Considerazioni sul dosaggio dello iodio proteico del samgue mediante digestione acida e della tiroxina mediante colonne

di resina a ecamhio ionico

L. SPANDRIO e A. ALBERTINI

Ia~ i.tulo di BioU>gia ~ Biochimico degli Sptdali Civili di Brt.cio

Il dosaggio dello iodio ormonale presente nel siero è soggetto non di rado a contaminazione derivante dall'impiego abbastanza esteso di prepa­r ati contenenti iodio o com e farmaci o come materiale per uso radiologico.

Sotto questo aspetto abbiamo ritenuto utile procedere ad un confronto fra due metodi: il primo è basato sul dosaggio dello iodio proteico (PBI) mediante digestione acida e successivo dosaggio con il reattivo cerico-arse­nioso (1), il secondo metodo è basato sul dosaggio della tiroxina (T,) dopo liberazione con alcal~ e separazione delle sostanze contaminanti presenti nel campione mediante passaggio su resina a scambio ionico, ossidazione con acqua di bromo e analisi con il reattivo cerico-arsenioso fl· 3). Come ma­teriali di controllo sono stati utilizzati sieri del commercio (Hyland) a conte­nuto noto di T,.

La determinazione del PBI è stata eseguita in condizioni controllate di temperatura e di t empi di digest ione (4); per la determinazione del T, è stato fatto uso di un Kit commerciale (Bio-Rad-Laboratories) che fornisce tutto il materiale occorrente, compresa la resina (Dowex l, X -2, 50-100 mesh). Seguendo quest'ultimo metodo, . dopo il passaggio del campione sulla r esina, si eluisce la tiroxina insieme alla triiodotironina con due por­zioni successive di 3 mi di acido acetico al 50% . Lo iodio inorganico viene invece trattenuto dalla resina. Nei campioni che non presentano contami­nazione la quantità di iodio ormonale presente nel primo eluato ammonta con buona approssimazione all'SO% dell'eluato totale, mentre nel secondo eluato si ha normalmente il rimanente 20% . Gli eluati, acidificati e trat­tati con acqua di bromo, sono sottopos ti direttamente alla reazione colorimetrica cerico-arseniosa (').

L a riproducibilità del m etodo p er il dosaggio del T, è risultata buona e generalmente superiore, nelle mani di personale esperto, a quella che si

A ma. I st. Su p c,-. San led (1971) 7, 428-480

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SPANDRIO E AI.BERTI NI 429

ottiene nel dosaggio del PBI: il valore medio del coefficiente di variazione ottenuto con 8 sieri differenti è infatti 4,6 nel primo caso e 7,9 nel secondo.

Il dosaggio del T 4, eseguito in confronto con il PBI, su campioni di siero con valori di PBI superiori a 20 pg per 100 ml e su sieri con v alori di PBI che non corrispondevano alla reale situazione clinica ha consentito di stabi­lire in essi la presenza di contaminazione. La quantità di iodio presente nel secondo eluato rispetto al primo va da un minimo di 56% nel siero n. 12 ad un massimo di 97% nel siero n. 2 (Tab. l) ed è quindi nettamente superiore al 20% del totale previsto dal m etodo in assenza di contaminazione.

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l l

TABELLA l

Controllo della contaminazione dei campioni di siero mediante dosaggiC} della tiroxina

0oMS&iO d•l T,

Siuo n. Oo .. ~ll;iO d•l PBI ( I,J'g/ lOO ml • ioro)

(l, J'g/100 mi •itro)

l 10 duato 20 ~lualo

l

l > 20 19 ,7 16,7

2 > 20 18, 5 18,0

3 > 20 15,5 12,9

4 > 20 17 . -~ 16,8

5 > 20 18,6 15,4

6 ..,. 20 15, 2 13,6

7 ..,. 20 13,9 11 ,8

8 ..,. 20 15,3 10,2

9 ..,. 20 17,3 15,4

lO ..,. 20 14 , 2 10,2

11 ..,. 20 15, 1 9,4

12 ..,. 20 18, 1 10, 1 - - --- --

Sulla base di questi risultati si può concluder e che n el dosaggio del T4

l ' incidenza della contaminazione è molto ridotta rispetto al dosaggio del PBI; il potere di separazione della resina usata nel Kit risente però della quantità delle sostanze estranee interferenti come è dimostrato dal fatto che tutti i sieri da noi esaminati, con valori di PBI superiori a 20 p g %, si dimostrarono contaminati alla prova di dosaggio del T4 su r esina e pertanto il m etodo non è sempre in grado di a ssicurare l' eliminazione COD,lpleta della contaminazione; quando questa è quantitativamente rilevante, consente solo di segn alarne la presenza.

-t nn. I~t. Su-per. Sanit~ (1971 ) 7, 428-430

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430 rJI\II"NICAZIUX I

Il numero piuttosto limitato di determinazioni da noi eseguite con il « T4 test» non ci consente <li stabilire con molta esattezza r ambito di varia­zioni dei valori normali che, in prima approssimazione, sembrano esst>re compresi tra 2-6 Wl. di iodio p l.'r 100 mi.

Abbiamo infin e valutal.O rlW il t empo necessario per r CbCCUZiun(' di poche analisi (5-l O campioni) di T4 ì: limitato e genenùmcntc inferiore a quello occorrente prr un num<·ro analogo di dosaggi di PBl ; se• perÌ> il nume­ro delle analisi aumenta al di sopra di 10-15 la situazione s i inverte.

I valori di iodio ottenut i con il metodo del T,1 sono inft>riori a quelli eh(· si hanno con il metodo del PBI, anche per sieri non contaminati; il rapporto medio tra i valori Otlt~nuti p er 8 campioni con un contenuto di PBI compre­so tra 2,6 c 10,2 ,ug, in ùue seri l' parallele di analisi, è risultato infa l ti di 76,6 ± 3,4.

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Problemi tecnici del dosaggio radioimmunologico dell'angiotensina II

V. RENZI~I e G. h!UIESAN

I~tiluto di Semewtica Medica deli"Univer~ità di Puugia

Riteniamo interessante riferire alcune osservazioni metodologiche sul dosaggio radioimmunologico dell'angiotensina Il (1•4), da noi applicato a diverse condizioni cliniche e sperimentali. Uno dei principali fattori che determinano la sensibilità di un dosaggio radioimmunologico è rappresentato, come è noto, dall' « avidità» con cui l'anticorpo lega la sostanza in esame. Nel metodo da noi usato l'anticorpo di questo ormone viene ottenuto impie­gando angiotensina II non legata mediante legami covalenti ad altre mole­cole di supporto (6). Dato che il basso peso molecolare dell'angiotensina II e la sua facile aggredibilità da parte delle « angiotensinasi » plasmatiche e tissutali rende nullo il potere antigenico del peptide, l'angiotensina II viene fatta adsorbire su microparticelle di carbone, che sono in grado di proteggerla dalle« angiotcnsinasi»; le particelle di carbone, avendo circa 30 mp. di dia­metro vengono facilmente inglobate dalle cellule immunocompetenti. Sotto tale forma l'angiotensina II, in associazione ad un agente disperdente ed adiuvante, viene iniettata nella milza, n ei linfonodi (cervicali, inguinali e poplitei) e n el peritoneo di coniglio.

In un tempo relativamente breve (da uno a tre mesi) e pressochè costan­temente, l'animale sviluppa anticorpi all'angiotensina II, frequen temente a titolo assai elevato. Gli anticorpi, così ottenuti, dimostrano tma affinità note­volissima per l'angiotensina II sia in vitro che in vivo. La formazione del complesso antigene-anticorpo è immediata, come risulta in vivo dalla scom­parsa dell'azione ipertensiva di altissime dosi di angiotensina II o renina omologa, somministrate endovena a animali immunizzati. Tale rilevante caratteristica ci ha permesso di impiegare gli anticorpi stessi come agenti bloccanti dell'angiotensina II in studi sulla ipertensione sperimentale (6• 7).

Un altro importante accorgimento è rappresentato dall'estrazione pre­liminare dell'angiotensina II dal plasma. Ciò consente una notevole concen­trazione dell'angiotensina Il, con proporzionale aumento della srnsibilità

A nn. lat. Super. Sttnità (1971 ) 7, 4a l-435

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432 OHI O i!CAZ I0:'\1

del m etodo di dosaggio. garantisce per la r eazione immunologica l'assenza di « angiotcnsinasi » (che potrebbero distruggere il peptide durantr l'incu­bazione), ed offre inoltre la possibilità di dosare l'angiotensina II del cam­pione nello stesso mezzo impiegato per la curv a di riferimento. Nella Fig. l vien e riportato un csrmpio di dosaggio diretto in plasma ili angioteusina II,

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Fig. l. - Esempio di dosaggio radioimmunologico dell'angiotensina 11 nel plasma, con o senza estrazione m ediante t erra di follone {Fuller'8 earlh). · - - • Valinn6 Angiotensina IJ. •---- • Campione senza ioni Ca. o- - - -o Clllllpione cou ioni Cu.

che forni sce erroneamente un ribultato assai elevato. Un dosaggio contem­poraneo dello stesso campione, est'gwto dopo estrazione mt·diaute t erra di follone, dà un risultato molto più La!'sO; tale discordanza s i s piega con il fatto che il plasma usato per la determinazion e diretta conteneva acido etilcn­diamminotetracetico, il quale. bloccando gli ioni calcio provoca in maniera aspecifica la scissione del lcgamt' tra l'anticorpo e l'angiotens ina II marcata.

I dealmente , il massimo grado di specificità !'i ot tit•ne quando la sostan7.a che deve essere dosata è strutturalmente identica: l) a quella impiegata per la curva di riferimento, 2) a quella man·ata impiegata come trarciautc , 3) a quella u sata per la produzione di antis iero. ln pratica. tali condizioni ideali vengono raramente raggiunte in uu dosaggio radioimmw1ologico, in considerazione del fatto chr la so~tanza da dosare puù pre:.entare. comf· accade appunto per l'angiot em;ina IL delle modificazioui strutturali a seconda della specie studiata.

.~ 11 11 . l tt . Stt !H r .. \ n ni t i 1971l 7, t 3

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Spesso si devono impiegare s is temi non perfettamente omogenei, i quali, tuttavia, risultano specifici qualora venga rispettata, come criterio minimo di omogeneit~1, l ' identità immunologica tra la sostanza impiegata come s tandard e quella da dosare. È un problema che s i incontra ogn i volta che s i utili~zi un nuovo anticorpo, o (!Uando si voglia applicare un dosaggio radioimmunologico, allestito per lo studio di una determinata specie, ad un'altra specie.

In casi del genere, occor re innanzitutto conoscere la struttura chimica tlell'angiotensina II dell'animale in esame o, pitt semplicemente, le sue cara tteris tiche immunologiche.

La determinazione del tipo immunologico di angiotensina II \'iene effettuata utilizzando diversi anticorpi precedentem ente tipizzati, i quali, cioè, sono in grado di fornire curve di riferimento ca ratteristiche per i vari tipi di angiotensina II.

Ad esempio (Fig. 2) , se l' anticorpo t: in grado di distinguere tra di loro tlue fra i piì:t comuni tipi di angiotcnsina II, quali l'ungiotensina con l' am·

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A I\IT ICOAPO .Hitl 0 3 10) ·-

Fig. 2. - Curve tli riferimento ottenute con valina-5-angiotett>inamrnidc II, isoleucina-5· augiolcn•ina II ed angiotcnoiua di coniglio, impit!gando un anticorpo capace di « di ~tingucre ».

I .oleucina:; .\ngiolensina IJ. >- - o Vlllina" .\ngiolcnsina H .

minoacido valiua in p o s tZIOIH: 5 t' (}Uella con l'amminoacido i:-oll'ueina nella -.; te~ :-a posizione. impirgando come riferimPnto Ya lina-.3-an giotcn >. ina TI (ad esempio rr pt·rtens ina CIB .\.) :: i Ottl' rrehbero ri :-ull at i i llt':-atti , s ia nell' uomo 1·he nel eoniglio. m eni r f' , per ottenere ri,.uhali •·satti, :- i duvrebb1: utilizzare <·ome ,.: tandanl isolcuf' ina-5 angiotcns ina li ; la scarsa pendenza della eurva

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43~ CO)! U:\JCAZIU.'\1

ottenut a con isoleucin a-5-angiotensina n comporterebbe però una bassa sen ihilit~\ di tale istema.

Sotto questo aspetto risulterebbe pitt conveni ente impiegare un altro anticorpo, che pur essendo stato ottenu to nella st essa maniera del prece­dente, cio(• valina-5-angiotens ina II. non sia in grado di di1o tinguerc t ra le d ue for me c consenta di impiegar e valina-S-angiotensiua come stan<lar cl e dosare indifl"ercntcmen tf• t• con atcuratczza divers i t ipi eli angiolcnsina H (Fig. 3).

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ANT ICORPO VI (13 10)

1 90

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tOO »> &40 1tl0 2t60

Fig. 3. - Curve d i rifcrùuento ottenute cou valina-5-aup;iotensiuanuuide l l e i,olcuciua· 5-angiotensina J l , impiegando un nuticorpo che nou « diotinguc». • --• Isoleucina$ Angiotcnsina I l. o-- --o Vnlina5 Augiotensina Il.

Trattando della sp ecificità, va sempre tenuta presente anche la p ossibi­Ji tà d i r eazioni crociate fra l' anticorpo c sostanze strutturalm ente a ffini alla sostanza in esame, solitamen te precursori o metaboliti; il mancato rico­noscimento di tali sostanze ha parzialmente invalidato la specificità d i alcuni radiodosaggi. Nel ca so dcll'angiotcnsina Il, il cui compor tamento m etabolico è abbastanza n oto, si p uò dire che l' interferenza del precursor i' immediato dell' angiotensina II , l 'angiotensina 11 può essere r itenuta tra ­scurabile (dell'ordine dell'l %), n elle condizioni in cui viene effettuato il dosaggio. Meno nota è l'in t er ferenza dci metabolit i, alcuni dei quali ven­gono facilmente legati dall ' anticorpo. Un cont rollo della specificità del dosaggio in tale senso può, in cer ti casi, esser e effettuato mediante confronto con dosaggio biologico, n el caso che i m etaboliti siano dei frammenti biologi­

camente inerti.

.~ '"" lst. Suv.·r. Sani Id (1971) 7, 431- 435

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La sens ibilità del dosaggio radioimmunologico dipende largamente <lalla disponibilità di angiotenl'ina TI marcata, dj alta attività specifica e non alterata.

A tale scopo - secondo la nostra esperienza - è cnt1co il t empo di durata della iodinazione dell'ormone: tempi superiori a 4-5 sec hanno costan­temente comportato un danno assai elevato del peptide.

r n pari modo, a ltrettanto critica risulta la procedura <li separazione ddl'angiotensina II libera da <JilClla legata all'anticorpo. T m piegando a tale scopo carbone rives tito di des trano, devono esser e assolutamente rispettate le seguenti condizioni: l) aggiunta simultanea <lcll'adsorbente a lutti i campioni in esame; 2) standardizzazione della temperatura t toC); 3) mescola­mento adeguato ed tmiforme del carbone per un tempo ben definito (5 min); L~) separazione del sopranatante in un t empo non superiore a 15 min .

Sulla base delle numerose considerazioni sopra esposte, riteniamo che il dosaggio radioimmunologico dell'angiotcnsina n sia di difficile esecuzione al di fuori di laboratori s pecializzati.

Ringraziamo il Prof. W. S. P eart del St. \iary's Hospi tal di Londra <'rl il Dr. G. Lubash della Maryland University di Baltimora per a verei consentito di comunicare rlati raccolti presso i loro rispettivi laboratori.

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.l nn. lst. Su per. Sanità (1971) 7, 431-435

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Il dosaggio radioimmunologico in (( fase solida >>

dell'ormone della crescita e della gonadotropina lutein izzante n el plasma umano (*)

G. GIUSTI!U. E. RESCHINI , L. CA ~TALAMESSA e D. MIEDICO

Istituto di Clinica ,Uedica J,.Jr Unit...r.,it<Ì di 1Hiluno

I dosaggi radioimmunologici in « fase solida » bono caratterizzati dallo impiego di anticorpi l ega ti a una sos tanza insolubile; l'antigene, reagendo con l' anticorpo. viene fi ssato dalla fase solida ed in tal modo si evita la n ecessità di usare i procedimenti più o meno lunghi per la separazione del complesso antigene-anticorpo dall 'antigene libero richiesti da altri me· todi (1·6).

Riferiamo alcune note critiche scaturite dalla nostra esperienza con un metodo in « fase solida» per il dosaggio dell'HG H e dell'HLH nel plasma, usando come fase solida tubi di polis tirene (7•8).

n primo problema che si presenta è quello di legare gli anticorpi alla super fi cie della fase solida; sembra trattars i di un legarnr di tipo fisico, in quanto è sufficiente diluire l'antisiero in un tampone alcalino perchè il fenomeno abbia luogo e giunga alla completezza nello spa7.Ìo di aleunc ore (4).

La quantitù di anticorpi che s i lega alla fase solida i· funzione della loro con­centrazione; tuttavia, entro certi Hmiti, la capacità di legare l' antigene marcato è maggiore alle alte diluizioni dell'anti siero (7).

L'antisiero può essere rccuprrato, consrrvato a 40 C, e adoperato più volte senza che per qucst o v<·nga no alL<·ratr l t· caratteristiche del dosaggio; non conviene però conservare l'antisicro piìt di due settimane (spesso abbiamo osservato una notevole diminuzione ddla srnsihilità del dosaggio usando antisieri consen-ati pii't a lungo).

(0

) Simboli utilizzati: HG Il ormone umano della crt~~cila; HLII = gonadotropina lu-leinizzante umana; HCG = çouadolropina corionicu umana; HTSH = ormone lirotropo umano; IIFSH = ormone follicolo·otimolaute umano: :!" l HP- IB1G = preparato standard internazionale 2o di orwone gonadotropo da uriuc di douue iu menopausa .

. 4uu. hl. SuJJc ,. . Su111IÙ i 1971) 7, ~36-13!l

GIUSTI:-IA, RESCH INI. CANT.H.A\I E...."SA F. \IIEDICO 437

Gli anticorpi, una volta fi ssati, non sono spostati dai lavaggi con tam­poni o con acqua, ma possono essere parzialmente rimossi da soluzioni protciche. Per questo motivo è necessario eseguire l e analisi in presenza dello stesso tipo e concentrazione di proteina, s ia per stabilire le curve s tandard che per dosare i campioni. Poichè le curve standard ottenute impiegando siero di cavallo e siero umano privo di HGH sono risultate sovrapponibili (1) , WHtalmente per l'esecuzione delle curve standard è im­piegato siero di cavallo.

Il secondo punto da considerare è quello del legame fra antigene e anticorpo che è funzione della concentrazione di ormone nel m ezzo, secondo una curva che tende all'asintote (7). La sensibilità del dosaggio non varia apprezzabilmente p er concentrazioni di ormone marcato comprese in un intervallo piuttosto ampio (0,5-1,5 ng/ml), e questo permette di impiegare un ormone marcato ad attività specifica relativamente bassa (80-100 p C/pg). La velocità della reazione antigene-anticorpo è funzione della temperatura: a 370 C la reazione di formazione del complesl:iO può essere considerata com­pleta nello spazio di 12-16 ore; la velocità di dissociazione del complesso antigene-anticorpo è invece pii• lenta (7) .

Poichè l'antigene marcato s i danneggia parzialmente durante la con­servazione, conviene di norma eliminare le frazioni danneggiate mediante filtrazione su Sephadex G-1 50.

Nella Fig. l è riportata come esempio la curva standard ottenuta per l'JIGH; i valori dei campioni sconosciuti sono ottenuti per interpolazione. Ogni ptmto della cur va è ottenuto su tripli campioni.

La sensibilità, calcolata tenendo conto della precisione con cui è deter­minato il punto O della curva c della pendenza del primo tratto della curva, ù risultata di 4 mU.I. (20 IRP-HMG)!ml di plasma per lo HLH e 0,5 ng/ml di plasma per lo HGH .

La precisione è s tata calcolata in base alla variabilità dei doppi cam­pioni; essa t! diversa alle diverse concentrazioni. Il coeffi ciente di \'ariazion e è ilcll'ordinc del 30 °~ per valori di HGH inferiori a 2 ng/provetta, e per valori eli HLH inferiori a 20 mU.I.Iprovetta, c dell'ordine del 10-15% per valori di HGH da 2 a lO ng/provetta c per valori di HLH da 20 a 100 mU.I..Iprovctta.

La riprotlucibilità è stata valutata sottoponendo lo stesso plasma a ripetute analisi cd è risultata dello s tesso ordine di grandezza della precisione del dosaggio quando s i usava il medesimo antisiero, men­tre usando antisieri divers i s i rilevava una maggiore dispersione dei tlati.

La !lpecifìcità è stata controllata per i \'ari anttsteri adopera ti. P er l'ormone della crescita s i è constatato che la pendenza delle curve ottenute con diluizioni progressive Ji plasma Ji soggetti acromegalici era la medesima

.1 '"'· l•t. Supa. Sunrtà r1971, 7, 436 4:lU

438 t:O\II " NI~AZIOXI

della curva s tandard (Fig. l ). Inoltre si sono ottenuti \ alori normali di HGH in pazienti con tasso plasmatico elevato di HLH c HFSH (donne in meno­pausa) o di HTSH (ipotiroidci primitivi).

CP~I x 103

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\ • HGH (Wi lhelm• - HS 968 C )

X plasma da un paztenae acromegal i co

t ! : l deviazione standerd

o 2 s • 6 a 1 a a 10

ngKGH

Fi~t. l. - Cun·a staudtl.rd per l" or­mone ùclla crescita. Or­dinata: radioattivit.!l le­gata dall'anticorpo. A­scissa: quantitì. di HGII non utnrcato. l punti sono valori medi di tri­pli campioni. Il tracciante è co~tituito da HGH [1 ~:., 100.000 imp_'nùn. l f' croci rap­presenluno diluizioni vrogressiv!' di pla&ma di un •oggetto unome­galiro.

Per il dosaggio del HLH plasmatico abbiamo impiegato un antJsJero anti-HCG. Il suo impiego è stato possibile perchè tale antisicro presentava reazione crociata completa con H CG, HLH, 20 IRP-HMG (8). La specificità ha potuto essere dimos trata poichè le curve ottenute con diluizioni progres­sive di plasma di soggetti con elevato HLH plasmatico erano parallele alla curva standard; l'eventuale in terferen~a del HFSH nel dosaggio del HLH era di entità assai modesta.

l dosaggi effettuati con questo m etodo si sono già rivelati utili nello svelare le condizioni di abnorme secrezione di ormon e della crescita e di gonadotropina HLH (7·12).

Si t ratta, in conclusione, di un metodo rapido, che presen ta numerosi vantaggi tecnici rispetto ad altri metodi e caratteristiche tali da essere rac­comandato per l' impiego clinico corrente.

.11<11. hr. .Su11cr. Sutlilli 11971) 7, ~3()-4311

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GIUS'fiNA, RESf.HINI, CANTAI.AMESSA F. ~f!EOICO 439

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. 11111. 1• 1. S11per. S1111 Ìtit 11971 \ 7, 136-439

Validità del dosaggio radioimmunologico dell'ormone soma­

totropo in una serie di bambini con << bassa statura >>

per la diagnosi di nanismo ipofisario

* O. LOSTJA. ** B. BOSCHERI '1, •• G. Flì'IOCCHJ. •• F. GIROTTI. **G. \fA:XCUSO, •• L. SARTORI c • (... ROSS I

• lstit~tto S~tpc riorl' di Sanità. Roma •• Istituto di Clinica Pediatricrr drii'Universitiì di Roma

Da quando è stata introdotta la t erapia del nanismo ipo6sario mediante la somministrazione di ormone somatotropo umano (HGH) è risultato par­ticolarmente importante ai fini diagnostici determinare il livello plasma­tico dell' ormone. Il dosaggio dell' HGH consente infatti di identifican· quei casi di narusmo ipofìsario in cui il trattamento può risultare effetti­vamente efficace e, in secondo luogo, di destinare a questi casi soltanto l'utilizzazione dell ' HGH curativo, la cui disponibilità è estremament(• limhata.

L'indagin<' che è oggetto di questa comunicazione c ch e si ì· protratta per circa tre anni, è basata sull'applicazione del metodo radio-immunologico generale per gli ormoni proteici che, come è noto, utilizza la r eazione competitiva fra l'ormone marcato con iodio radioattivo, che si usa com<' co-substrato, e l'ormone non marcato, presente nel siero, con un anticorpo specifico. P er est'guire la det errllinazione, il complesso antigene marcato­anticorpo che si ottiene, deve poi essere separato dall ' antigen e marcato che non si è l egato; tra l e tecniche utilizzabili per la separazione d a noi sp erimentate, elettroforesi, adsorbimento su talco o altro materiale e precipitazione con doppio anticorpo , quest ' ultima ci ha dato i risultati migliori.

È noto che le difficoltà di un dosaggio radioimmunologico in genere con­sistono nel poter disporre di rcattivi di elevata purezza, sia dal punto di vi­sta immunologico che da quello radioimmunologico, ed anche n ello stabi­lirne con buona esattezza il titolo, essendo comprese in limiti abbastanza ristretti le quantità r elative dei reattiYi che devono essere usate.

( tlll. hr. S uJtl'r. Sonirù !1971) 7, 440-444

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UlSTIA, IIOSCHERINI, F INOCCHI, GIRIYTTI, MANCUSO, SARTORI F. IIOSSI 441

La messa a punto del metodo, che iniziabnente ha comportato la fase di marcatura dell'HGH e la preparazione di un anticorpo specifico, ha ri­chiesto attenzioni particolari ed un t empo notevole proprio per trovare queste condizioni ottimali. Successivamente si è reso disponibile il Kit SORIN il cui impiego, ormai abbas tanza diffuso, facilita notevolmente l'uso del dosaggio radioimmunologico. In ogni caso è necessario prendere alcune precauzioni se si vogliono ottenere dati riproducihili. Poichè le sostanze proteiche t endono ad adsorbirai su parecchi materiali, e lo fanno in maniera spiccata sul vetro, è necessario che i contenitori per gli ormoni e gli anti­corpi siano preventivamente siliconati. Occorre inoltre usare per le solu­zioni acqua bidistillata, dato che la presenza di Ca++ blocca i siti attivi dell 'anticorpo, e impiegare soluzioni che contengono siero-albumina, al fine sia di limitare ulteriori perdite p er adsorbimento, sia di aumentare la con· centrazione in proteine delle soluzioni onde r enderle quanto più simili alle soluzioni di siero sulle quali poi dovrà essere effettuato il dosaggio.

Ogni campione è stato analizzato in triplo e per ciascuna serie di anaJisi è stata eseguita una curva di taratura. L'impiego di micropipette dosatrici ha consentito di eseguire in una sola serie fino a 60 campioni di siero.

La precisione dei r isultati ottenuti è notevolmente buona : lo scarto massimo fra i valori dell'analisi di ciascun campione di siero eseguita in triplo non supera mai l'l-2 %, ed è pertanto di gran lunga inferiore alle variazioni significative sotto il profilo biologico.

Abbiamo applicato la metodica radioimmunologica p er il dosaggio dello HGH plasmatico ad un gruppo di 64 bambini venuti alla nostra osservazione per« bassa statura». La determinazione dell' HGH plasmatico è stata effet­tuata prima e dopo stimolo ipoglicemico indotto dalla insulina oppure dopo infusione lenta di arginina. Inoltre sono state studiate, mediante metodiche indirette, le attività tireotropa, corticotropa e somatotropa. La prima è stata saggiata m ediante il dosaggio deJla iodopr otidemia, colesterolemia e captazione dello iodio radioattivo; la seconda mediante il test al metopi­ron e; la terza è s tata studiata indirettamente con il t est di mobilizzazione d egli acidi grassi non esterificati (NEF A) dopo stimolo ipoglicemico e dopo arginina.

Sulla base dei risultati ottenuti mediante il dosaggio radioimmunolo· gico dell' HGH plasmatico, i 64 bambini sono s tati suddivisi in due gruppi di cui uno comprendente 40 bambini con valori di HGH plasmatico superiori a 5 ng/ml c l'altro composto da 24 bambini con livelli plasmatici massimi di HGH inferiori a 5 ng/ml (Fig. 1).

Nel primo gruppo (HGH plasmatico > 5 ng/ml) le varie prove di fun­zionalità ipofisaria e la valutazione clinica erano in accordo con i risultati ottenuti con la m etodica radioimmunologica, consentendo di diagnosticare

.4 nn. 1st. Suver . Sanitd (1971) 7, H G-444

19

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442 COMUNICAZIONI

sindromi nelle quali la bassa s tatura non fosse causata da insufficienza soma­totropa. In questo gruppo sono anche compresi due {ratelli che presenta· vano elevati tassì plasmatìci di HGH sia a digiuno che dopo stimolazione; poichè il test di stimolazione dei NEF A ed i severi ritardi della statura e della matorazione scheletrica indicavano un' insufficienza somat otropa, abbiamo ritenuto questi due bambini affetti da forma familiare di nanismo ipofisario con elevati livelli di HGH plasmatico .

Nel secondo gruppo (HGH plasmatico < 5 ng/ml) le prove di funziona ­lità ipofisaria e l'esame clinico permettevano di individuare 22 nani ipofi-

Fig. l. - Livelli plumatici di H GH nei 64 casi esaminati; a sinistra sono raggruppati i casi con livelli inferiori a S ngfmJ, a de­stra i casi con livelli superiori a S ng/mJ.

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Nella Tab. l sono riportate le caratteristiche cliniche e di laboratorio più importanti dei 24 nani ipofisari (n. 1-22 con bassi livelli e n . 23-24 con alti livelli plasmatici di HGH); da questa tabella risulta che tutti i bambini tranne due (n. 6 e 17) presentavano una statura di almeno 3,5 deviazioni standard inferiore alla media, tutti tranne sei (n. 9, 12, 16, 17, 21 e 22), un'età ossea inferiore al 74 % dell'età cronologica ed in tutti i soggetti la velocità di accrescimento era inferiore o uguale a 4 cm annui.

Una conferma indiretta della diagnosi di nanismo ipofisario si ha nella risposta al trattamento con HGH Raben effettuato in 11 bambini. Infatti aette di essi, trattati per periodi superiori ad un anno, hanno mostrato un aensibile aumento della velocità di accrescimento s taturale annuo; questa

A nn. ltt. Su:ocT. Sonitc1 (1971) 7, «<--44t

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pa~;sava in tutti i casi da valori inferiori a 4 cm/anno prima del trattamento ad almeno 7 cm c fino a oltre 10 cm dopo un anno di trattamento (Fig. 2).

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all' esigenza di individuare, in accordo alle altre prove di laboratorio c ai criteri clinici, tra i bambini con« bassa s tatura», quei soggetti che presen­tano un'insufficienza somatotropa c pertanto possano giovarsi del tratta­mento specifico con ormone somatotropo umnno.

~ nn. !st. SupeT. Sonitò (1971) 7, t4G-U4

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Alcuni aspetti del comportamento dell'ormone somatotropo plasmatico in condizioni basali

F. MASSARA e E. STRUMIA

r~tiiUIO di Clinica Jl1edica Generale e Terapia Medica dell'Univer~ità di Torino

Riportiamo alcuni dati relativi a i livelli plasmatici dell'ormone soma­totropo (HGH), r iscontrati nel ç~rso di varie ricerche sulla fisiopatologia di quest'ormone, che illustrano la necessità di una standardizzazione delle modalità di prelievo e di ripetuti controlli in bianco ogni qual volta si intra­prendano studi sui suoi livelli plasmatici in condizioni basali, o in r isposta a s timoli vari.

I dati si r iferiscono a due gruppi di soggetti normali, uno costituito da 9 volontari ambulatoriali scelti tra il p ersonale medico e di laboratorio della clinica, e l' altro da 9 soggetti osp edalizzati.

Tutti i soggetti, a digiuno da circa 14 ore, tra le ore 8 e 8,30 venivano posti a riposo sdraiati nella sala di sp erimentazione. Dopo 30 mina ciascun soggetto veniva inserito un ago cannula nella vena angolare dr.l gomito e iniziata una perfusione lenta di soluzione fi siologica; dopo ulteriori 15 mi­nuti (tempo O) venivano iniziati i prelievi per la determinazione del'HGH, eseguiti successivamente ogni IO o 20 min.

L'HGH è s tato determinato con metodo radioimmunologico, uti· lizzando HG H marcato con I l25 (Kit C E A- C E N-SORI N) e sepa· rando l'ormone libero da quello legato con la tecnica del doppio anti­corpo (1).

I risultati ottenuti in 7 dei 9 soggetti ambulatoriali, controllati per due ore dal t empo O, hanno mostrato che alcuni di essi presentavano valori ormo­nali r elativamente elevati. Dopo 60 mio (in totale, quindi, dopo 105 rnin di riposo) la somatotropinemia risultava inferiore a 5 ngfml in tutti i casi

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446 COllfONICAZIONI

tranne uno: in quest 'ultimo, che presentava tm valore pressochè indosahilt• al t empo O e uno spiccato incremento (oltre 20 n g/ml) dopo 40 e 60 min. i valori perman rvano assai alt i anche nel corso della seconùa ora.

La sperimentazione sul comportamento dell 'H GH dal tempo O a 60 ruin è stata ripetut a p er 3-4 volte in un lasso di t empo di 20 giorni n ei 9 sog·

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Fig. l. - Comportamento dell'ormone somatotropo plasmatico in 9 soggetti amlmlato· riali durante perfusione di soluzione fisiologica in giorni diver;,i. l numeri indi· cano l'ordine di esecuzione dei t est.

getti ambulatoriali. I risultati h anno messo in evidcn:~;a (Fig. l) una rela tiva costanza, in ciascun soggetto, del comportamento dell 'HGH. Gli elevati livelli dell'ormone non sembrerebbero dovuti allo stress psicologico, imputa· bile alla eventuale apprensione per la prova cui il soggetto deve essere sotto· posto, non esistendo una correlazione tra livelli ormonali e ordin e di esecu· zione dei test. In particolar e il soggetto P. A. , (l'ultimo nella figura) che non era particolarmente emotivo, presenta il massimo increment o dei livt>lli ormonali durante il test eseguito per ultimo.

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MASSARA E STRUMJA 447

La Fig. 2 illustra il comportamento dell'HGH nei 9 soggetti ospedaliz­zati. Al tempo O, in tutte le determinazioni meno una, (soggetto G.R.) i livelli ormonali risultavano inferiori a 5 ng/ml; anche in alcuni soggetti (R.L. e B. L.) di questo gruppo si riscontrava un successivo importante incremento apparentemente spontaneo dei tassi ormonali.

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Fig. 2. - Comportamento dell'ormone somatotropo plasmatieo in 9 pazienti ospedaliz· znti, durante perfusione di soluzione lìsoliogica in giorni diversi.

Come si vede i livelli dcll'HGH plasmatico al tempo O sono risultati spesso più elevati nel gruppo dei soggetti ambulatoriali che in quello degli ospedalizzati.

È noto che la secrezione di HGH può esser e stimolata dal digiuno, dagli !'tress fisici c psichici, dall'esercizio muscolare (2). ll gruppo dei soggetti ambulatoriali si differenziava dall'altro essenzialmente per il trasferimento dalla propria abitazione all 'ospedale. Sembrerebbe pertanto che anche questa abituale, modesta prestazione sia in grado di provocare un rncre­mcnto della escr ezione di HGH.

Sulla base di questi dati sembra che la condizione ideale per la detcr· minazione deli'HGH in condizioni basali sia l'ospeilalizzazione. Nei pazienti

~nn. l st. Super. Sanitcl. (1971) 7, H~·HS

448 CO~l U:\ICAZIONJ

ambulatoriali per contro, il prelievo deve essere preceduto da un riposo a letto almeno di 100 min, tenendo conto in ogni caso che la durata dd digiuno non deve superare le 15 ore.

Il rilievo di incrementi apparentemente spontanei dell'HGH in alcuni soggetti nel corso di un pur breve periodo di osservazione, segnalato anche da altri AA. (2-4), non è a tutt 'oggi di facile interpretazione.

Questi dati sottolineano l ' importanza di una standardizzazione delle modalità di prelievo p er la determinazione di livelli basali dell'ormone so­matotropo, c la necessità di ripetuti controlli in bianco ogni qual volta si eseguano studi sulle variazioni secrctivc dell'HGH in risposta a stimoli vari.

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