Il Laboratorio di tossicologia clinica - sjdiem.it · Enzimi plasmatici 12 • Il dosaggio degli...

Il Laboratorio di tossicologia clinica

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Alcune tecniche di Laboratorio

Spettrofotometria

Immunometria

Sostanze ad uso voluttuario

Analisi finalità

Matrici biologiche: sangue, urine, altre

Alcol

tecnica analitica

basata sull‟ interazione tra la materia e le

radiazioni elettromagnetiche.

Tecniche di Laboratorio

SPETTROFOTOMETRIA:

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Esistono vari tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per la loro

lunghezza d'onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia)

Tipi di radiazione elettromagnetica

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Atomi o molecole possono assorbire quantità definite e

caratteristiche di energia:

• quando vengono eccitati da adatte radiazioni elettromagnetiche

passando a stati energetici maggiori, si ha il fenomeno di

ASSORBIMENTO.

• quando dagli stati eccitati, ritornano allo stato fondamentale, gli

atomi e le molecole emettono quanti di energia sotto forma di

radiazioni elettromagnetiche, si ha il fenomeno di EMISSIONE

(fluorescenza).

Analisi spettrofotometrica: principio

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I componenti essenziali sono:

Lo spettrofotometro

• Cella o cuvetta

• Fessura d‟ingresso-lente (per minimizzare la luce diffusa e rendere paralleli

i raggi della sorgente)

• Sorgente di luce policromatica (tungsteno per il visibile, deuterio per l‟UV)

• Filtro o monocromatore (per selezionare una banda di l definita)

• Fessura d‟uscita

• Fotomoltiplicatore (che trasforma il segnale luminoso in impulso elettrico)

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Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una

radiazione attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente

a seconda della concentrazione.

Definendo A (Assorbanza) = log I0/I

I0 = intensità della radiazione incidente

I = intensità della radiazione trasmessa.

Legge di Lambert-Beer

A = eCi

Legge di Lambert-Beer

e = coefficiente di estinzione molare (ovvero l‟assorbimento che subisce un raggio di luce monocromatica

nell‟attraversare una soluzione a concentrazione unitaria e cammino ottico di 1 cm)

C = concentrazione della soluzione.i = cammino ottico (ovvero spessore dello strato attraversato dalla radiazione incidente)

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• analisi quantitativa indiretta tramite reazione colorimetrica; molte sostanze

possono reagire con altre a dare un prodotto colorato.

• analisi quantitativa diretta per sostanze che assorbono ad una data

lunghezza d‟onda, tipo le proteine il cui assorbimento a 280 nm si basa

principalmente sul contenuto di aa aromatici

• attività e cinetica enzimatica: si misura la velocità di comparsa o scomparsa di

una sostanza con un picco caratteristico di assorbimento, che partecipa come

substrato o come prodotto alla reazione enzimatica in esame

• analisi qualitativa: spettro d‟assorbimento.

APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA

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SCOPO:

1. dosare la quantità di un substrato che prende

parte ad una reazione catalizzata da un

enzima,

2. dosare l‟attività di un enzima, cioè la velocità di

una reazione catalizzata da un enzima.

Dosaggio enzimatico

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Enzimi plasmatici

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• Il dosaggio degli enzimi nel plasma può essere

utilizzato per diagnosticare il danno di un tessuto od

organo particolarmente ricco in alcuni enzimi.

L‟entità del rilascio enzimatico fornirà un indice del

grado del danno cellulare.

• Carenze/difetti enzimatici sono responsabili di

sindromi biochimiche

Si misura la variazione nel tempo di

una qualsiasi grandezza correlata alla

concentrazione del substrato o del

prodotto.

Come si misura l’attività di un enzima ?

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Dosaggio dell’ attività enzimatica (metodo diretto)

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Un esempio è il dosaggio della LDH (latticodeidrogenasi) che catalizza la reazione:

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Spettrofotometria

Immunometria


Analisi finalità


Alcol

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Molte tecniche di Laboratorio si avvalgono dellegame specifico antigene-anticorpo.

Dal momento che è possibile produrre anticorpi neiconfronti di qualunque tipo di macromolecola osostanza chimica di piccole dimensioni, le tecnichebasate sul loro impiego sono utili per rilevare epurificare i composti.

.

Legame antigene-anticorpo

Produzione di anticorpi

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Le Immunoglobuline o Anticorpi (Ab)sono proteine nelle quali sonoindividuabili due regioni diverse perstruttura e funzione:

-regione Fab: regione variabile.Contiene la zona specifica per l'antigene;

-regione Fc: regione a strutturacostante presente all'interno della classee sottoclasse di Ab.

Gli anticorpi che vengono utilizzatinelle analisi di Laboratorio appartengonoalla classe delle Immunoglobuline G.

Le forze che intervengono nel legameAb-Ag sono: forze elettrostatiche, forzeidrofobiche, legami idrogeno e forze diVan der Waals

IMMUNOGLOBULINE

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Ab-Ag (Anticorpo e Antigene)

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Schema di una metodica immunochimica (immunoenzimatica – EIA)

„ATTORI‟

substrato

Quando l‟Ag marcato con enzima non è legato all‟anticorpo,

avviene la reazione tra enzima e substrato , con sviluppo di colore.

Ag-enzima-substrato

anticorpo in grado di legarsi alla sostanza (Ag)

Il reattivo è costituito da :

• la stessa sostanza coniugata ad un enzima

• anticorpi specifici in grado di legarsi alla

sostanza (Ag) presente nel campione.

L‟ Ag coniugato con l‟enzima compete con la

sostanza eventualmente presente nel campione per

una quantità fissa di siti leganti dell‟anticorpo.

Viene quindi aggiunto il substrato specifico

dell‟enzima.

Se il campione contiene la sostanza (Ag), l‟Ag

coniugato non viene legato dall‟anticorpo e la

reazione enzimatica può avvenire.

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Il campione da analizzare contiene la sostanza (Ag)

da dosare.

Questa reazione stabilisce una diretta relazione tra la presenza dell’analita e l’attività enzimatica.

Schema di una metodica immunochimica (immunoenzimatica – EIA)

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Spettrofotometria

Immunometria


Analisi finalità


Alcol

Ogni società accetta alcune sostanze come

lecite e ne condanna altre perché illecite.

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Nel Medio Oriente la Cannabis può essere

compresa fra le sostanze lecite, mentre

l‟alcool viene proibito.

In USA e nella gran parte dell’Europa Occidentale sostanze ad uso voluttuario

‘lecite’ sono:

Caffeina

Nicotina

Alcool

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Illeciti

Oppioidi

Cannabinoidi

Allucinogeni

Psicostimolanti

Sedativo-ipnotici

Agenti inalanti

Ormoni steroidi

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Oppioidi

Morfina, eroina, codeina, oxicodone, petidina, metadone, buprenorfina sono derivati dalla resina del papavero dell’oppio.

L’incisione della capsula del Papaver somniferumevidenzia un lattice bianco che si addensa lungo le incisioni e diventa scuro e gommoso, l’oppio, cioè la droga bruta. Nell’oppio sono contenuti diversi alcaloidi, il principale dei quali è la morfina.

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Papaversomniferum

Abitudine e dipendenza

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Alcaloidi attivi dell’oppioFumare oppio è stata una pratica largamente diffusa in Cina e nel

vicino Oriente.

La somministrazione endovenosa è quella più comune, perché è la

via più efficace e perche molto rapidamente si raggiunge nel cervello

un’alta concentrazione di droga che produce il “rush” (sensazione

simile all’orgasmo).

Abitudine (tolerance nella terminologia anglosassone). Progressiva

riduzione dell’efficacia (farmacologica) a seguito di ripetute

somministrazioni: per ottenere la risposta originaria è necessario

aumentare la dose.

Dipendenza fisica, comparsa di una caratteristica sindrome di privazione

o sindrome di astinenza quando viene sospesa l’assunzione del farmaco

Eroina

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. L‟Eroina e la Codeina vengono velocemente metabolizzati in Morfina.

Perciò, la Morfina (o i suoi metaboliti ) può essere trovata nelle urine di un

soggetto che ha fatto uso solo di Eroina e/o Codeina..

Cut-off (test di screening) = 300 ng/ml.

L'eroina, il cui nome scientifico è diacetilmorfina è una sostanza semisintetica,

vale a dire ottenuta in parte in laboratorio a partire dalla morfina estratta

dall'oppio mediante trattamento con anidride acetica.

Metadone

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È una droga analgesica sintetica usata nel trattamento delle

tossicodipendenze.

Tra gli effetti psicologici indotti dall‟uso del Metadone vi è analgesia,

sedazione e depressione respiratoria.

Il sovradosaggio di Metadone può portare al coma e anche alla morte.

Viene somministrato oralmente o mediante iniezione intravenosa e

viene metabolizzato dal fegato.

I reni hanno il ruolo principale nell‟escrezione del Metadone.

Viene metabolizzato in 15 - 60 ore.

Buprenorfina

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La buprenorfina è un agonista oppioide provvisto di alta affinità di

legame, ma bassa attività intrinseca per il recettore μ dei neuroni che

trasmettono il dolore.

La rende perciò un‟interessante alternativa al metadone per il trattamento

del‟astinenza da oppioidi. Il metadone è anch‟esso un oppioide ma è dotato

di proprietà utili nel trattamento dell‟abuso di oppiodi (disintossicazione e

terapia di mantenimento dell‟eroinomane recidivo):

• tolleranza e dipendenza fisica si sviluppano più lentamente che con gli

altri oppioidi,

• la sintomatologia della sindrome da astinenza è più lieve anche se più

prolungata

Cannabinoidi

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Cannabis sativa

• Marijuana

• Hashish

Principio attivo:

Δ9 Tetraidrocannabinolo (Δ9 -THC)

Cannabinoidi: Marijuana e hascisc

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La Marijuana è un agente allucinogeno derivato dal fiore della pianta dell‟hascisc.

La modalità principale per l‟assunzione della Marijuana/Cannabis è il fumo.

Ad alte dosi provoca effetti sul sistema nervoso centrale, alterazione dell‟umore

e delle percezioni sensoriali, perdita di coordinazione, riduzione della

memoria a breve termine, ansietà, paranoia, depressione, stato confusionale,

allucinazioni ed aumento della frequenza del battito cardiaco.

Si può avere una tolleranza agli effetti cardiaci e psicotropi.

La mancata assunzione provoca irrequietezza, insonnia, anoressia e nausea.

Quando la Marijuana viene ingerita, essa viene metabolizzata dal fegato.

Il principale metabolita della Marijuana nelle urine è il

9 Tetraidrocannabinolo (9 THC)

Questo significa che la presenza di Cannabinoidi, compreso il principale

metabolita carbossilico, nelle urine indica l‟uso di Marijuana/Cannabis.

Cut-off (test di screening) del Δ9 -THC = di 50 ng/ml

Allucinogeni

• LSD (dietilamide dell’ac. Lisergico)

• Fenilciclidina

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Psico-stimolanti

• Cocaina

• Amfetamina (Ectasy)

• Caffeina

• Nicotina

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Psico-stimolanti: Cocaina

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Derivata dalle foglie di pianta di coca, è un potente stimolante del sistema

nervoso centrale e un anestetico locale.

Tra gli effetti psicologici indotti dall‟uso della cocaina vi sono euforia,

sicurezza di sé ed un senso di aumentata energia, accompagnato da

aumento del battito cardiaco, dilatazione delle pupille, febbre,

tremore e sudorazione.

La Cocaina viene escreta primariamente nelle urine principalmente come

Benzoilecgonina in un breve periodo di tempo.

Cut-off (test di screening) = 300 ng/ml

Psico-stimolanti: Amfetamina (Ectasy)

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Metamfetamine

Le Metamfetamine, le Amfetamine e i loro metaboliti sono potenti

agenti simpatomimetici.

Alti dosaggi stimolano il sistema nervoso centrale e danno luogo a euforia,

stato di allerta, e un senso di aumentata energia e potenza.

Risposte più acute danno luogo ad ansietà, paranoia,

comportamento psicotico e aritmia cardiaca.

Il tipo di psicosi che si può manifestare ad alti dosaggi può non essere

distinguibile da fenomeni di schizofrenia.

Il 40% delle Matamfetamine viene escreto nella forma originale.

Perciò la presenza di composti derivati nelle urine indica l‟uso di Metamfetamine.

Cut-off (test di screening) = 500 ng/ml.

Sedativo-ipnotici

• Barbiturici (secobarbital, pentobarbital)

• Acido γ-idrossibutirrico (GHB )

• Altri (benzodiazepine, etc...)

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In rapporto alle dose utilizzate, possono indurre:

• sedazione

• stato ipnotico, ipno-narcotico

• anestesia

• coma e morte

Agenti inalanti

• Gas anestetici

• Solventi industriali

• Sostanze ad azione propellente per aerosol

• Nitriti organici

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Steroidi

• Ormoni anabolizzanti:

• Testosterone e i suoi esteri

• Metil-testosterone

• Nandrolone

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Consumo

TIPI DI DROGHE NUMERO CONSUMATORI

Eroina 8 milioni

Cocaina 13 milioni 300 mila

Cannabis 141 milioni 200 mila

Allucinogeni 25 milioni 500 mila

Anfetamine 30 milioni 200 mila

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41

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Spettrofotometria

Immunometria


Analisi finalità


Alcol

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- LOCALI:

Un laboratorio che analizza sostanze d’abuso deve essere separato dagli altri reparti del laboratorio di analisi

- RACCOLTA CAMPIONI URINA:

I campioni di urina possono essere raccolti presso il laboratorio di analisi o presso altre strutture o enti

- CAMPIONI RACCOLTI NEL LABORATORIO ANALISI:

Il prelievo verrà effettuato in locali idonei e secondo procedure che pur salvaguardando il riserbo individuale, assicurino l’identità l’integrità el’autenticità del campione

Struttura oraganizzativa

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Metodi analitici

TEST DI SCREENING (iniziali o di

primo livello)

TEST DI CONFERMA (o di secondo

livello

Metodi analitici

LE INDAGINI EFFETTUATE INLABORATORIO POSSONO AVERE

MOTIVAZIONI

• Cliniche

• Medico-legali

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RICHIAMI DI CONCETTI BASE

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Affidabilità e validità di un test di Laboratorio

Un test ideale (clinico, strumentale, di laboratorio) DOVREBBE essere

affidabile e valido.

Affidabilità di un test: capacità del test di offrire sempre lo

stesso risultato nel corso di ripetute misurazioni.

Validità di un test: capacità del test di distinguere in una

popolazione i soggetti sani da quelli malati.

Utilizzando un test ideale, tutti i soggetti sani dovrebbero risultare

negativi al test ed analogamente tutti i i malati dovrebbero risultare

positivi.

sanimalati

il test ideale...

cut-off

Sfortunatamente in medicina la realtà è notevolmente differente....

sanimalati

....il test reale

cut-off

FPFN

RICHIAMI DI CONCETTI BASE

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Il test di screening

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Sottoponendo una popolazione qualsiasi ad un test di screening, dato un certo valore di cut-off, purtroppo avremo sempre un certo numero di soggetti sani che risulteranno positivi al test e.....

... simmetricamente, un certo numero di soggettimalati che il test non riuscirà ad identificare come tali.

sanimalati

....il test reale

cut-off

Falsi

PositiviFalsi

Negativi

negativo positivo

FN = Falsi NegativiFP = Falsi Positivi

Specificità e sensibilità di un test

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Veri

Negativi

Veri

Positivi

Specificità: capacità del test di

individuare in una popolazione i

soggetti sani (o NEGATIVI)..

Sensibilità: capacità del test di individuare

in una popolazione i soggetti malati (o

POSITIVI).

Obiettivi:1. GIUSTA DIAGNOSI (intossicazione ?, tossicodipendenza?)

2. TRATTARE IL PAZIENTE IN MANIERA CORRETTA

3. SALVARE IL PAZIENTE

4. PREVENIRE LA RECIDIVA

TOSSICOLOGIA CLINICA

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Esami di laboratorio:• Test di screening (o di primo livello)• ANALISI QUALITATIVA: fornisce soltanto un risultato in termini di

presenza/assenza di una sostanza.

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*Limite operativo, scelto in base alle caratteristiche analitiche del metodo, per stabilire la positività o negatività del campione, permettendo di escludere i campioni negativi da ulteriori approfondimenti diagnostici (test di conferma). I campioni positivi, in ambito medico-legale, devono essere confermati con test di secondo livello.

Requisiti: economicità, rapidità, standardizzazione

Metodiche: immunochimiche

Risultati analitici:

negativi, risultato < valore soglia (cut-off)*

positivi, risultato ≥ valore soglia (cut-off)*

Test di screening o di primo livello

CLASSE DI SOSTANZE Concentrazione (ng/ml)

Oppiacei 300

Morfina libera 25

Cocaina metaboliti 300

Cannabinoidi - Δ9 THC (Δ9TetraHidroCannabinolo)50

Amfetamine ed analoghi 1.000

MDMA (MetilenDiossietilMetaAmfetamina)MDA (MetilenDiossiAmfetamina)

300

Benzodiazepine 500

Metadone 300

Bubrenorfina 10

Barbiturici 200

LSD (Dietilamide dell'acido lisergico) 0.5

PCP (Fenilciclidina) 25

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Cut-off (concentrazione soglia) per la positività nei test di screening (iniziali) – URINE

Tossicologia forense

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Obiettivi:AMMINISTRATITIVI O MEDICO-LEGALI

1. Commissioni medico-legali: disabilità alla guida

2. Determinazione requisiti psicofisici per il rilascio del porto d‟armi

3. Forze dell‟ordine: accertamento stato ebbrezza o assunzione

stupefacenti nella guida.

4. Fornire alla magistratura tutti gli elementi per un giusto giudizio.

DEVONO

− identificare i singoli analiti

− avere sensibilita e specificità maggiore

rispetto ai test iniziali

− basarsi su principi fisici e chimici diversi

da quelli dei test iniziali

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Requisiti: specificità, sensibilità superiore al valore soglia stabilito per il test di I livello

Metodiche: cromatografiche (GC, GC/MS, HPLC)

Utilizzo:

conferma della positività verifica di eventuali falsi positivi ai test di screening.

Test di conferma o di secondo livello

DEVONO

identificare i singoli analiti (risultato quantitativo per singola sostanza). basarsi su principi fisici e chimici diversi da quelli dei test iniziali

CLASSIFICAZIONE DEI LABORATORI

• Laboratorio di base nell’ambito della Biochimica Tossicologica

LABORATORIO DI 1° LIVELLO CHE ESEGUE SOLO TEST INIZIALI (o di screening)

• Laboratorio SPECIALIZZATO nell’ambito della Biochimica Tossicologica

LABORATORIODI II° LIVELLO CHE ESEGUE SIA LE ANALISI INIZIALI CHE DI CONFERMA

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ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

EIA (Immuno Enzimatiche)

CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay)

EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique)

FPIA (Immunofluorescenza a luce polarizzata)

KIMS (Interazione Cinetica di Microparticelle in Soluzione)

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Metodiche immunochimiche, applicate su

analizzatori automatici, attualmente più utilizzate per i test di screening

Immunodosaggi

Bibliografia\Immunodosaggi.docx

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Spettrofotometria

Immunometria


Analisi finalità


Alcol

MATRICI BIOLOGICHE

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Sangue

• La concentrazione ematica della sostanza ricercata consente di stabilire o di escludere la recente assunzione .

• È direttamente correlabile allo status psicofisico del soggetto al momento del prelievo.

• Il prelievo è invasivo e deve essere effettuato con il consenso dell’interessato.

URINE

MATRICE BIOLOGICA DI PRIMA SCELTA NELL’ANALISI DELLE SOSTANZE D’ABUSO

VANTAGGI: PRELIEVO NON INVASIVO DEL CAMPIONE POSSIBILITA’ DI CAMPIONARE GRANDI VOLUMI POSSIBILITA’ DI ANALIZZARE SIA LE SOSTANZE CHE I LORO METABOLITI DOPO

DIVERSI GIORNI.

SVANTAGGI: SCARSA RILEVANZA CLINICA DELL’ANALISI QUANTITATIVA POICHE’ LE

CONCENTRAZIONI DEGLI ANALITI VARIANO CON:• dose• via di somministrazione• tempo di latenza tra l’assunzione e l’analisi• stato fisiologico dell’individuo• aggiunta di sostanze adulteranti

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MATRICI BIOLOGICHE

Droghe d’abuso:dimezzamento e periodo approssimativo di rilevabilità nelle urine.

Droga Emivita nel plasma Durata del periodo di rilevabilità nelle urine (*)

Eroina Circa 3 min. Pochi minuti

Metaboliti della morfina Circa 6-25 min. Poche ore

Morfina 2-3 ore giorni

Cocaina 0,7-1,5 ore Poche ore

Alcuni metaboliti della cocaina

1-7 ore Da poche ore a 3-5 giorni

ATS (Amphetamine TypeSubstances)

7-34 ore 2-3 giorni

THC (Δ9 Tetra-idro-

cannabinolo) - metaboliti120 – 150 ore Da pochi giorni ad alcune

settimane.

Etanolo I livelli ematici decadono in media di 15-18 mg/dl/ora

1,5-12 ore a seconda del picco ematico; le urine rimangono positive per altre 1-2 ore

(*) Il periodo di rilevazione è dose dipendente. Maggiore è la dose, più lungo è il periodo durante il quale la droga o il suo metabolita significativo può

essere trovato nelle urine. 60

MATRICI BIOLOGICHE NON CONVENZIONALI PER L’ANALISI DELLE SOSTANZE D’ABUSO

• SALIVA

• SUDORE

• CAPELLI

• PELI PUBICI

• PELI ASCELLARI

• UNGHIE

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PERCHE’ UTILIZZARE MATRICI NON CONVENZIONALI NELLEANALISI FARMACO-TOSSICOLOGICHE?

PER INCREMENTARE IL TEMPO DI DETERMINAZIONE

Dopo somministrazione, ed in funzione dellecaratteristiche farmacocinetiche, una droga e/o i suoimetaboliti possono essere rilevati:

»Sangue h

»Saliva h

»Urina giorni

»Capelli mesi

62

63

La maggior parte delle droghe d’abuso (oppioidi, anfetamine, cocaina, ecc...) diffondono nel fluido orale per trasferimento passivo dal torrente circolatorio.Le concentrazioni salivari correlano con quelle ematiche.

Fa eccezione il principio attivo della Cannabis (THC - Δ9 Tetra-idro-cannabinolo) che non diffonde dal sangue alla saliva a causa della sua scarsa idrosolubilità e basicità

Fluido orale o saliva

Formazioni pilifere(matrice cheratinica)

64

I capelli hanno velocità di crescita variabile tra 0,8 e 1,4 cm/mese. Possono essere considerati come “memoria” delle sostanze tossiche presenti nell’organismo.Le droghe d’abuso si legano alla matrice cheratinica attraverso il flusso ematico, la secrezione delle ghiandole sebacee e sudoripare.Un risultato positivo può essere indice di un consumo abitudinario di sostanze d’abuso.

LIMITI

Un risultato negativo non può escludere l’assunzione occasionale.

Variabilità di risultati legata al colore dei capelli e l’origine etnica: i capelli più scuri fissano più metaboliti rispetto a quelli chiari.

I capelli possono essere adulterati mediante trattamenti cosmetici di decolorazione, tinture e permanente.

LA DETERMINAZIONE NEI CAPELLI DEI FARMACIE SOSTANZE STUPEFACENTI PUO’ ESSERE

RICHIESTA IN CASO DI:

• Morti correlate all’uso di farmaci e/o sostanze d’abuso;

• Valutazione di inidoneità alla guida;

• Responsabilità criminale;

• Affidamento, custodia minori;

• Esposizione prenatale a farmaci e sostanze d’abuso

65˜

ACCORGIMENTI NELLA RACCOLTA DEL CAMPIONE

Il prelievo deve avvenire in locali noncomunicanti con l’esterno e sotto controllo.

Non devono essere disponibili prodottidetergenti nel locale dove avviene laraccolta.

E’ consiglibile aggiungere opportunocolorante nell’acqua di scarico

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Principali test per indagare l’autenticità del campione di urine

pH •Valori di riferimento: 4,5 – 9• cut-off: 3 – 10Valori < 3 e >10 : campione sicuramente adulterato

Peso specifico •Valori di riferimento: 1,003 – 1,030• cut-off: 1,003Valori < 1,003 : campione sicuramente adulterato

Creatininuria •Valori di riferimento: 25 – 300 mg/dl• cut-off: 20 mg/dl - Valori inferiori : campione sicuramente adulterato

Concentrazioni fra 20 e 40 mg/dl sono fortemente sospette di adulterazione

Nitriti Possono essere presenti nelle urine in conseguenza di crescita batterica ma a concentrazioni massime di 5 mg/dl. Possono essere indice di adulterazione per aggiunta di sostanze attualmente in commercio.

Gluteraldeide • Cut-off: zero

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La catena di custodia - PREMESSA

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La validita’ dei risultati di laboratorio

non dipende solo dall’adeguatezza del

processo analitico ma anche dalla prova

dell’autenticità e integrità del campione

dal momento in cui e’ stato raccolto fino a

quando l’analisi viene completata

Catena di custodia, cos’è?

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Procedura documentata atta a ricostruire l‟iter di ogni

campione biologico all‟interno del laboratorio.

Obiettivi dellaCATENA DI CUSTODIA

70

definire l‟attuale ubicazione nel laboratorio del campione,

individuare tutti i soggetti che lo hanno manipolato,

conoscere tutte le date del processo:

• entrata/consegna in laboratorio

• eventuale movimentazione e/o smaltimento secondo le procedure vigenti.

PAUSA

71

PAUSA!

72

La vita è un'opportunità, coglila.

La vita è bellezza, ammirala.

La vita è beatitudine, assaporala.

La vita è un sogno, fanne realtà.

La vita è una sfida, affrontala.

La vita è un dovere, compilo.

La vita è un gioco, giocalo.

La vita è preziosa, abbine cura.

La vita è ricchezza, valorizzala.

La vita è amore, vivilo.

La vita è un mistero, scoprilo.

La vita è promessa, adempila.

La vita è tristezza, superala.

La via è un inno, cantalo.

La vita è una lotta, accettala.

La vita è un'avventura, rischiala.

La vita è la vita, difendila.

Inno alla vita

(Santa M.Teresa di Calcutta)

La vita è un'opportunità, coglila.

La vita è bellezza, ammirala.

La vita è beatitudine, assaporala.

La vita è un sogno, fanne realtà.

La vita è una sfida, affrontala.

La vita è un dovere, compilo.

La vita è un gioco, giocalo.

La vita è preziosa, abbine cura.

La vita è ricchezza, valorizzala.

La vita è amore, vivilo.

La vita è un mistero, scoprilo.

La vita è promessa, adempila.

La vita è tristezza, superala.

La via è un inno, cantalo.

La vita è una lotta, accettala.

La vita è un'avventura, rischiala.

La vita è la vita, difendila.

Inno alla vita

(Santa M.Teresa di Calcutta)

ALCOLUn problema clinico e sociale di grande rilevanza.

L‟etanolo, pur rientrando tra le sostanze d‟abuso, è trattato separatamente in quanto:

sostanza lecita e liberamente in commercio;

possiede aspetti normativi (limiti di concentrazione, matrici biologiche) ben definiti;

per struttura chimica e per livelli di concentrazione (espressi in g/L), può essere

determinato anche con metodologie analitiche analoghe a quelle utilizzate in chimica

clinica.

73

http://images.google.it/imgres?imgurl=http://img162.imageshack.us/img162/707/rtggtgkk7.jpg&imgrefurl=http://andreanderi.spaces.live.com/blog/cns!C8872B8B5B50F712!113.entry&h=746&w=508&sz=479&hl=it&start=18&tbnid=iiKJ9omqvVU2KM:&tbnh=141&tbnw=96&prev=/images?q=alcolisti&gbv=2&svnum=10&hl=it&sa=G

Biochimica e metabolismo dell’alcol etilico

Viene assorbito rapidamente (da 2 a 6 ore), in funzione di fattori quali:

•presenza di cibo e di altri liquidi

•tempo impiegato per l’ingestione della bevanda

•la variabilità biologica fra individui

74


Appena assorbito, si distribuisce rapidamente in tutti i tessuti e fluidi del

corpo, superando anche la barriera encefalica e placentare.

Ciò è dovuto

alla sua solubilità in acqua.

al suo basso peso molecolare.

75


• La massima concentrazione nel sangue viene raggiunta dopo circa 20 minuti dall’assunzione

• saliva ed espirato seguono da vicino le variazioni dell’alcolemia

• le urine raggiungono un massimo con circa 2 ore di ritardo.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

Co

nc.

(m

g/d

l)

Tempo dall’assunzione (min.)

Espirato Sangue Urine

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Alcolemia (g/L) Effetti0,50 – 0,80 EBBREZZA iniziale, accentuata da stati di ipoglicemia.

•Guida veicolare più rischiosa.

0,8 – 2,00 INSTABILITÀ EMOTIVA:•diminuzione delle percezioni sensoriali• loquacità•sonnolenza•deambulazione incerta• incoerenza ideativa•compromissione della valutazione di percezioni visive simultanee.

2,0 – 4,0 CONFUSIONE:•disorientamento (100% soggetti)•nausea, vomito•vertigini•sudorazione e salivazione profuse• incoordinazione motoria e ideativa

3,0 – 6,0 STUPORE-COMA:• iporiflessia•paralisi incombente•coma con acidosi metabolica• insufficienza respiratoria e circolatoria• ipotermia marcata

Correlazione tra alcolemia ed effetti clinici

77

Il maggior rischio di provocare un incidente grave o mortale correlato

all'assunzione di alcol:

comincia a manifestarsi a livelli di alcolemia tra 0.5 e 0.8 g/litro (0.5 g/litro

attuale limite legale)

cresce esponenzialmente per incrementi successivi dei livelli alcolemici:

per alcolemia intorno a 1 g/litro si ha un rischio relativo pari a circa 10

per alcolemia di 1.3 g/litro corrisponde un rischio relativo tra 25 e 30

A parità di alcolemia i rischi sono notevolmente maggiori per i conducenti

neo-patentati e più giovani.

A parità di alcolemia i rischi sono notevolmente maggiori per i conducenti

che bevono meno frequentemente (es. giovani che assumono bevande

alcoliche esclusivamente nel fine settimana).

Il rischio di incidente stradale in soggetti che guidano nelle ore notturne

del fine settimana con alcolemia superiore a 1.5 g/litro è di circa 380 volte

maggiore rispetto al rischio relativo ai soggetti sobri.

Alcol e guida

78

Interazione alcol-sostanze d'abuso

• L'alcol interagisce con molti farmaci e sostanze d'abuso potenziandone gli effetti anche a distanza di diverse ore.

79

Interazione alcol-sostanze d'abuso

• alcol - marijuana

• alcol - oppiacei

• alcol – stimolanti (cocaina, anfetamine, ectasy)

La frequenza del poli-abuso induce a pensare che le diverse dipendenze

condividano processi patogenetici psicologici e biologici.

Le diverse sostanze, attivando i medesimi circuiti cerebrali (via dopaminergica

mesencefalo-limbica), possono svolgere una funzione vicariante, sostituirsi a

vicenda e sommare i propri effetti per produrre stati di

euforia/gratificazione.

80

Ruolo del Laboratorio di Analisi di Biochimica clinica e Tossicologia

81

Accertare l‟avvenuta assunzione di etanolo

Stabilire se il paziente è un etilista

Valutare gli eventuali danni prodotti all‟organismo del bevitore

Intossicazione acuta

• Alcolemia Abuso cronico

• Alcoluria

• Biomarcatori

82

I Marcatori dell’abuso alcolico

Acuto Recente Cronico

Alcool Etilglucuronide (EtG) GammaGT

Alcool espirato Volume Corpuscolare Medio (MCV)

Transaminasi (AST/ALT)

Trasferrina carboidrato Depleta (CDT)

83

I Marcatori dell’abuso alcolico

DIRETTI

Sostanze legate alla eliminazione/metabolismo alcool

INDIRETTI

Sostanze modificate dall’abuso recente o cronico dell’alcool

Alcool (sangue-urine-espirato) GammaGT

Etilglucuronide (EtG) Transaminasi (AST/ALT)

Volume Corpuscolare Medio (MCV)

Trasferrina carboidrato Depleta (CDT)

ACIDO URICO, TRIGLICERIDI, UREA

Alcolemia, alcoluria e biomarcatori correlati

1) ALCOLEMIA

• Etilometro

• Metodiche enzimatiche (test di screening o di 1° livello)

• Metodiche Gas-Cromatografiche (GC) e Spettrometria di Massa (MS): test di conferma o di 2° livello

2) ALCOLURIA

3) BIOMARCATORI• γ-GT, MCV, Transaminasi

• Etil-glucuronato (EtG)

• Transferrina desialata (CDT)

84

Etilometro

85

La misura dell‟alcol nell‟area alveolare è alla base del test.

I risultati ottenuti con l‟etilometro correlano con quelli gascromatografici

ottenuti nel sangue perché dopo 15 minuti dall‟assunzione l‟etanolo dell‟area

alveolare è in equilibrio con quello ematico.

Il principio analitico usato nello strumento si basa su un rivelatore posto sul

cammino dell‟aria espirata. Il rivelatore può essere elettrochimico,

all‟infrarosso, a semiconduttore o amperometrico. La misura fatta

sull‟espirato, moltiplicata per 2.300, dà con ottima approssimazione il valore

dell‟alcolemia.

Etilometro

In base al regolamento applicativo del nuovo codice della strada questo è

l‟unico strumento legale per controllare lo stato di ebbrezza dei guidatori.

Alcuni modelli sono studiati appositamente per le Forze dell‟ordine: fanno riferimento al limite

consentito dal Codice della Strada per la guida di autoveicoli (0,50 g/l), rendendo sicura ed

immediata l‟interpretazione del risultato.

È sufficiente soffiare per pochi secondi nel boccaglio. Il valore alcolemico appare sul display dopo alcuni

secondi.

Per legge si devono fare due misure, separate da almeno 5 minuti (per evitare sopra-valutazioni dovute alla

presenza di alcol buccale) e i due valori devono essere concordi .

Impieghi: Screening, Forze di Polizia, Prevenzione, Ser.T, Comunità terapeutiche, Discoteche, Pronto

Soccorso, Trasporti, Industria, Lavoro.

86


1) ALCOLEMIA

• Etilometro



2) ALCOLURIA




87

Le metodiche enzimatiche

88

Le metodiche enzimatiche, seppur dotate di un buon livello di

precisione e di accuratezza risultano dotate di sensibilità e specificità

sufficienti per fini clinici, ma non per fini giuridici.

Il rischio di ottenere “falsi positivi” (per limiti di specificità) o “falsi

negativi” (per limiti di sensibilità) comporta la necessità, per le analisi

con valenza medico-legale, di confermare sia i risultati positivi che

quelli dubbi con metodiche gas-cromatografiche.

La reazione enzimatica

89

Principio della procedura: colorimetrico (metodo con lastrina ).

La lastrina è caratterizzata da una struttura multistrato su supporto in poliestere.

Sulla lastrina viene depositata una goccia di campione del paziente.

L‟etanolo nel campione viene ossidato tramite alcool deidrogenasi (ADH) in acetaldeide.

Il coenzima (NAD+) è trasformato nella forma ridotta (NADH). Il tampone

(idrossimetil)amminometano (TRIS) negli strati di reazione trattiene l‟acetaldeide per portare la

reazione a compimento.

La densità di riflettanza del NADH viene misurata ed è proporzionale alla concentrazione di

etanolo nel campione.

NADH ha un picco di assorbimento a 340 nm (UV)


1) ALCOLEMIA

• Etilometro



2) ALCOLURIA



• Transferrina desialata(CDT)

90

La cromatografia

91

HPLC (High Performance Liquid Chromatografy)

92

Nell‟HPLC campione e l‟eluente sono spinti a scorrere all‟interno della

fase stazionaria applicando notevoli pressioni (dell‟ordine di centinaia di

atmosfere).

Vantaggi:

• la dimensione ridotta della colonna che evita problemi di deviazioni

longitudinali (movimenti della fase mobile longitudinali) e di percorsi

alternativi;

• velocità di eluizione (passaggio della fase mobile attraverso la

colonna) costante e regolabile;

• velocità di esecuzione ridotta;

• piccole quantità di composto necessaria all'analisi (nell'ordine dei 5-10

microgrammi di campione solubilizzato in apposito solvente)

• elevata accuratezza e precisione.

Deriva dalla cromatografia classica e si basa sugli stessi principi.Nella cromatografia classica il componente principale è la colonna che contiene la fase stazionaria all‟interno della quale scorre la fase mobile rappresentata dall‟eluente.

CLASSIFICAZIONE DEI LABORATORI

• Laboratorio di base nell’ambito della Biochimica Tossicologica

LABORATORIO DI 1° LIVELLO CHE ESEGUE SOLO TEST INIZIALI (o di screening)

• Laboratorio SPECIALIZZATO nell’ambito della Biochimica Tossicologica

LABORATORIODI II° LIVELLO CHE ESEGUE SIA LE ANALISI INIZIALI CHE DI CONFERMA

93

Gas-cromatografia dello spazio di testa

• Quando si devono analizzare tracce di composti volatili in campioni solidi la tecnica più adatta a questo scopo è la gascromatografia dello spazio di testa.

• Essa consiste nell’iniettare nella colonna del cromatografo il vapore che si trova in equilibrio termodinamico con il campione da analizzare.

94

• Ciò permette di lavorare su una frazione arricchita delle specie chimiche ad elevate pressioni di vapore, senza gli inconvenienti che possono scaturire dalla iniezione di sostanze non volatili.

• Si realizzano così analisi molto precise e riproducibili, a patto però di controllare rigorosamente le condizioni operative.

95

• Procedendo all’analisi gascromatograficadello spazio di testa si otterrà un cromatogramma il cui picco che ci interessa avrà una superficie S, proporzionale alla concentrazione della sostanza nel vapore e quindi nella fase liquida.

La tecnica dello spazio di testa consente di individuare tracce di composti volatili a livello di di ppt (parti per trilione), perché la fase di vapore è ovviamente più ricca, nel composto volatile del della soluzione originaria. In sostanza, lo spazio di testa può essere visto dunque come un metodo di preconcentrazione.

96

analita

Camera di ionizazione

fascio ionico

Campo elettrico acceleratore

Campo magnetico analizzatore

Spettrometria di massa• In uno spettrometro di massa il campione viene portato in fase gassosa e le

molecole vengono frammentate per bombardamento con elettroni.

• Gli ioni che si formano , accelerati da un campo elettrico posto in un campo magnetico, percorrrono traiettorie diverse secondo il rispettivo rapporto carica/massa e perciò si separano tra di loro.

Lo spettro (così chiamato solo perché è a righe, non perché si tratti di una spettroscopia) ottenuto, consente, dall’identificazione dei frammenti in base alla loro massa atomica, di ricostruire la formula della molecola presente.

Molto più semplicemente, negli strumenti moderni lo spettro viene confrontato dal computer con i numerosi spettri memorizzati nella banca dati.

97

50 100 150 200 massa relativa

Ab

bo

nd

anza

rel

ativ

a

98

• Lo spettrometro di massa rappresenta il rivelatore ideale per la gascromatografia, perchè permette di analizzare in tempo reale i singoli picchi in uscita dalla colonna, effettuando sia un’analisi qualitativa che quantitativa, mediante il confronto dello spettro ottenuto con uno dei numerosi spettri memorizzati nella banca dati.

Accoppiamento GC-MS.


1) ALCOLEMIA

• Etilometro



2) ALCOLURIA




99

ALCOLURIA /1

100

L‟etanolo urinario non è un buon indicatore per valutare lo stato di ebbrezza,

data l‟estrema variabilità della concentrazione, a parità di assunzione.

Tuttavia, la maggiore permanenza dell‟etanolo nelle urine, rispetto al sangue,

lo rende utile per monitorare l‟astinenza: a questo scopo occorre che l‟esame

venga richiesto quasi giornalmente, a causa del basso tempo di emivita

dell‟etanolo.

L‟etanolo, persiste in circolo per circa 6 ore e si ritrova nelle urine fino a 12

ore dopo l‟assunzione. Per monitorare assunzioni precedenti tale intervallo,

sono indicati altri marcatori.

Rispetto al sangue, le urine hanno il grosso vantaggio di non richiedere

prelievi invasivi.

ALCOLURIA /2

101

La presenza di etanolo nelle urine va valutata caso per caso.

La positività a bassi valori di concentrazione (30-50 mg/dL) in urine prelevate

dopo pranzo è poco significativa mentre è preoccupante se il prelievo è fatto

di mattina.

Un solo valore positivo non significa nulla mentre più valori positivi indicano

evidentemente l‟assunzione cronica di alcol.

Valori positivi in persone che dovrebbero essere astinenti sono ovviamente

indice di interruzione dello stato di sobrietà.

Le metodiche analitiche sono le stesse che per l‟alcolemia.


1) ALCOLEMIA

• Etilometro



2) ALCOLURIA




102

γ-GT: GAMMA-GLUTAMIL TRANSFERASI

• Risulta essere un test di primo livello nella diagnosi di consumo cronico di alcol. La γ-GT sierica aumenta per un meccanismo di induzione enzimatica indipendentemente dalla presenza o meno di danno epatico alcol-correlato.

• Emivita: 2-3 settimane dopo la completa astensione dall'uso di bevande alcoliche.

• Falsi positivi: pancreatite, diabete, obesità; azione enzimoinducente di alcuni farmaci (barbiturici, antiepilettici, anticoagulanti).

• Sensibilità: 34-85 %. Specificità: 11-85 %.

103

MCV: VOLUME CELLULARE MEDIO

• L'aumento dell'MCV riscontrabile negli etilisti è secondario sia all'azione tossica diretta dell'acetaldeide sulla replicazione dei precursori degli eritrociti a livello midollare, sia all'interferenza esercitata dall'etanolo sull'assorbimento intestinale di acido folico e vit. B12.

• Emivita: circa 3 mesi dopo la completa astensione dall'uso di bevande alcoliche.

• Falsi positivi: carenza di folati, vit. B12, patologie epatiche non alcol-correlate, ipotiroidismo, tabagismo.

• Sensibilità: 32 %. Specificità: 94 %.

GGT + MCV• L'incremento combinato di tali parametri garantisce una maggiore

specificità e sensibilità nell'identificazione del consumo eccessivo di bevande alcoliche.

• Sensibilità: 17-63 %. Specificità: 74-98 %.

104

TRANSAMINASI

AST: ASPARTATO AMINOTRANSFERASIALT: ALANINA AMINOTRANSFERASI

Tali enzimi sono più indicati per constatare un danno epatico piuttosto che un consumo di bevande alcoliche.

• Un maggiore incremento delle AST rispetto alle ALT fa propendere per un danno epatico alcol-correlato.

• Emivita (AST e ALT): 2-3 settimane dopo completa astensione dall'uso di bevande alcoliche.

• Falsi positivi: epatopatia non alcolica (incremento AST + ALT), disordini muscolari(incremento AST), infarto miocardico (incremento AST).

• Sensibilità (AST): 15-69 %. Specificità (AST): bassa.• Sensibilità (ALT): 26-58 %. Specificità (ALT): bassa.

105

ALTRI MARKERS DI ALCOLISMO CRONICO

ACIDO URICO, TRIGLICERIDI, UREA In caso di consumo di bevande alcoliche possiamo ritrovare tali

parametri biochimici incrementati per i danni metabolici conseguenti.

5-HTLO (5-idrossi-triptololo ) urinario, Dolicolo urinario, Malonil-dialdeide, β-esosaminidasi, addotti proteici dell’Acetaldeide:

non vi sono evidenze significative che queste determinazioni apportino ulteriori elementi di specificità e sensibilità nella diagnosi di assunzione alcolica acuta e cronica

106


1) ALCOLEMIA

• Etilometro



2) ALCOLURIA




107

Etil Glucuronide

108

ESAMI DI LABORATORIO NON ROUTINARI

CH3

O

HOH

HH

H

H

OOH

OH

COOH

Etil glucuronide: che cosa è?

109

Che cosa è?

• E’ un metabolita diretto dell’alcool etilico (EtOH)

• Circa lo 0,02% dell’Alcool viene escreto come EtG

• Si forma per coniugazione dell’EtOH con l’acido glucuronico (nel fegato)

• La glucuronazione serve a rendere più solubili le sostanze che così vengono escrete più facilmente con le urine


1) ALCOLEMIA

• Etilometro



2) ALCOLURIA




110

CDT: TRANSFERRINA DESIALATA

• Rappresenta uno dei più recenti marcatori biologici di consumo alcolico. L'aumento della CDT è secondario all'inibizione della glicosilazione proteica indotta dall'etanolo e dall'acetaldeide.

• I valori della CDT aumentano dopo almeno 7 giorni di assunzione di etanolo in quantità comprese tra 50-80 g/die e si mantengono elevati per almeno 15-20 giorni.

• È stato evidenziato che tale marker possiede una maggiore sensibilità (39%) nell'uomo rispetto alla donna, nella quale è stata riscontrata una maggiore sensibilità dell'MCV (40%).

• Nei pazienti giovani (tra 20 e 40 anni nell'uomo e tra 20 e 30 anni nella donna) la CDT aumenta più spesso rispetto ai restanti convenzionali marker di consumo alcolico (MCVe GGT).

111

Transferrina desialata /1

112

La transferrina è la più importante proteina di trasporto del ferro.

È sintetizzata principalmente dagli epatociti.

È una molecola estremamente eterogenea (isoforme della stessa molecola)

per la presenza di due catene glicosidiche con un numero variabile di

ramificazioni, ciascuna delle quali termina con un residuo di acido sialico (un

carboidrato).

La principale isoforma (64% - 80%) della transferrina contiene 4 residui di

acido sialico per cui è detta tetrasialo-trasferrina.

In conseguenza dell‟abuso cronico di alcol, è stato documentato un abnorme

aumento di isoforme desialate, normalmente presenti in piccole

concentrazioni nel siero di soggetti sani ed in particolare della disialo-

trasferrina ed in misura minore anche della asialo-trasferrina, indicate con il

termina di CDT (Carbohydrate Deficient Transferrin,Trasferrina carente di

carboidrati)

Transferrina desialata /2

113

La CDT attualmente costituisce l‟indicatore più specifico dell‟abuso cronico di

alcol con una specificità che in diversi lavori risulta variabile dal 90 al 100%

Aumenti di CDT indipendenti dall‟assunzione di alcol sono stati riportati in

•Gravidanza

•Grave unsufficienza epatica causata da cirrosi biliare primitiva

•Epatite cronica attiva

•Carcinoma epatocellulare

•Galattosemia

•Fibrosi cistica

•Sindromi da deficienza glicoproteica (disordini del metabolismo delle

glicoproteine)

•Varianti genetiche della transferrina: variazioni del Punto Isoelettrico della

molecola (dovuti alla sostituzione – genetica - di alcuni aminoacidi nella catena

polipeptidica) possono interferire con la determinazione della CDT.

Valori di rif. (nel n/s laboratorio) = < 2%

N.B. Nelle donne sane le concentrazioni di CDT sono mediamente maggiori

rispetto a quelle della popolazione maschile.

GRAZIE PER L’ ATTENZIONE !

114

Date post:	18-Feb-2019
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