Zanichelli
Questo metodo di fingerprinting viene definito: Multilocus RFLP-VNTR
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) indica che, a causa del numero variabile di
ripetizioni, vengono creati dal taglio con un enzima di restrizione, frammenti di DNA di diverse dimensioni.
da Snustad-Simmons, Principi di Genetica, Edises II ed.
Single-locus RFLP-VNTR
(Restriction Fragment Length Polymorphism-Variable Number Tandem Repeat Polymorphism)
VNTR: numero variabile di ripetizioni seriali (tandem repeats) (da 9 a 40bp che possono essere ripetute anche centinaia o migliaia di volte, dimensione da 500 a 23000 bp)
Single-locus: ripetizione localizzata in un solo locus cromosomale.
Di conseguenza se applico lo stesso protocollo sperimentale di Jeffreys et al.
e uso come sonda una Single-locusVNTR
verranno individuati
due frammenti se l’individuo è eterozigote (ha ricevuto dai genitori DNA con numero diverso di
ripetizioni).
un unico frammento se l’individuo è omozigote (ha ricevuto da entrambi i genitori DNA con lo stesso
numero di ripetizioni)
1986. Negli Stati Uniti viene ammessa per la prima volta in tribunale un’analisi con RFLP, in un caso di stupro (Stato della Florida contro Tommy Lee Andrews).
1987. L’analisi del DNA a fini forensi subisce una battuta di arresto. A New York, nel processo contro Joseph Castro, la corte sceglie di rendere inammissibile l’analisi del DNA ai fini della inclusione.
Il problema può essere così riassunto
“la cosa da cui la deduzione è fatta deve essere sufficientemente stabilita per avere una generale accettabilità nel particolare campo
a cui si riferisce”
In particolare nel processo in questione per decidere l’ammissibilità la corte chiede che la prova del DNA deve rispondere a tre criteri:
1) E’ fondata la teoria che riguarda l’analisi del DNA?
2) Le tecniche utilizzate nell’analisi sono in grado di
produrre risultati affidabili?
3) In questo caso i test sono stati eseguiti in modo corretto?
Tale decisione è il fattore che più ha contribuito a aumentare l’attenzione sulla emissione di normative per la
certificazione di qualità e la standardizzazione dell’analisi.
Vantaggi:
Riproducibilità - Elevato potere discriminatorio
Svantaggi:
- Richiedere quantità discrete di DNA (50-500ng) e quindi il non potere essere utilizzato a partire da tracce biologiche e
- di richiedere tempi abbastanza lunghi.
Si sono quindi cercate, per l’analisi del fingerprinting,
nuove regioni ripetute nel DNA
ma sufficientemente brevi per potere essere amplificate per PCR anche in caso di
degradazione parziale del DNA:
- microsatelliti / STR (Short Tandem Repeat polymorphism)
L’amplificazione di una STR darà origine a
due bande se l’individuo è eterozigote
un'unica banda se l’individuo è omozigote
Numerose STR sono state validate e se ne é stabilito nelle diverse popolazioni umane la frequenza delle
singole ripetizioni
(Hammond et al, 1994 Am J Hum Genet 55:175-189; Garofano et al, 1998 J Forensic Sci 43: 837-840; Garofano et al., 1998 Forensic Science Int. 97: 53-60)
ENFSI CODIS
(7 loci) (13 loci)
TH01 TH01
D21S11 D21S11
D18S51 D18S51
vWA vWA
FGA FGA
D8S1179 D8S1179
TPOX
CSF1PO
D16S539
D7S820
D13S317
D5S818
D3S1358 D3S1358
ENFSI (European Network of Forensic Science Institutes)CODIS (Combinated DNA Index System) della FBI.
Per rendere il più efficace possibile l’analisi da traccia
l’amplificazione delle STR
e di una regione del gene dell’amelogenina, che serve per l’identificazione del sesso,
viene fatta contemporaneamente.
L’allineamento tra
il gene dell’amelogenina umana presente sul cromosoma X
il gene dell’amelogenina umana presente sul cromosoma Y
ha messo in evidenza alcune differenze
In particolare c’e una regione lunga
106 pb sull’X
112 pb sull’Y
L’amplificazione di questa regione permette di distinguere tra ♀♂
♀: se c’è una unica banda da 106 pb
♂ : se ci sono due bande, una da 106 pb e una da 112 pb
Per potere distinguere i prodotti di amplificazione delle singole STR
i primers (oligonucleotidi) per l’amplificazione sono legati a diverse molecole fluorescenti
(generalmente da 3 a 5).
Per ovvie ragioni ad una identica molecola fluorescente vengono legati primers che amplificano regioni di
diversa dimensione e quindi non confondibili.
La ragione dell’uso di primers fluorescenti è legata al fatto che l’analisi degli amplificati viene fatta con un sistema di elettroforesi capillare che consente di distinguere gli amplificati sulla base del colore .
Ar +LASER(488 nm)
Sample injection
Sample separation
Capillary
Mixture of dye-labeled
PCR product fromMultiplex PCR
reaction
Sample Detection
CCD Panel
Color Separation
ABI Prismspectrograph
Fluorescence
Il capillare, che contiene una
soluzione polimerizzante, è
dotato di una finestrella attraverso
la quale il laser eccita ad una precisa lunghezza d’onda il campione di DNA marcato con un
determinato fluoroforo che ne
permette l’identificazione.
Le bande, la cui dimensione dipende dal numero di ripetizioni, vengono trasformate in picchi.
Si possono anche utilizzare programmi che trasformano i picchi in numeri
Campione XY Campione YZ
Sesso Femminile Sesso Maschile
TH01 8-9 TH01 6-7
D21S11 30.2-31 D21S11 28-32.2
D18S51 13-19 D18S51 16-19
vWA 16-18 vWA 18-18
FGA 21-21 FGA 21-23
D8S1179 8-10 D8S1179 11-12
TPOX 8-8 TPOX 11-11
CSF1PO 11-12 CSF1PO 10-10
D16S539 10-12 D16S539 8-13
D7S820 7-12 D7S820 11-11
D13S317 9-12 D13S317 10-12
D5S818 12-13 D5S818 11-13
D3S1358 14-16 D3S1358 16-18
D19S433 13-14 D19S433 14-16
D2S1338 16-23 D2S1338 18-20
Se confronto profili individuali:
NON identità genetica: ESCLUSIONE
IDENTITA’ genetica: COMPATIBILITA’
Il più importante limite dell’analisi del DNA in criminalistica è rappresentato dai gemelli monozigotici
In quest’ultimo caso,
viene effettuata un’analisi statistica dei risultati ed infine viene fornita una percentuale di attribuzione che sarà tanto più prossima al 100% quanto maggiore
sarà il numero di regioni del DNA analizzate.
Generalmente l’analisi da 9 a 15 STR consente di raggiungere una percentuale di attribuzione superiore al
99,9999%.
Testi consigliati
John M. Butler
"Forensic DNA typing: biology and technology behind STR markers".
1a ed
ACADEMIC PRESS 2001
N. Rudin and K. Inman,
“An introduction to Forensic DNA analysis”
Second edition
CRC Press 2002
Indirizzi web utili
ENSFI http://www.enfsi.org/ewg/dnawg/tor/
CODIS http://www.fbi.gov/hq/lab/codis/index1.htm
DNA e crimine
http://www.ncsl.org/programs/health/genetics/dna.htm
http://www.denverda.org/html_website/denver_da/DNA_Resources_index.html
http://www.denverda.org/html_website/denver_da/DNA_resources.html
http://www.ncsl.org/programs/health/genetics/DNAadmiss.htm
http://www.alalinc.net/library/rguides/dna_research.pdf
http://www.nap.edu/readingroom/books/DNA/
