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METALLI PESANTI:
QUALI METODI ANALITICI?
MARINA CARINI Dipartimento di Scienze Farmaceutiche
Università degli Studi di Milano
Milano, 11 dicembre 2013
Metalli pesanti nei cosmetici
in alcuni casi LA PRESENZA DI TRACCE è un evento
inevitabile in quanto certi ingredienti come i
coloranti/pigmenti possono contenere naturalmente dei
residui di metalli pesanti
ciò che può essere considerato tecnicamente inevitabile
deve soddisfare i requisiti di sicurezza dei prodotti
stabilire parametri certi cui rapportare la sicurezza dei
prodotti in cui venisse riscontrata la presenza di sostanze
vietate valutazione del rischio
…. alcune considerazioni……
Metalli pesanti nei cosmetici
Non esistono limiti normativi !!! misure transitorie
La concentrazione sulla cute ???
La biodisponibilità a livello cutaneo ????
Il destino metabolico nella cute ??????
Reale esposizione (dose, durata e numero di applicazioni) ????
Obiettivo individuare il rischio concreto derivante della
presenza dei metalli nei cosmetici
Percorso di facile attuazione?????????
…. alcune considerazioni……
.... Linee guida
• Attualmente non disponibili, ma auspicabili
• Dovrebbero indicare dei limiti individuati non in quanto
valori assoluti, ma in quanto termini di riferimento ai quali
gli addetti ai lavori dovrebbero rapportarsi in una valutazione
presuntiva della sicurezza dei prodotti medesimi o della
inevitabilità tecnica delle tracce.
PROPOSTA LIMITI ISS
Antimonio 10 ppm Cromo (VI) 1 ppm
Arsenico inorganico 1 ppm Cromo (III) * 5 ppm
Arsenico organico 5 ppm Mercurio 1 ppm
Cadmio 5 ppm Nichel 10 ppm
Cobalto 1 ppm Piombo 20 ppm
* 0.0005% alcuni coloranti a base di Cr(III) sono permessi dalla normativa europea
senza indicazioni di quantitativo massimo è questa soglia tecnicamente raggiungibile?
Limiti fissati dalla
Farmacopea Europea 8.0
Pb: maximum 3.0 ppm
Cd: maximum 1.0 ppm
Hg: maximum 0.1 ppm
Metalli pesanti
HERBAL DRUGS
EP EXTRACTS
Metalli pesanti nei cosmetici
• Non esistono metodiche analitiche convalidate
(preparazione campione e analisi) e condivise per la
misurazione dei diversi metalli nei loro diversi gradi
di ossidazione (es. CrIII vs CrVI).
• In letteratura valori estremamente variabili circa
il contenuto totale dei metalli pesanti nei prodotti
cosmetici, a causa delle basse concentrazioni dei
predetti metalli e per le difficoltà nella loro
determinazione.
Discrepanze nel contenuto di metalli pesanti rilevate
nei prodotti cosmetici sono imputabili
a) all’uso di metodologie analitiche molto diverse
b) all’uso di metodiche di estrazione molto diverse
Metodolgie analitiche
confusione
• definizione dei contenuti totali e delle frazioni
“biodisponibili”
• speciazione degli elementi pesanti
Materiali certificati di riferimento (CRM - Certified Reference Materials)
permetterebbero di controllare i dati ottenuti da differenti
laboratori, di verificare gli standard, di calibrare gli
strumenti e di controllare le procedure di analisi
Sitox informa - Maggio 2013
Consensus document relativo a
Valutazione della sicurezza di residui inevitabili di
metalli presenti come impurezze nei cosmetici
lavoro di un gruppo di esperti in rappresentanza di
• diverse discipline scientifiche e mediche
(tossicologia, dermatologia, chimica analitica)
• diverse competenze (legali, formulative,
tecnologiche)
informazioni e dati necessari
per la valutazione della
sicurezza dei prodotti cosmetici
Metodologie analitiche
determinano il contenuto
totale di metalli pesanti nel
campione direttamente, senza
che l’analisi comporti
modifiche nelle proprietà e
nella sua composizione chimica
NON-DISTRUTTIVE
VANTAGGI SVANTAGGI
No pretrattamento
campione
Limiti di rilevabilità
Strumentazioni
complesse/costose
DISTRUTTIVE
implicano la totale
distruzione delle componenti
inorganiche fino ad ottenere
tutti gli elementi in soluzione
VANTAGGI SVANTAGGI
Pretrattamento
campione
Metodologie
ufficiali
Analisi quantitativa su
ioni in soluzione
• mineralizzazione
• solubilizzazione con acidi
• fusione con alcali forti
Metodologie analitiche
Molte si basano sulla misura dell’assorbimento o
emissione di energia radiante (spettrofotometri)
corrispondente alle transizioni elettroniche degli atomi
eccitati termicamente con una fiamma o attraverso
energia elettrica, o plasma
assorbimento atomico con atomizzazione a fiamma
(FAAS) tra i più diffusi ed utilizzati
assorbimento atomico con fornetto di grafite (GF-AAS)
emissione atomica a plasma accoppiato
induttivamente (ICP-AES)
spettrometria di massa a plasma accoppiato
induttivamente (ICP-MS)
2.2.23. Atomic absorption spectrometry
3 types of sample atomisers:
– Flame technique
– Electrothermal atomisation technique
– Cold vapour (Hg) and hydride technique
(hydride-forming elements such as As, Sb, Bi, Se)
Metodologie Analitiche
EUROPEAN PHARMACOPOEIA 8.0
2.2.57. Inductively coupled plasma-atomic emission
spectrometry (ICP-AES)
2.2.58. Inductively coupled plasma-mass
spectrometry (ICP-MS)
AAS Atomic absorption spectroscopy
Si basa sull’esame dell’assorbimento
di una radiazione elettromagnetica
quando questa passa in un mezzo in
cui il campione sia presente come
atomi o ioni monoatomici
transizione elettronica.
Il sistema opera nel campo spettrale
degli spettrofotometri UV-vis
I livelli energetici atomici sono discreti l'assorbimento di una
radiazione elettromagnetica per eccitazione ad un livello
energetico superiore avviene ad una e una sola frequenza e
lunghezza d'onda.
Ogni atomo ha uno spettro di assorbimento caratteristico
misure quantitative applicando la legge di Lambert-Beer
AES Atomic emission spectroscopy
In base alla lunghezza d’onda emessa è possibile risalire
alla specie incognita e misurando l'intensità dell'emissione
si effettua anche l’analisi quantitativa.
Diverse varianti strumentali in relazione alla sorgente
utilizzata per produrre l'eccitazione degli atomi arco
elettrico, scintilla, fiamma, plasma (ICP)
Sfrutta la somministrazione di
ENERGIA relativamente elevata
per indurre dissociazione in atomi
e loro eccitazione l’energia in
eccesso viene restituita con
emissione di una nuova radiazione
Il sistema che si è rivelato più efficace è per eccitare l’analita consiste nel far ricorso al plasma, un gas formato da ioni ed elettroni, eccitato da un campo magnetico oscillante
Il plasma prodotto è in
grado di raggiungere
temperature comprese
tra 6.000 e 10.000 K
ICP Inductively coupled plasma
ICP-MS inductively coupled plasma
mass spectrometry
Sfrutta l'utilizzo di
• una torcia al plasma ICP per
indurre ionizzazione
• uno spettrometro di massa
per la separazione, rivelazione
e quantizzazione degli ioni prodotti
TECNICA MOLTO SENSIBILE determinazione di diversi
elementi inorganici metallici e nonmetallici presenti in
concentrazioni inferiori a una parte per miliardo (ppb)
TECNICA MOLTO SELETTIVA gli elementi vengono
identificati in base alla massa ionica, e non all’energia
di transizione dell’elettrone di legame
Happ NM et al., J. Cosmet Sci., 60:405-414; 2009
FDA (Center for Food Safety and Applied Nutrition)
Sviluppo e convalida di un metodo di determinazione del
piombo nei lipstick che prevede:
a) digestione acida del campione mediante microonde**
b) analisi ICP-MS
Risultati
a) LOD = 0.04 µg/g (ppm)
b) valore medio nei prodotti analizzati = 1.07 µg/g (ppm)
soddisfacente
** utilizzando solo HNO3 digestione incompleta, con conseguente
diminuzione dei livelli di Pb determinabili RISULTATI OTTIMALI per
addizione di HF (cui segue trattamento con acido borico in eccesso
per neutralizzare HF e solubilizzare i fluoruri insolubili
Concentrations and Potential Health Risks of Metals in Lip Products
Sa Li et al., Environ Health Perspect. 2013; 121(6): 705–710
Objectives: measure of lead and eight other metals in a convenience
sample of 32 lip products used by young Asian women in Oakland,
California, and assessed potential health risks related to estimated
intakes of these metals.
Methods:
a) Hot-block HNO3 digestion (130°C – 15 h)
b) ICP-AES the measurement did not distinguish Cr (VI) from
less toxic forms the percentage of Cr(VI) in the lip products
is therefore unknown
c) estimates of lip product usage rates to determine daily oral
intakes
Environmental Health Sciences Division, School of
Public Health, University of California, Berkeley
Results
Pb detected in 24 products (75%) average concentration of 0.36 ±
0.39 ppm, including one sample with 1.32 ppm
Approximately half (47%) of the samples contained Pb at concentrations higher
than the FDA-recommended maximum level of 0.1 ppm for Pb in candy likely
to be consumed frequently by small children
…. altri riferimenti bibliografici recenti
Al-Saleh I et al. Assessment of lead in cosmetic
products Regul Toxicol Pharmacol 2009;54:105–113
Method: GF-AAS after acid digestion
Pb levels: 0.27–3760 ppm (72 lipsticks)
0.944–1.854 ppm (8 eye shadow)
Gondal MA et al., Spectroscopic detection of health hazardous
contaminants in lipstick using Laser Induced Breakdown Spectroscopy
J Hazard Mater. 2010; 175(1-3):726-32
Pb, Cr, Cd, Zn in 4 different lipstick brands (Saudi Arabia)
Method: ICP-AES after HNO3 digestion
Pb levels: 5.7–9.4 ppm Cr levels: 10.2 – 40.8 ppm
Cd levels: 5.4-10.6 ppm Zn levels: 7.7 – 12.7 ppm
Al-Saleh I, et al., Trace metals in lipsticks. Toxicol Environ Chem.
2011;93:1149–1165 Data not available
…. altri riferimenti bibliografici recenti
Adepoju-Bello AA et al., Evaluation of the concentration of toxic metals
in cosmetic products in Nigeria. Afr J Biotechnol. 2012;11:16360–16364
Details of methods and data not available
Nourmoradi H et al. Assessment of lead and cadmium levels in frequently
used cosmetic products in Iran. J Environ Public Health. 2013 ID 962727.
Pb – Cd in 35 lipsticks and 15 eye shadow
Method: GF-AAS after HNO3 digestion (80°C)
Pb levels: 0.08-5.2 µg/g (lipsticks) – 0.85-6.90 µg/g (eye shadow)
Cd levels: 4.08-60.20 µg/g (lipsticks) - 1.54-55.59 µg/g (eye shadow)
Metodologie analitiche
I metodi ufficiali per la determinazione dei metalli
pesanti nel terreno (matrice sufficientemente
complessa) potrebbero essere presi come
riferimento anche per il settore cosmetico, non
esistendo a tutt’oggi metodi ufficiali in questo
specifico ambito ???
Metodi EPA
(Environmental Protection Agency)
PARAMETRO LOD (ppm) METODO EPA TECNICA ANALITICA
Antimonio 20 7040 FAAS
0.3 7041 GF-AAS
2.1 6010b-c ICP-AES
<0.002 6020 ICP-MS
Arsenico 0.1 7060 e 7062 GF-AAS
0.2 7061 assorbimento atomico e formazione di idruro
3.5 6010b-c ICP-AES
<0.002 6020 ICP-MS
Cadmio 0.5 7130 FAAS
0.01 7131a GF-AAS
0.23 6010b-c ICP-AES
<0.002 6020 ICP-MS
Cobalto 5 7200 FAAS
0.1 7201 GF-AAS
0.47 6010b-c ICP-AES
<0.002 6020 ICP-MS
Limiti di rivelabilità nel terreno valori espressi in mg/kg (ppm) di sostanza secca
PARAMETRO LOD (ppm) METODO EPA TECNICA ANALITICA
Mercurio 0.01
0.02
7472
7471A
Anodic Stripping Voltammetry (ASV) AA a vapori freddi
1.7 6010b-c ICP-AES
< 0.002 6020 ICP-MS
Nichel 4 7520 FAAS
0.1 7521 GF-AAS
1 6010b-c ICP-AES
< 0.002 6020 ICP-MS
Piombo 10 7420 FAAS
0.1 7421 GF-AAS
2.8 6010b-c ICP-AES
< 0.002 6020 ICP-MS
Limiti di rivelabilità nel terreno valori espressi in mg/kg (ppm) di sostanza secca
…il cromo 3 forme stabili
metallico, trivalente Cr(III) ed esavalente Cr(VI)
altamente tossico
cancerogeno (classe I)
… nutriente
essenziale…
non è in grado di
superare in quantità
significative le
membrane cellulari
è trasportato attivamente
all’interno delle cellule attraverso
i canali anionici non specifici,
prevalentemente come ione CrO42-
Meccanismi di tossicità del Cr VI
CrO42-
Cr3+
Cr6+
Cr4+
Cr5+ Ossidazione DNA
Addotti al DNA
CITOSOL NUCLEO
Stress ossidativo
Addotti proteine
Cr3+
Stress ossidativo
Addotti proteine
Ossidazione DNA
DNA-protein
cross links
GSH,
Asc,Cys
CROMO METODI EPA NEL TERRENO
determinazione del cromo totale e del Cromo (VI)
PARAMETRO LOD (ppm) METODO EPA TECNICA ANALITICA
Cromo totale 5 7190 FAAS
0.1 7191 GF-AAS
0.47 6010b-c ICP-AES
<0.002 6020 ICP-MS
Cromo (VI)
DIGESTIONE ALCALINA (EPA 3060a) 0,5 M NaOH / 0,28 M Na2CO3 (pH 11,5) a 90-95°C in presenza di tampone fosfato e Mg2+, per evitare l’ossidazione del Cr(III) a Cr(VI).
Cromo (VI) 20 7196 UV-Vis (complesso difenilcarbazide)
0.4 7198 Polarografia differenziale a impulsi
0.2 7195 Co-precipitazione con PbSO4 +
FAAS/GF-AAS/ICP-AES/ICP-MS
0.04 7197 Chelazione (pirrrolidinditiocarbammato)
+ estrazione + FAAS/ICP-AES/ICP-MS
0.016 7199 Cromatografia ionica
Determinazione CrVI criticità
1. la soluzione estraente deve solubilizzare tutte le
forme di CrVI
2. le condizioni di estrazione non devono indurre la
riduzione da CrVI a CrIII
3. le condizioni di estrazione non devono indurre
l’ossidazione da CrIII a CrVI
i punti 1 e 2 non sono soddisfatti da estrazioni
in ambiente acido e neutro
il punto 3 può essere critico nel caso di estrazione
in ambiente alcalino in assenza di ioni Mg2+
….non sono facilmente prevedibili e impostabili a priori
le condizioni ottimali da utilizzare per l’analisi dei
metalli pesanti in matrice cosmetica complessa.
…. senza considerare la diversa sensibilità strumentale
delle diverse tecniche analitiche attualmente
disponibili, che scandiscono il livello di rilevabilità di
tracce
…. risulta estremamente difficile standardizzare e
convalidare una metodologia di trattamento del
campione che possa essere universalmente applicabile
a tutte le tipologie di prodotti cosmetici
Conclusioni
…. quali metodi utilizza l’azienda per determinare i
livelli di metalli pesanti presenti nei prodotti finiti ???
… quali convalide, quale riproducibilità? Confronti aperti
sul problema? Condivisione di percorsi ?
L’azienda: come affronta il problema ?
Soluzioni adottate e da adottare ?????
… i livelli dei metalli pesanti potrebbero essere desunti
sulla base di un criterio di additività, applicato alle
materie prime utilizzate per la realizzazione di ogni
singolo prodotto finito ????
…. potrebbero essere utilizzati i livelli massimi dichiarati
dal produttore nelle specifiche di ogni singolo ingrediente
per ottenere un’indicazione del contenuto totale ???