Immunologia e Immunopatologia
IMMUNOLOGIA DIAGNOSTICA
Tecniche Immunologiche
• La maggior parte delle tecniche di laboratorio biomedico si basano sull’utilizzo degli anticorpi.
• Gli anticorpi sono utilizzati come reagenti ad elevata specificità.
• Gli anticorpi possono essere prodotti per riconoscere ogni tipo di molecola biologica o chimica:
- Proteine - Acidi nucleici - Lipidi - Polisaccaridi - Sostanze chimiche
Anticorpi Monoclonali e Policlonali
Ogni immunoglobulina riconosce un determinante antigenico diverso (epitopo)
Ogni antigene possiede numerosi epitopi.
1 clone = 1 epitopo = 1 antigene 1 antigene = n epitopi = n cloni
Reazioni Antigene (Ag)/Anticorpo (Ab)
• Modello Chiave-Serratura
• Legami non covalenti: - Legami Idrogeno - Legami Elettrostatici - Legami Idrofobici
• Molti legami tra Ag e Ab
• Processo Reversibile
Interazione Lisozima/Anti-Lisozima
H L
Ag
Affinità = Somma delle forze attrattive e repulsive
Ab
Ag
Alta Affinità
Ab
Ag
Bassa Affinità
Affinità Anticorpale • La forza della reazione tra un singolo determinante
antigenico ed un singolo sito di legame dell’anticorpo
Reazione Incrociata (Cross- Reazione)
• La capacità di un singolo anticorpo di reagire contro più determinanti antigenici.
• La capacità di una popolazione di anticorpi di reagire contro piu’ antigeni.
Anti-A Ab
Ag A
Anti-A Ab
Ag B
Epitopo condiviso
Anti-A Ab
Ag C
Epitopo simile
Cross-Reazioni
Specificità dell’anticorpo
La capacità per un singolo anticorpo di reagire contro un solo determinante antigenico.
La capacità per una popolazione di anticorpi di reagire contro un solo antigene.
Applicazioni degli anticorpi monoclonali
• Gli anticorpi monoclonali sono attualmente utilizzati: - Nei laboratori di ricerca biologica e biomedica - Nei laboratori di diagnostica - Nelle terapie mediche
• Gli anticorpi monoclonali permettono di:
- Determinare la presenza di un antigene (Test qualitativo)
- Misurare la quantità di un antigene (Test quantitativo)
- Purificare l’antigene desiderato (Molecole o Cellule Intere)
Concetto di antigene nelle applicazioni pratiche
Dal punto di vista biologico l’antigene è sempre una molecola riconosciuta da un anticorpo, ma diventa utile per individuare/quantificare cellule, batteri, virus e molte sostanze presenti nel sangue:
Marker CD = Linfociti e altre cellule del sangue
Ag batterici e virali = 1. Immunodiagnosi per infezioni 2. Titolo anticorpale
Marker tumorali = Diagnostica per immagini
Proteine del sangue = Diagnostica di laboratorio clinico
Test Basati sulle Reazioni Ag/Ab
Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab permettono di misurare piccole quantità degli immunocomplessi.
Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab possono essere utilizzati per misurare l’antigene o l’anticorpo presenti nel campione.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA):
Saggio di Immunoassorbimento Legato ad Enzima
Principio dell’ELISA • 1 componente (Ag o Ab) immobilizzato su piastra
• 1 componente (Ag/ Ab / Anti-Ig) marcato con enzima
• L’enzima (perossidasi) reagisce con il substrato
• La reazione produce una colorazione misurabile
Piastra ELISA Ag
Ab specifico
Anti-Ig marcato
Substrato incolore
Substrato dopo la reazione
Enzima
ELISA Diretto per Ag
• Rilevamento dell’Ag 1. Immobilizare l’Ab 2. Incubare con il campione
da misurare 3. Aggiungere l’Ab marcato
con un enzima 4. La quantita’ di Ab legato
e’ proporzionale alla quantita’ di Ag nel campione del paziente.
Test Quantitativo
Fase Solida
Ag Immobilizato
Ag nel campione del paziente
Ab marcato
ELISA Diretto per Ab
• Rilevamento dell’Ab 1. Immobilizare l’Ag 2. Incubare con il campione
da misurare 3. Aggiungere l’anti-Ig
marcato con un enzima 4. La quantita’ di anti-Ig
legato e’ proporzionale alla quantita’ di Ab nel campione del paziente.
Test Quantitativo
Fase Solida
Ag Immobilizato
Ab nel campione del paziente
Anti-Ig marcato
Immunofluorescenzae
Citofluorimetria
Immunofluorescenza • Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag?
Antigeni sulla membrana citoplasmatica:
-direttamente accessibili
Antigeni intracellulari:
-inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione
Immunofluorescenza
• Preparazione dei campioni → Marcatura Ab
Traccianti Fluorescenti:
-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag
- Da 1 a 4 traccianti diversi per un campione
Fluorescenza e Fluorocromi
• I fluorocromi sono molecole utilizzate come coloranti fluorescenti:
-Assorbono l’energia della luce → Eccitazione -Emettono fluorescenza nel visibile → Emissione
Fluorocromo Eccitazione (nm) Emissione (nm)
Fluoresceina (FITC) 495 519
Rodammina 550 573
Ficoeritrina (PE) 565 578
Texas Red 589 615
Immunofluorescenza
• Diretta – L’anticorpo che riconosce l’antigene e’ marcato con un fluorocromo (molecola fluorescente)
Ag
Ab marcato con fluorocromo
Sezione di un tessuto
Immunofluorescenza
Indiretta L’Ab che riconosce l’Ag non
e’ marcato Viene utilizzato un anti-Ig
marcato con un fluorocromo per rilevare il legame del primo Ab.
Test Qualitativo/Semi-Quantitativo
Ag
Anti-Ig marcato con fluorocromo
Sezione di un tessuto
Ab non marcato
Immunofluorescenza
Area T (Paracorticale)
Area B (Follicoli)
Linfociti T e B all’interno di un linfonodo
Immunofluorescenza
• Analisi di Tessuti • Analisi di Singole Cellule
Citofluorimetria
• Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag?
Antigeni sulla membrana citoplasmatica:
-direttamente accessibili
Antigeni intracellulari:
-inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione
Citofluorimetria
• Preparazione dei campioni → Marcatura Ab
Traccianti Fluorescenti:
-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag
- Da 1 a 16 traccianti diversi per un campione
Citofluorimetria • La sospensione di cellule da analizzare viene marcata
con una molecola fluorescente. • La marcatura avviene con Fluorescenza Diretta o
Indiretta. • Il campione di cellule viene analizzato con un
citofluorimetro (FACS)
Citofluorimetria
• Analisi del campione al FACS
Intensità Fluorescenza Verde
Num
ero
di C
ellu
le
Cellule non marcate
Cellule fluorescenti
Istogramma con 1 Parametro
Intensità Fluorescenza Rossa
Inte
nsità
Flu
ores
cenz
a Ve
rde
Istogramma con 2 Parametri
1 2
3 4
Citofluorimetria
• Esempio: Analisi cellule da sangue periferico
- Miscela di linfociti, monociti e granulociti
- Colorazione con Ab monoclonali:
1) Anti-CD14 (specifico per monociti) marcato con ficoeritrina (PE)
2) Anti-CD45 (presente su tutti i leucociti: linfociti>monociti>granulociti) marcato con fluoresceina (FITC)
Citofluorimetria • Analisi cellule da sangue periferico (con 1 parametro)
CD14=monociti
Intensita’ Fluorescenza
CD14 PE
CD45=linfociti>monociti>granulociti (1) (2) (3)
CD45 FITC
1 2
3
Citofluorimetria
• Analisi cellule da sangue periferico (con 2 parametri)
CD45 FITC
CD
14 P
E
CD14=monociti CD45=linfociti>monociti>granulociti
R1=monociti (CD14+) R2=linfociti (CD45>monociti) R3=granulociti (CD45<monociti)