Immunoistochimica
Automatizzazione all’ICP
Lara Lunghi Etienne
Programma
� Elenco processi automatizzati� Analisi dei vantaggi e degli svantaggi
dell’automatizzazione
Processi automatizzati
� Sparaffinatura e idratazione dei tessuti� Smascheramento degli antigeni� Visualizzazione� Controcolorazione
• Postazioni indipendenti
• Incubazioni a differentitemperature
• Data base
• Protocolli e reagentiidentificati tramite bar code
Dati importanti:
Benchmark XT
Sparaffinatura e idratazione
� Automatico: incubazione direttamentenell’apparecchio 15’ a 75°C con EZ Prepsolution.
� Manuale: incubazione nella stufa a 60°C per 1 ora, 2 x 5’ in xilene, 2 x 5’ in alcool 100%, 5’ in alcool 95%, 5’ in alcool 70%, 5’ in acqua.
La fissazione dei tessuti: un problema per l’immunoistochimica
� I fissativi possono bloccare, modificare, mascherare o distruggere gli epitopi.
� La formalina tamponata al 10 % è uno dei fissativi piùutilizzati perché non preclude nessun esame nell’ambito istologico. Purtroppo tende a mascherare gli epitopi.
� Un tessuto troppo fissato o un tessuto nel quale i processi autolitici hanno preceduto una fissazione corretta, sono difficili da correggere.
� Il mantenimento della struttura dell’antigene è una fase critica per l’immunoistochimica.
Smascheramento degli antigeni
� La prima fase importante di un’analisi di immunoistochimica su un materiale fissato in formalina è quella di “correggere” le alterazioni degli epitopi causati dalla fissazione. Questo passaggio è cruciale per la riuscita della reazione immunologia.
� Esistono due metodi per smascherare gli antigeni:� Digestione enzimatica� Trattamento termico
Digestione enzimatica
Trattamento termico
Visualizzazione
Sistemi di visualizzazione- Le reazioni immunoistochimiche mirano a rendere visibile la presenza di antigeni nei tessuti.- Sono utilizzate molecole che producono un segnalevisibile per individuare le reazioni antigene-anticorpo.- Le molecole maggiormente utilizzate sono florescenti o enzimatiche.- Queste molecole possono essere attaccateall’anticorpo primario tramite un metodo diretto o un metodo indiretto.
Metodo indiretto avidina-biotina
- Sono utilizzate due proteine che hanno una fortissima affinità l’una con l’altra: l’avidina e la biotina.
- E’ utilizzato un anticorpo secondario per agganciare l’anticorpo primario al resto delle molecole utilizzate per il rilevamento.
- E’ sfruttata la capacità dell’avidina e della biotina di legarsi a più molecole enzimatiche (segnale amplificato).
Metodo indiretto
Patient tissue
Primary antibody
Biotin
Secondary Antibody
enzyme
Avidin
H2O2 DAB
Incubazione dell’anticorpo
Amplificazione
Bloccante delle biotine endogene
Controcolorazione
Vantaggi automatizzazione
� Tempistiche 7-12 ore �3,5 ore (2 volte al giorno)
� > Riproducibilità dei risultati �>standardizzazione
� Tutti i processi sono automatizzati in un solo apparecchio � < impiego di risorse umane
� > Controllo sui reagenti utilizzati (ISO/IEC 17025 e ISO 15189
Svantaggi automatizzazione
� Reagenti, tempi di incubazione e temperature limitati.
� Standardizzazione dei protocolli: difficoltà nel correggere e nel trattare i casi limite, i casi speciali!
� Costi molto alti!� Organizzazione del lavoro: orari da rispettare.
Grazie per l’attenzione