Il ruolo della Chimica e della Fisica per le Scienze della Vita: Il loro contributo allo sviluppo di una diagnostica innovativa. www.unifi.it/peptlab www.unifi.it/peptlab Laboratorio Laboratorio Interdipartimentale Interdipartimentale di di Chimica Chimica e e Biologia Biologia di di Peptidi Peptidi e e Proteine Proteine Polo Polo Scientifico Scientifico e e Tecnologico Tecnologico di di Sesto Sesto Fiorentino Fiorentino Universit Universit à à di di Firenze Firenze Prof. Anna Maria Papini, Prof. Anna Maria Papini,
Transcript
Il ruolo della Chimica e della Fisicaper le Scienze della Vita:
Il loro contributo allo sviluppo diuna diagnostica innovativa.
www.unifi.it/peptlabwww.unifi.it/peptlab
LaboratorioLaboratorio InterdipartimentaleInterdipartimentale didiChimicaChimica e e BiologiaBiologia didi PeptidiPeptidi e e ProteineProteine
Polo Polo ScientificoScientifico e e TecnologicoTecnologico didi Sesto Sesto FiorentinoFiorentino
UniversitUniversitàà didi FirenzeFirenze
Prof. Anna Maria Papini, Prof. Anna Maria Papini,
Mondo Macroscopico Mondo Molecolare
Lewis Carroll, Through the looking-glass, Penguin Books, London, 1998 Illustrations by John Tenniel
Cais do Sodre Metro Station Lisboa, Antonio Dacosta
Gentilemente concessodal Pr. M. Verdaguer a OpenLab
Studio dei meccanismi molecolaridi condizioni fisiologiche e patologiche
Composizione chimica di una tipica cellula eucariota
50% delle proteine sono modificate!
COMPLESSITA’ BIOLOGICA
Da 30.000 geni umani
300.000 – 3.000.000 forme distinte di proteine
Mondomacroscopico
Mondomolecolare
metro … nano metro …
mole … molecola …
1 / 1 000 000 000 = 10 - 9
110+23
Studio dei meccanismi molecolaridi condizioni fisio-patologiche
Hermann Emil Fischer
Berlin University, Germany.b. 1852; d. 1919
1899: Fischer inizia a lavorare sulla chimica delle proteine
Peptidedal Greco πεπτος (digeribile)
Proteinadal Greco πρώτα (di primaria importanza)
1899: isola via idrolisi di alcune proteine tre amminoacidi (valina, prolina, idrossiprolina)
It’s the first time in which a pure amino acid was obtained from a protein by acid hydrolysis.He boiled gelatin with sulfuric acid for 5 hours, neutralized the acid with calcium carbonate, evaporated the filtrate from the calcium sulfate to a syrup and left it to stand for about a month. At the end of this time there was crystals that possessed a sweet taste: he thought that the product was a sugar so he named it “sucre de gélatine”
1820: “Sur la conversion des matières animales en nouvelles substances par le moyen de l’acide sulfurique”
Henri Braconnot (1780-1855)
1846: experimental data in support of the correct composition of glycine (C2H5NO2) after studies on “sucre de gélatine” also called “leimzucker”
He hydrolyzed casein by boiling with hydrochloric acid in the presence of stannous chloride, removed the tin, crystallized out the glutaminicacid hydrochloride crude and then diluted the sirup mother liquor and treated it with phosphotungstic acid. The heavy precipitate was decomposed with barium hydroxide, the excess of this reagent wascarefully precipitated and the solution was acidified with hydrochloric acid and concentrated to a sirup. After crystallization, it was redissolvedand the solution was diluted with alcohol and ether. At the end he found the chloroplatinate salt that crystallize in long prisms.
Heinrich Ferdinand Edmund Drechsel (1843-1897 )
1889: “Zur Kenntniss der Spaltungsprodukte des Caseins”
J. Habermann (1841-1914)
MPT
Glicosilazione
Lipidazione
Fosforilazione
Metilazione
Chelazione di ioni metallici
Deimminazione
Solfatazione
H-Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)8-Gly-OH
Br
R
Cl
OH2N COOH
R'
Br
RHN
O
COOH
R'
NH3
H2N
RHN
O
COOH
R'
NH4Br
Elongazione della catena peptidica nella direzione C N
utilizzando cloruri di α-alogeno acidi
Fischer E., Otto E. Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1903, 36, 2106-2116; Fischer E. Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1907, 40, 1754-1767.
1903: Fisher riesce a sintetizzare e caratterizzareil primo polipeptide costituito da 18 amminoacidi legati tra loro
mediante legame peptidico(legame ammidico)
A cosa porta la sintesi chimica di un dipeptide se non sono protette le funzioni che sono ugualmente reattive e che non vogliamo far reagire?
Una miscela di almeno 4 prodotti
Vincent Du Vigneaud
Cornell University Ithaca, NY, USA b. 1901; d. 1978*Stimola la contrazione uterinanel corso del travaglio
*Stimola la produzione di latte
*Favorisce il comportamento materno
Premio Nobel per la Chimica 1955
“Per l’isolamento la caratterizzazione e la prima sintesi dell’ormone polipetidico Ossitocina”
(1949-1953)
Primo Premio Nobel per la Chimica nel1958
“per il suo lavoro sulla struttura delle proteine, e in particolare dell’insulina”
Frederick Sanger
University of Cambridge, United Kingdom b. 1918
Secondo Premio Nobel per la Chimica nel 1980 per aver contribuito alla comprensione delle sequenze di basi negli acidinucleici insieme a W. Gilbert e P. Berg (DNA recombinante)
J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963).
Robert B. Merrifield
Rockeffeller University, New York, NY, USA. b. 1921-2004
Premio Nobel per la Chimica 1984
“per lo sviluppo e la messa a punto della metodologia di sintesi chimica di peptidi su supporto solido"
Sintesi Peptidica su Fase solida
X
Polimero solido con un gruppo capace di ancorare l’ultimo
amminoacido della sequenza
ON
Y
O
R1
H
Accoppiamento del primo amminoacido protetto sulla
funzione amminica
OH2N
O
R1
Deprotezione selettiva del gruppo otettore della funzione amminica
che deve reagire con la funzione carbossilica dell’amminoacido da
introdurre
pr
ONH O
R1N
O
R2
H
Y
Accoppiamento del successivo
amminoacido protetto sulla funzione amminica
ONH O
R1N
O
Rn
H
NY
O
Rn+1
H
Ripetizione per n-volte dei cicli di deprotezione e
accoppiamento (elongazione della catena)
OHNH O
R1N
O
Rn
H
H2NO
Rn+1
Distacco del peptide desiderato dalla resina
e deprotezione delle catene laterali
Sintesi Peptidica su Fase Solida
Direzione C NNα-Protecting groupHN
Distacco finale del peptide dal supporto solido e contemporaneadeprotezione delle catenelaterali degli amminoacidi
CH
XCO
OH +
Side chainprotecting group
ResinLinker
Nα-Protecting groupHN C
H
XCO
O
Side chainprotecting group
ResinLinker
H2N CH
XCO
O
Side chainprotecting group
ResinLinker
N CHXm
CO
O
Side chainprotecting group
ResinLinkerNα-Protecting group N CH
Xn
CO
Side chainprotecting group
HH
n-1
N CH
Xm
CO
OHH2N CH
Xn
CO H
n-1
Repetitive cycles1) Protected amino acid2) Coupling reagent3) Deprotction of the N-alpha
Ancoraggio del primo amminoacido ad un
suporto solido
Cicli Ripetitivi
Robert B. Merrifield e il suo primo prototipo di sintetizzatore automatico di mini-proteine (peptidi)
"for fundamental work in the field of quantum electronics, which has led to the construction of oscillators and amplifiers based on the maser‐laser principle"
Nicolay Gennadiyevich Basov Aleksandr Mikhailovich Prokhorov
Premio Nobel per la Fisica 1964
Maser:"microwave amplification by stimulated emission of radiation“The word "laser“ replaces "microwave" by "light".
Basato sul concetto di emissione stimolataintrodotto da Einstein nel 1917
‘Decision-Making Tools’ particolarmente importanti nel processo di validazione di Trattamenti Terapeutici
Innovativi e personalizzati
MRI
Una qualsiasi misurazione che predica una condizione patologica di un paziente o la risposta ad una terapia e quindi avente un putativo valore diagnostico e/o prognostico
Antigene or Anticorpo
Le proteine possono essereaberrantemente modificate e scatenare una risposta
del sistema immunitario
Infezioni Virali o Batteriche
Caratterizzazione di autoanticorpi nel siero di pazienti come Biomarkers di malattia
Gli autoanticorpi riconoscono peptidi cortinegli antigeni proteici
Test basati su peptidi (epitopi lineari o conformazionali)
Conformeri a più bassa energia.Regioni di β-turn e β-strand sono evidenziate come ribbon
Type I β-turn[Pro7,Asn8(Glc),Thr10]CSF114
IC50 11.8 nM
J. Med. Chem. 200649, 5072.
Type I’ β-turnCSF114(Glc)
IC50 137 nM
Peptidi mimetici della porzione di proteina modificata aberrantemente
Standardizzazione di test diagnostici/prognostici
Per monitorare le malattie
Per valutare l’efficacia ditrattamenti terapeuticipersonalizzati e innovativi(alternativa a test suglianimali)
Disegnare & sviluppare sonde sintetiche per identificare autoanticorpi nel siero di pazienti
affetti da malattie autoimmuni
MS Abs
Chemistry Today (2007) 25, 3, 14-16.
Innovative“Chemical Reverse Approach” to autoepitomics
Diagnostic/prognostic assays based on Synthetic Antigenic Probes
PTM Current Prot. & Pept. Sci. (2003) 4, 277-284.
Specificity & High Affinity
Sensitivity
J. Med. Chem. (2001), 44, 2378-2381.Zervas Award 2008
The glycopeptide antigen selected for the development of MS PepKit
A diagnostic/prognostic testto monitor Multiple Sclerosis
O
HOHO
HO NH
OH
O
NH O
Ribbon diagram of the lowest energyconformer of 200 calculated structures
derived from NMR data
(Insight II Software, Biosym, San Diego)
Asn(Glc)
The minimal epitope recognized
CSF114(Glc)Multiple Sclerosis Antigenic Probe
Granted USA & Australian Patent (n. 2002316989) .PCT WO 2003000733. Priority data FI2001A00011Inventors: A.M. Papini, P. Rovero, M. Chelli, F. Lolli
Applicant: University of Florence. Nature Medicine (2005) 11, 13.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2005) 102, 10273-10278.
J. Neuroimmunol. (2005) 167, 131-137.Neurology (2005) 65(5), 781-782.
SP-ELISA
Supportosolido
Adsorbimentodel peptide
Aggiunta del sieroche contiene
Anticorpi
Rimozionedelle molecole
che non sisono legate
Anti-Ig-antisiero +
enzima
Sviluppo diuna reazionecolorimetrica
Test Immunochimico su fase solidaEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
β-hairpin quale antigene peptidicoche riconosce anticorpi con elevata
specificità e affinità
The BioPlex suspension array system incorporates laser flow technology to analyze reactants in a microtiter format
Bioplex per la caratterizzazione di autoanticorpi
Peptide
Test per misurare Anticorpi anti-CCP usato per la diagnosi e la prognosi dell’Artrite Reumatoide
Artrite Reumatoide
Anticorpi contro FattoriReumatoidi forti indicatori
di malattia ma markers non specifici
Nelle giunture presenza diPAD e produzione in situ di anticorpi anti-filaggrina
citrullinata
Anticorpi contro FattoriReumatoidi forti indicatori
di malattia ma markers non specifici
Nelle giunture presenza diPAD e produzione in situ di anticorpi anti-filaggrina
citrullinata
Artrite Reumatoide
Citrullinazione(PAD- Peptidilarginina deimminasi)
Test per identificare Anticorpi anti-CCP usato per la diagnosi e la prognosi dell’Artrite Reumatoide
-O NH
NH2
O
NH3+
O
-O NH
NH2
O
NH3+
NH2+PADIs 4
Arginine avec charge + Citrulline
Citrullinazione(PAD- Peptidilarginina deimminasi)
Clinical Research / Literature/SMEs
Modeling, ChemistryDesign & Synthesis
Diagnostic DeviceDevelopment
Patient
Il segreto: azioni sinergicheProgetti multidisciplinari “from bench to bedside”
• Improved quality of Healthcare Services
•Rationalization of Research Resources
GLP
Clinical TrialsGCP
KnowledgeTransfer
CE Certification
Detection & CharacterizationGRP
GRP
KnowledgeTransfer
Reverse Approach
Se ho visto più lontano degli altri è grazie ai
giganti sulle cui spalle stavo seduto
I. Newton
Everything that goes on in biologyor medicine has a physical and chemical basis”R. Lerner, Immunologist, Scripps Research Institute, 1998
Vi aspettiamo oggi pomeriggio18 Marzo 2011 alle ore 14 e 30
al Polo Scientifico e Tecnologicodi Sesto Fiorentino
