Trento, 11 Dicembre 2009
Michela A. Denti, PhDCentro Interdipartimentale per la Biologia Integrata
Università degli Studi di Trento
Strumenti, obiettivi e frontiere della terapia genica
[email protected]/cibio
Le malattie genetiche
•Identificazione dei geni malattia
•Diagnosi genetica
•Terapia Genica
•Vettori virali per la terapia genica
Le malattie genetiche
Malattie monogeniche: almeno 6.000, la maggior parte rare (<1/2000)
Malattie multifattoriali o complesse: interazioni gene-ambiente, suscettibilità, più di un gene coinvolto
Si stima che ogni anno il 6% dei neonati (8 milioni di bambini) nasca con un grave difetto di origine totalmente o parzialmente genetica!
Il destino è nei geni?
La diagnosi genetica
Una delle più importanti applicazioni della tecnologia
genica è la capacità di identificare mutazioni genetiche che
causano malattie specifiche, o la predisposizione allo
sviluppo di una malattia.
La diagnosi genetica: primo risultato della ricerca
Test diagnostici: conferma di un sospetto clinico
Test di identificazione di portatori sani: su familiari o screening di
popolazioni
Test preclinici o presintomatici effettuati prima dell’insorgenza della
malattia
Test di suscettibilità fornisce una probabilità statistica di ammalarsi (es.
BCRA1 o BCRA2)
1997
Problemi etici
La scala della ricerca: dalla malattia alla cura
(Fondazione Telethon Italia, 2007)
Fase I su un numero molto ristretto di volontari sani, obiettivo è determinare
il meccanismo d’azione e se il preparato è tollerato come previsto in base ai
risultati sugli animali.
Fase II su un numero ristretto di pazienti malati volontari; a gruppi diversi si
somministrano dosi differenti del composto, per determinarne la dose più
adatta a esercitare effetti terapeutici senza scatenare danni collaterali.
Fase III su un numero di pazienti elevato e significativo, l’obiettivo è
verificare l’effettiva efficacia del farmaco.
I tempi della ricerca ed i tempi della cura…
Terapia genica
-Sostituzione di un gene “malato” o mancante con uno sano
-Correzione di un gene “malato”
-Impedire al gene malato di esprimersi
Terapia genica
-Somatica: si alterano solo cellule somatiche, il trattamento non è
ereditabile ed influenza soltanto il singolo paziente
-Germinale comporterebbe modificazione dei gameti o
dell’embrione: i cambiamenti verrebero passati alla generazione
successiva. Non accettata al momento, non praticata: il problema è
che le tecniche usate per la correzione germinale di malattie
ereditarie sono esattamente le stesse che potrebbero essere usate
per la manipolazione germinale di altre caratteristiche ereditarie
Il 70% delle sperimentazioni di terapia genica in atto (tutte
somatiche) riguarda i tumori.
Terapia genica
-1990 Primo protocollo di terapia genica in USA per una deficienza
ereditaria del sistema immunitario
-Oggi più di 900 protocolli in corso
2/3 per il trattamento di vari stadi e forme di cancro
malattie cardiovascolari
Malattie infettive (quasi tutti HIV)
Disordini ereditarii autosomici recessivi provocati da difetti di
un singolo gene, come la fibrosi cistica.
Vettori per la terapia genica somatica
Per introdurre geni nelle cellule di un organismo umano
servono dei “vettori” che:
-Sappiano riconoscere le cellule bersaglio
-Non vengano distrutti dal sistema immunitario del ricevente
Espressione: transiente o permanente
Introduzione: in vivo oppure ex vivo
Terapia genica
-In vivo Il gene bersaglio è introdotto nel tipo di cellule desiderato
all’interno del paziente.
-Ex vivo Le cellule sono manipolate fuori dal corpo e quindi
reimpiantate nel paziente.
-Le cellule bersaglio devono essere rimuovibili, reiniettabili, a lunga
vita, resistenti ed accessibili.
-Introdotte ad es. mediante aerosol, iniezione nel torrente circolatorio
o rimozione chirurgica e manipolazione
-Spesso si usano cellule staminali perché si dividono attivamente
(ma sono rare e non tollerano bene le manipolazioni)
Le due strategie principali per la terapia genica somatica
Terapie cellulari
Isolamento ed amplificazione di cellule (staminali) da paziente o
da donatore
Eventuale “cura” mediante terapia genica
Re-infusione nel paziente
Trasferimento genico ex vivo in cellule staminali
Vettori per la terapia genica somatica
Vettori liposomici
Vettori retrovirali
Vettori adenovirali
Vettori adenoassociati
Vettori liposomici
Vantaggi: mancanza di tossicitàmancanza di immunogenicità
Svantaggi trasferimento genico scarsamente efficienteespressione transitoria
I liposomi sono minuscole sfere lipidiche in cui il doppio strato lipidico intrappola il
DNA.
Il doppio strato lipidico può essere costruito in modo da far aumentare il legame a certi
tipi cellulari, ad esempio tramite anticorpi, lipidi o carboidrati.
I complessi plasmide-liposoma si fondono con la membrana plasmatica ed entrano
nella cellula.
La maggior parte del materiale non va al nucleo ma viene dirottata negli endosomi
(organelli citoplasmatici in cui il materiale viene degradato). Una parte riesce ad
arrivare al nucleo ma il DNA non si integra nei cromosomi della cellula ospite.
Trasferimento genico mediato da liposomi
Vettori retrovirali
Il 34% dei trial attuali di terapia genica utilizza retrovirus.
I vettori retrovirali traggono vantaggio dalla capacità innata dei retrovirus di entrare in
modo efficiente nelle cellule.
Dopo l’infezione il genoma a RNA è copiato in DNA dalla trascrittasi inversa ed
integrato stabilmente nei cromosomi dell’ospite. L’integrazione non è del tutto
casuale: tendenza ad inserirsi nei geni attivi.
Non infettano con efficacia cellule che non si dividono (es. cellule nervose) poiché il
DNA virale può raggiungere i cromosomi solo se la membrana nucleare viene
demolita (divisione cellulare).
Rischio di alterazione di funzioni di geni adiacenti o attivazione di un oncogene
Vettori adenovirali
Il 27% dei trial attuali di terapia genica utilizza adenovirus.
La prima morte attribuita direttamente a terapia genica è avvenuta con vettori
adenovirali
Gli adenovirus sono una famiglia di virus a DNA a doppio filamento che infettano i
vertebrati provocando malattie blande del tratto respiratorio, della congiuntiva e della
cornea, del tratto gastrointestinale e del tratto genito-urinario.
Hanno la capacità di infettare una vasta gamme di cellule che si dividono e che non
si dividono. Sono tra i vettori più efficienti per il trasferimento genico in cellule di
mammifero. Possono accogliere geni estranei di maggiori dimensioni.
Svantaggio: poiché il DNA virale non si integra può essere necessaria la
somministrazione ripetuta e questo può portare a risposta immunitaria.
La prima morte per terapia genica
Prima del 17 Settembre 1999 si riteneva comunemente che la terapia genica
somatica per il trattamento di una malattia grave fosse un’opzione terapeutica
corretta dal punto di vista etico: i benefici erano ritenuti maggiori di costi e rischi, per
malattie mortali o terminali.
Il 17 Settembre 1999 Jesse Gelsinger muore a causa di una risposta
iperimmune contro la grande quantità di vettore necessaria per una terapia non
mirata: il consenso generale è messo in discussione.
Jesse Gelsinger, 18 anni, è relativamente sano ed ha una forma lieve di deficienza
parziale di ornitina transcarbamilasi (OTC) che poteva anche essere controllata con
la dieta e con i farmaci (anche se con un regime molto stretto). In questa malattia,
per una incapacità a demolire correttamente le proteine della dieta si ha accumulo
tossico di ammoniaca.
La prima morte per terapia genica
In un trial clinico, il 13 settembre 1999 Gelsinger riceve un’alta dose di vettore
adenovirale contenente il gene OTC nella vena porta (che irrora il fegato): 38 miliardi
di miliardi di particelle virali (la dose più alta mai somministrata in un trial clinico.
Solo l’1% raggiunge il fegato. Non si osserva espressione significativa del gene.
Le particelle virali invasero tutti gli altri organi del corpo successivamente esaminati:
milza, polmoni, tiroide, cuore, rene, testicoli, cervello, pancreas, linfonodi, midollo
osseo, vescica.
Quattro giorni dopo Gelsinger morì a causa di una risposta infiammatoria
sistemica alle proteine virali che portò ad insufficienza generalizzata degli organi.
La prima morte per terapia genica
21 Gennaio 2000 L’FDA (US Food and Drug Administration) chiuse 5 trial di terapia
genica dell’Università della Pennsylvania dopo aver scoperto gravi mancanze nella
supervisione e nel monitoraggio di questo trial in 18 aree.
Ad esempio:
-I pazienti non erano stati informati della morte di due scimmie Rhesus che avevano
ricevuto il trattamento sperimentale
- i moduli di consenso informato non erano stati compilati in modo appropriato
5 anni dopo il Dipartimento di Giustizia degli Stati Uniti commina multe pesanti ed
opera restrizioni alla ricerca clinica per i ricercatori e l’istituzione.
Vettori virali adeno-associati
I virus adeno-associati (AAV) hanno un genoma a DNA a singolo filamento, non
causano alcuna malattia negli esseri umani e tendono a rimanere inattivi in assenza
di adenovirus. Sono considerati sicuri, perché non si integrano nei cromosomi
dell’ospite. Hanno lo svantaggio di non poter accomodare grossi pezzi di DNA.
Interferenza a RNA e micro RNA
Napoli et al., (1990)Jorgensen et al., (1996)
Ambros, V. A (1989). Arasu P, Wightman B, Ruvkun G. (1991).
nucleo
dsRNA
cap AAAAAA
RNA target
L’RNA interference (RNAi) è un processonaturale di silenziamento post-trascrizionaledell’espressione genica iniziato da RNA a doppio filamento (dsRNA) di sequenza omologa al gene target.
nucleo
L’RNA interference (RNAi) è un processonaturale di silenziamento post-trascrizionaledell’espressione genica iniziato da RNA a doppio filamento (dsRNA) di sequenza omologa al gene target.
Uso terapeutico dell’ RNA interference
19 nt duplex
2 nt 3’ overhangs
Respiratory syncitial virus, Fase IIDiabetic Macular Edema, Fase IIAcute kidney injury, Fase ITumore epatico, Fase ITumori solidi, Fase I
Age-related Macular Degeneration, Fase II
Uso terapeutico dell’ RNA interference
Trial clinico per uso di RNA interference contro HIV (Benitec/City of Hope)Fase II
Terapie di splicing
Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD)
• Nei muscoli degli individui affetti da DMD manca una proteina: la distrofinadistrofina.
• La distrofina e’ richiesta per il mantenimento del muscolo e previene l’atrofia
muscolare.
proteina= 427 KDa
DNA: l’informazione genetica nei nostri geni
Pre-mRNA: la copia esatta del DNA di un gene
Pre-mRNA: la copia esatta del DNA di un gene
mRNA – RNA messaggero
ESONE 1 ESONE 3ESONE 2
ESONE 1 ESONE 3ESONE 2Introne Introne
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
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DNA
Pre-mRNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
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DNA
Pre-mRNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
STOVIACONMIAZIAPERTREORE
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DNA
Pre-mRNA
mRNA
STO VIA CON MIA ZIA PER TRE ORE
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
STOVIACONMIAZIAPERTREORE
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
DNA
Pre-mRNA
mRNA
mRNA – RNA messaggero,porta l’informazione dal DNA alle proteine
ESONE 1 ESONE 3ESONE 2
proteina – i “mattoni” che costituiscono le cellule
•Delezioni e mutazioni puntiformi nel gene della distrofina.
•Nella piu’ lieve Distrofia Muscolare di Becker (BMD) la
distrofina e’ presente, anche se mutata o in quantita’ minori.
DMD
47 5251
47 5251
mRNA
DEGRADAZIONESTOP
STOP
47 5251
47 5251
DNA
Delezione frame-shift : ∆48-50
Pre-mRNA
AAG GCA CT
AAG GCA CU
AAG GCA CU
Splicing
BMD
5247
TRADUZIONEAAGGCA
5247
5247
Delezione non frame-shift : ∆48-51
Splicing
AAG GCA
AAG GCA
Distrofina
STO VIA NMI AZI APE RTR EOR E
CO
DMD
STO VIA PER TRE ORE
CON MIA ZIA
BMD
STO VIA NMI AZI APE RTR EOR E
CO
STO VIA PER TRE ORE
CON MIA ZIA
DMD
BMD
Exon skipping o “cerotto molecolare”per la correzione di mutazioni DMD
DNA
Pre-mRNA
51 5247AAG GCA CT
5247AAG GCA
51
Traduzione
47 52AAGGCA
mRNA
Splicing
Distrofina
Exon Skipping o “cerotto molecolare”
Dr. J.C.T. van Deutekom, OlandaMDEX ConsortiumProsensa
Uso di oligonucleotidi antisenso (AON): piccoli frammenti di DNA che si legano all’esone da saltare e ne inibiscono l’inclusione nell’RNA messaggero
oligonucleotidi antisenso
E1 E3E2
E1 E3
Molecole di RNA antisenso come “cerotto molecolare”
5247 GCAAAG
525’ 3’
AAG GCA
47
AAAAAAA
5’3’
RNA ANTISENSO
51
Vantaggi:uso di vettori virali
U1/U7 promoter
Antisense CMV promoter WpreGFP5’-ITR 3’-ITR
SV40 miscintron BGH pA
Produzione diParticelle virali
Somministrazionelocale o sistemica
3’5’
Produzione dell’RNA antisenso e correzione molecolare del difetto
Molecole di RNA antisenso come “cerotti molecolari”
3
E3E1
E35’ 3’E1
AAAAAAA
5’3’
RNA ANTISENSO
E2
Alcuni esempi di mutazioni che si possono correggere con exon skipping:• Distrofia Muscolare di Duchenne• Beta-Talassemia • Fibrosi Cistica• Malattie Metaboliche (Malattie da accumulo lisosomiale)• Retinopatie• Demenza Frontotemporale con Parkinsonismo legata al cromosoma 17
“Exon skipping indotto da RNA antisenso per la terapia genica della Demenza FrontoTemporale con Parkinsonismo associata al cromosoma 17 (ftdp-17)”
Tau “microtubule associated protein”
nei neuroni saniE9 E11E10
E9 E11
E9 E11E10
E9 E11
FTDP-17
E10
* nei neuroni di pazienti FTDP-17
“Exon skipping indotto da RNA antisenso per la terapia genica della Demenza FrontoTemporale con Parkinsonismo associata al cromosoma 17 (ftdp-17)”
E9 E11E10
E9 E11
nei neuroni di pazienti FTDP-17
curatiRNA
antisenso
*
