Date post: | 03-May-2015 |
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IMMUNOFENOTIPOCitometria a flusso
Identificazionepopolazione
cellulare
ago-aspirato midollare, linfonodale, sangue periferico liquor, versamenti
Caratterizzazione
popolazione cellulare
• linea di appartenenza• stadio di differenziazione• asincronia maturativa• presenza di aberrazioni antigeniche
Quantificazione
Intensita’ di espressione di un determinato Ag sulla cellula (MIF e ABC)
L ’esecuzione di una corretta analisi citofluorimetrica
su popolazioni neoplastiche NON PUO’ PRESCINDERE
DALLA CONOSCENZA DELLE CARATTERISTICHE
MORFOLOGICHE della popolazione da esaminare e
dal sospetto diagnostico
Citometria Vs Citometria a flusso
Citometria• e’ possibile localizzare un antigene•scarsa capacita’ di analizzare piu’ parametri•scarsa capacita’ di valutare i diversi sottotipi cellulari•valutazione morfologica quantitativa e qualitativa
Citometria a flusso• e’ possibile analizzare moltissime cellule in un tempo breve•capacita’ di analizzare piu’ parametri•approccio multiparametrico quantitativo e qualitativo
IMMUNOFENOTIPO
ELETTRONICA
cellule in sospensione
passano in singola fila attraverso
un volume illuminato dove esse riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza che viene raccolta, filtrata e
convertita ad un valore digitale
che viene inviato al compiuter
OTTICA
FLUIDICA
Tecnica multiparametrica che misura le caratteristiche fisiche e/o chimiche di cellule insospensione all’interno di un fluido di trasporto
Citofluorimetria: definizione
Camera di flusso (componente fluida)
Citofluorimetro: principi
Citofluorimetro: principi
SPETTRI DI FLUOROCROMI
Analisi citofluorimetrica
Perche’ si guarda FSC Vs SSC
Dato che FSC “ dimensione cellulare” e SSC “ struttura interna”, la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule
CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU
CELLULE BLASTICHE
CITOGRAMMA NORMALEESEMPIO DI CITOGRAMMA NORMALE: IL CD45
CD45: citogramma di un midollo normale
1-LYMPH2-MONO 3-GRAN
4-BLAST
5-ERY
Perche’ si guarda CD45 Vs SSC
Dato che SSC “ dimensione cellulare” e CD45” pan leucocitario” la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule
SSC
CD
45
Maturazione mieloide: SIDE SCATTER
Normale Aberrante
CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU
LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE
CITOGRAMMA NORMALEESEMPIO DI CITOGRAMMA PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA)
CITOGRAMMA NORMALEESEMPIO DI CITOGRAMMA PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA)
CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU
CELLULE BLASTICHE
STEM CELLSTEM CELL
CD117HLA-DRCD90CD38
CD34+Lymphoid progenitorLymphoid progenitor
CD19CD10CD22cCD79aTdTCD38sCD22CD24
B-progenitor
B lymphociteCD19
CD20CD22sCD79bFMC-7CD38sIgMIg kappaIg lambda
Cortical thymocytecCD3
CD1aCD2CD5CD7CD4 CD8CD38
T lymphocitesCD3CD7CD2CD5CD4CD8TCR a/bTCR g/d
CD34+
CD34+/- CD34-
CD34- CD34-
CD117HLA-DRCD90TdTCD38
CD117HLA-DRCDw123AC133CD33CD38
Myeloid progenitorMyeloid progenitor
CFU-GM CD33
CD13
Myeloblast
CD13CD33CD15
BFU-E/CFU-ECD36CD71Gli-A
CFU-MK
CD61CD41CD42a
CD34+
CD34+ CD34-
CD34-
CD34-
CD14CD11b
cCD79a
MPO
MATURAZIONE LINFOIDE B
MATURAZIONE LINFOIDE T
Schema di differenziazione delle cellule B normali
Sangue midollare da donatore sano Vs LAL B
Schema di differenziazione delle cellule B normali
SUPERFICIE
SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE B
Marcatori B-lineage
CD4 CD2 CD5
CD5 CD2 CD4 C
D8
CD
3
CD
3
CD
8
CD
3
CD
3
Schema di differenziazione delle cellule T normali
SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE T
Marcatori T-lineage
SUPERFICIE
IMMUNOFENOTIPOUtilizzo di 6-8 colori per la identificazione di antigeni di superficie,
citoplasmatici e nucleari; possibilita’ di studiare qualsiasi sospensione cellulare
Identificazione dei “leukemia-associated” Phenotypes (LAIP)
Firma fenotipica paziente-specifica
Utilizzo delle aberrazioni specifiche sia per la diagnosi che per lo studio della Malattia Minima Residua
IMMUNOFENOTIPO
Permette di IDENTIFICARE,QUANTIFICARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti (linea di appartenza, stadio di differenziazione, presenza di aberrazioni, intensita’ di espressione antigenica MIF e ABC)
In caso di antigeni specifici l’immunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima
Marcatori cellulari: la nomenclatura CDSi considera membro di un Cluster Differentiation un marcatore di superficie che:•identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo
•ha una struttura biochimica definita
•è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi
FL2-H FL2-H FL2-H
Area di calcolo Area di calcolo
ABCABC ( (Antibody Binding CapacityAntibody Binding Capacity))
MIF La Mean Intensity Fluorescence è un valore fornito dal citofluorimetro e rappresenta il rapporto tra la fluorescenza del campione e quella dell’isotipo; e’ proporzionale ai siti di legame MIF= intensita’ media M2/intensita’ media M1
ABC Antibodies Bound per Cell è un valore
che si ottiene confrontando l’espressione di un antigene con una curva di riferimento costruita con rapporti noti tra molecole di antigene/valore di fluorescenza
ESPRESSIONE DI UN ANTIGENE
Ag aberranti: es. blasti di LAL della linea B con Ag T o mieloidi; blasti di LMA con Ag T o B
Espressione Ag asincrona: es. CD19/CD34/TdT/cyt. in LAL B, CD34/CD56 o CD15 in LAM
Espressione Ag “ectopica”: es. blasti di LAL-T a livello midollare, blasti TdT+ a livello extra-midollare
Diversa entità di espressione Ag: es CD10, CD19, TdT in LAL B
Assetti immunofenotipici leucemia-associati
Studio citofluorimetrico della MMRCOSA si va a cercare?
Metodi di analisi della Malattia Minima residua nelle Leucemie AcuteMetodi di analisi della Malattia Minima residua nelle Leucemie Acute
Con le tecniche convenzionali di citomorfologia è possibile identificare l'1-5% di cellule leucemiche in una popolazione di cellule normali
La sensibilità aumenta in modo significativo (fino a 10-4) quando vengono applicate tecniche immunologiche utilizzando anticorpi diretti contro antigeni di differenziazione delle serie linfoide ed enzimi selettivamente espressi negli stadi più precoci dell'ontogenesi
Grazie alla combinazione di tre metodologie (biologia molecolare, cariotipo, FCM) tutti i pazienti possono essere stratificati in più gruppi di rischio appropriato per la ripartizione terapia basata sul rischio
Misura della fluorescenza: utilità
Le cellule possono essere identificate grazie alle loro molecole di superficie e relativo specifico marker (CD, “cluster di differenziazione”)
Anticorpi monoclonali per specifici antigeni CD possono essere utilizzati per identificare il tipo di cellula
L’anticorpo monoclonale può essere coniugato con un Fluorocromo (FITC, PE, Tandem ECD, PC5………) e si può eseguire un test di immunofluorescenza diretta
STEM CELLSTEM CELL
CD117HLA-DRCD90CD38
CD34+Lymphoid progenitorLymphoid progenitor
CD34+
CD117HLA-DRCD90TdTCD38
CD117HLA-DRCDw123AC133CD33CD38
Myeloid progenitorMyeloid progenitor
CFU-GM CD33
CD13
Myeloblast
CD13CD33CD15
BFU-E/CFU-ECD36CD71Gli-A
CFU-MK
CD61CD41CD42a
CD34+
CD34+ CD34-
CD34-
CD34-
CD14CD11b
MPO
103
102
101
NeutrofiliMetamielocitiMielocitiPromielocitiMieloblasti
CD34
HLA-DR CD117
CD13
CD33
CD11b
CD64
CD65
CD54
CD10
CD35
CD13
Modificazioni fenotipiche durante la normale differenziazione neutrofila
MPO
CD15
CD16
SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE
la granulopoiesi
SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE
la monocitopiesi
I II III IV
Myelo/monoblast
CD34CD117HLA-DRCD13++CD33++
Promyelocyte
CD117CD13++CD33++CD15
Myelocyte
CD13 dimCD13 dimCD15CD11b*
Metamyelocyte Band cell
CD13CD33 dimCD15CD11bCD16*
CD34/CD117/CD45/CD13.33
CD15/CD11b/CD45/CD33
V
Neutrophil
CD13++CD33CD15CD11b++CD16++CD45**
CD16/CD13/CD45/CD11b
Maturazione mieloide
CD16
CD11b
CD16/CD11b/CD45/CD34
Adherence to
Fibrinogen,
Chemotaxis…
Neutrofilo
Maturazione mieloide
Maturazione mieloide
STEM CELLSTEM CELL
CD117HLA-DRCD90CD38
CD34+Lymphoid progenitorLymphoid progenitor
CD19CD10CD22cCD79aTdTCD38sCD22CD24
B-progenitor
B lymphociteCD19
CD20CD22sCD79bFMC-7CD38sIgMIg kappaIg lambda
Cortical thymocytecCD3
CD1aCD2CD5CD7CD4 CD8CD38
T lymphocitesCD3CD7CD2CD5CD4CD8TCR a/bTCR g/d
CD34+
CD34+/- CD34-
CD34- CD34-
CD117HLA-DRCD90TdTCD38
CD117HLA-DRCDw123AC133CD33CD38
Myeloid progenitorMyeloid progenitor
CFU-GM CD33
CD13
Myeloblast
CD13CD33CD15
BFU-E/CFU-ECD36CD71Gli-A
CFU-MK
CD61CD41CD42a
CD34+
CD34+ CD34-
CD34-
CD34-
CD14CD11b
cCD79a
MPO
CD34CD34 pos/CD45 pos =0.58%Gate Totale
0 256 512 768 1024
Capraro R. MO 13/9/04.001FSC-Height ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Capraro R. MO 13/9/04.001CD45 Fitc ->
Gate Totale
0 256 512 768 1024
Lattanzi conc finale .001FSC-Height ->
CD34 pos/CD45 pos =0.7%
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Lattanzi conc finale .001CD45 FITC ->
Midollo donatore sano
Aferesi donatore sano
0 256 512 768 1024
SCO 04B/1812.001FSC-Height ->
Gate Totale
10 10 10 10 100 1 2 3 4
SCO 04B/1812.001CD45 FITC ->
CD34 pos/CD45 pos =0.3%
Sangue cordone ombelicale