UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
MARIANA CRISTINA CECHETTO
NANOEMULSÕES CONTENDO EXTRATO DOS FRUTOS DA
Rapanea ferruginea: DESENVOLVIMENTO E ATIVIDADE
ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO
Itajaí
2016
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
MARIANA CRISTINA CECHETTO
NANOEMULSÕES CONTENDO EXTRATO DOS FRUTOS DA
Rapanea ferruginea: DESENVOLVIMENTO E ATIVIDADE
ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Dr. Angélica Garcia Couto
Itajaí, setembro de 2016
FICHA CATALOGRÁFICA
C324n
Cechetto, Mariana Cristina, 1988-
Nanoemulsões contendo extrato dos frutos da Rapanea Ferruginea:
desenvolvimento e atividade anti-inflamatória in vivo [Manuscrito] /
Mariana Cristina Cechetto. – 2016.
130 f. : il. : 30 cm..
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Programa
de Mestrado em Ciências Farmacêuticas Área de Concentração em
Produtos naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas 2016.
“Orientadora: Profª. Drª Angélica Garcia Couto ;
Bibliografia: f. 107-121.
Inclui: figuras, quadros e tabelas.
1. Emulsões. 2. Myrsinaceae. 3. Extratos vegetais – uso terapêutico.
4. Anti-inflamatório I. Couto, Angélica Garcia. II. Título.
CDU: 615.2
Magda Cristina Possamai – CRB 14/1122
NANOEMULSÕES CONTENDO EXTRATO DOS FRUTOS DA Rapanea ferruginea: DESENVOLVIMENTO E ATIVIDADE
ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO
Mariana Cristina Cechetto
‗Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí. ‘
___________________________________ Angélica Garcia Couto, Dra
Orientador
__________________________________________________________ Clóvis Antonio Rodrigues, Dr.
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Dra.Angélica Garcia Couto (UNIVALI)) Presidente
______________________________________ Dra. Ângela Malheiros (UNIVALI).
Membro
______________________________________ Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva (UNIVALI).
Membro
____________________________________ Dra. Mara Lane Carvalho Cardoso (UEM)
Membro
Itajaí (SC), setembro de 2016
Ao meu pai, meu maior exemplo,
A minha mãe, meu maior orgulho.
A eles, meu amor maior.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me dado força, coragem e determinação
para seguir em frente e nunca desistir.
Meus maiores agradecimentos são aos meus pais, Sérgio e Eliane,
os quais sempre acreditaram em mim, na minha capacidade e potencial e
sempre me motivaram a realizar meus sonhos. Mãe, obrigada por ter me
apoiado do início ao fim, por ter sempre uma palavra de apoio e conforto
em todos os momentos de fraqueza, fazendo com que eu levantasse e
continuasse. Pai, obrigada por sempre estar ao meu lado, por tudo o que
fez por mim até os últimos dias de sua vida. Se cheguei até aqui devo a
você, sei que de onde estiver continuou torcendo por mim. Saiba que se
fui até o fim foi por você, para que se orgulhasse de mim. Obrigada, amo
vocês acima de tudo.
Não tenho palavras para agradecer ao meu companheiro de vida,
de todas as horas, meu amigo, namorado, marido, Marcel, o qual
embarcou comigo nesse sonho e juntos vencemos mais uma etapa de
nossas vidas, realizamos mais um sonho. Somente nós sabemos o quão
difícil foi chegar até aqui. Obrigada por estar sempre ao meu lado. Te amo
meu amor.
À minha irmã Liciane, que mesmo longe, sempre me apoiou e me
fez acreditar que era capaz, que nunca deixou desistir e que me ajudou a
chegar até aqui. Obrigada Lica por ser essa irmã e amiga maravilhosa.
Agradeço em especial a minha eterna melhor amiga, Karina, que o
acaso do destino fez nós estarmos juntas novamente. Obrigada Ká pelo
seu apoio diário, pelo ombro amigo de vários dias de choro, por estar
presente em todos os momentos de alegrias e tristezas, por não ter me
deixado desistir e por ter me ajudado suportar a dor da distância da
família. Sem você aqui isso não seria possível.
Obrigada a todos da minha família que me apoiaram e torceram por
mim, que mesmo longe se fizeram presentes nessa etapa.
Às minhas amigas que estão longe que me incentivaram e
acreditaram em mim, obrigada pela amizade verdadeira.
As amizades construídas nesse período, em especial à Dircéia, a
qual foi a primeira a estender a mão para me ajudar e, pela qual não tenho
palavras para agradecer. A uma grande mulher e exemplo de força e
determinação, minha amiga Roseni, a qual se tornou minha inspiração,
meu muito obrigado pelos momentos compartilhados, conhecimento
passado e pela amizade construída. Não podendo deixar de agradecer a
Ana Cristina, Lika, Luisa e Junior, os quais fizeram muito por mim e
ajudaram para o desenvolvimento desse trabalho.
Agradeço em especial aos meus chefes do trabalho, Thiago e
Daniela, os quais acreditaram no meu profissionalismo e me deram uma
grande oportunidade Obrigada pela compreensão, por todos os momentos
os quais tive que me ausentar das minhas obrigações profissionais, mas
continuaram sempre me apoiando, obrigada por tudo, se tornaram
pessoas especiais em minha vida e grandes amigos. Agradeço aos
demais colegas de trabalho que de certa forma ajudaram a concluir esse
período de estudo.
Agradeço à Prof. Dra. Angélica G. Couto, pela orientação e todo
conhecimento compartilhado, por estar ao meu lado em todos os
momentos de dúvidas e dificuldades, pela compreensão e por ter
acreditado no meu potencial, obrigada pelo carinho e amizade.
Obrigada à Prof. Isabel Daufenback Machado, por ter contribuído
com seu conhecimento para uma etapa do trabalho, pela realização e
supervisão dos experimentos, junto da sua equipe, meu muito obrigada.
Agradeço a equipe do controle microbiológico, à Prof. Dra. Josiane
de C. Vitorino, pela supervisão, e Bruna e Junior pelo auxílio na
realização, por contribuírem para a realização de uma etapa do trabalho.
Obrigada Prof. Dra. Daisy Netz, pelo conhecimento passado, pelo
tempo que disponibilizou para me ajudar.
Agradeço às Professoras Dra. Angela Malheiros, em especial pela
coleta dos frutos, e Dra. Ruth M. Lucinda Silva, pelo acompanhamento do
trabalho e conhecimento passado.
Agradeço à Professora Tania M. B. Bresolin – coordenadora do
Projeto Pronem, que financiou os materiais utilizados nesta pesquisa.
A todos, meus sinceros agradecimentos.
"Um país se constrói com homens e livros"
Monteiro Lobato
NANOEMULSÕES CONTENDO EXTRATO DOS FRUTOS DA Rapanea ferruginea: DESENVOLVIMENTO E ATIVIDADE
ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO
Mariana Cristina Cechetto Setembro/2016
Orientador: Prof. Dra. Angélica Garcia Couto Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 130 Tanto o extrato etanólico dos frutos da Rapanea ferruginea assim como as nanoemulsões tem demonstrado atividades biológicas promissoras para o desenvolvimento de medicamentos, tendo-se como marcador o ácido mirsinoico A (AMA). Este trabalho teve por objetivo desenvolver sistema nanoemulsionado óleo em água (O/A), contendo extrato mole etanólico dos frutos de R. ferruginea, e avaliar a atividade anti-inflamatória in vivo. Os frutos foram coletados em Blumenau (SC), secos e moídos para obtenção da droga vegetal, a qual foi caracterizada quanto a perda por dessecação (PPD), granulometria média (Gm), cinzas totais e insolúveis em ácido. A solução extrativa (SE), obtida por maceração dinâmica com etanol 95%, e o extrato mole (EM), por evaporação do solvente, foram caracterizados quanto ao resíduo seco (RS), pH e teor de AMA por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Para o desenvolvimento das formulações de nanoemulsão (NE), avaliou-se o óleo (triglicerídeo de ácido cáprico e caprílico a 5, 20 e 25%) e EM (0,5, 1 e 1,5%), o sistema tensoativo (monooleato de sorbitano e óleo de mamona etoxilado hidrogenado a 40 unidades de óxido de eteno - OE) (15 e 20%), por meio de estudo de estabilidade preliminar, com ciclos de 5 °C/ 40 °C, a cada 24 h. Na formulação escolhida, avaliou-se o sistema conservante (fenoxietanol com parabenos, a 1 e 2%), por meio do estudo de estabilidade acelerada a 40 ºC, 30 ºC e 5 ºC ± 2 ºC, durante 90 dias, após 0 (24 h), 30, 60 e 90 dias. As formulações foram caracterizadas quanto a separação de fases após centrifugação a 3500 rpm, pH, tamanho de gotícula, índice de polidispersividade (PDI), potencial zeta, viscosidade, teor de AMA por (CLAE), e pesquisa de contaminação microbiológica. A NE foi administrada por via oral em camundongos, para avaliação da atividade anti-inflamatória, pelo modelo in vivo de bolsa de ar, após 0 (24 h) e 90 dias, nas doses de 3, 30 e 100 mg/kg, tendo-se o EM a 3, 30 e 300 mg/kg, e as nanoemulsões sem o EM a 100 mg/kg como controles. A droga vegetal apresentou-se como pó grosso, com Gm de 675 µm, ppd de 8,7%, e cinzas totais e insolúveis de 2,73 e 0,14%, respectivamente. A SE e o EM apresentaram RS de 1,05 e 82,36%, pH de 5,34 e 5,42, teor de AMA de 79,15 e 113,09 mg/g, respectivamente. As NE apresentaram tamanho de gotícula de 100 a 200 nm, com PDI abaixo de 0,2. Os resultados sugerem que a presença do EM nos sistemas, aumenta o potencial zeta e reduzem o pH, enquanto o percentual de óleo aumenta o tamanho das gotículas. A contaminação microbiológica foi aceitável, com < 102UFC/g no tempo zero (24 h) e manteve-se estável apenas na presença do EM após 90 dias. A NE potencializou a atividade inibitória da migração de leucócitos para o EM em todas as doses testadas. Em conclusão, o presente estudo demonstra que o sistema contendo 25% de óleo, 15% de tensoativo, 1,5% de extrato mole dos frutos da R. ferruginea e 1% de conservante mostrou-se estável até o período avaliado de 90 dias, com tamanho de gotícula de 200 nm, com potencial anti-inflamatório. Palavras-chave:Nanoemulsões. Rapanea ferruginea. Atividade anti-inflamatória.
NANOEMULSIONS CONTAINING EXTRACT OF FRUITS OF Rapanea ferruginea: DEVELOPMENT AND ANTI-
INFLAMMATORY ACTIVITY IN VIVO
Mariana Cristina Cechetto September/2016
Supervisor: Prof. Dra. Angélica Garcia Couto Area of Concentration: Natural Products and Bioactive synthetic Substances Number of Pages: 130
Ethanol extract of Rapanea ferruginea fruits and nanoemulsions have both shown promising biological activities for the development of medicines, using myrsinoic acid A (MAA) as a marker. This work aimed to develop oil in water (O/W) nanoemulsions containing soft ethanol extract (SE) of the fruits of R. ferruginea, and to evaluate the anti-inflammatory activity in vivo. The fruits were collected in Blumenau (Santa Catarina, Brazil). they were dried and ground, to obtain the herb drug, which was characterized by loss on drying (LOD), average particle size (APS), and total and acid insoluble ash. The extraction solution (ES) obtained by dynamic maceration in 95% ethanol, and the SE by the solvent evaporation, were characterized as dry residue (DR), pH and MAA content by Liquid Chromatography High efficiency (HPLC). For the development of nanoemulsion formulations (NE), evaluation was carried out of the oil (triglyceride of capric acid and caprylic 5, 20 and 25%) and (0.5, 1 and 1.5%), and the surfactant system (sorbitan monooleate and ethoxylated hydrogenated castor oil 40 ethylene oxide units - OE) (15 and 20%), by means of preliminary stability study, with cycles of 5 °C/ 40 °C, for each 24h. In the chosen formulation, the preservative system was evaluated (phenoxyethanol with parabens, 1 and 2%) through the accelerated stability study at 40 °C, 30 °C and 5 °C ± 2 °C for 90 days, after 0 (24 h) 30, 60 and 90 days. The formulations were characterized by phase separation after centrifugation at 3500 rpm, pH, droplet size, polydispersity index (PDI), zeta potential, viscosity, content of MAA (HPLC) and microbiological control. The NE was orally administered in mice for anti-inflammatory evaluation, by the air bag model after 0 (24 h) and 90 days at doses of 3, 30 and 100 mg/kg, taking SE at 30 and 300 mg/kg and nanoemulsions without the SE at 100 mg/kg as controls. The herb was characterized as a coarse powder with APS of 675 µm, LOD of 8.7%, and total and insoluble ash of 2.73 and 0.14%, respectively. The ES and SE presented DR of 1.05 and 82.36%, pH of 5.34 and 5.42, MAA content of 79.15 and 113.09 mg/g, respectively. The NE showed droplet size of 100 to 200 nm with a PDI less than 0.2. The results suggest that the presence of the SE in the system increases the zeta potential and reduces the pH, while the percentage of oil increases the size of the droplets. Microbiological contamination was acceptable with <102UFC/g at zero time (24 h) and remained stable only in the presence of the MS after 90 days. NE potentiated the inhibitory activity of leukocyte migration for SE at all the doses tested. In conclusion, this study shows that the system containing 25% oil, 15% surfactant, 1.5% of soft extract of the fruits of R. ferruginea and 1% preservative was stable until the evaluation period of 90 days, with a droplet size of 200 nm, and with anti-inflammatory potential. Keywords: Nanoemulsion preparations. Rapanea ferruginea. Anti-inflammatory activity.
LISTA DE FIGURAS Figura 1: Representação dos glóbulos de emulsão tipo A/O e O/A. .............. 30
Figura 2: Esquematização dos fenômenos físico-químicos que podem
afetar a estabilidade de nanoemulsões. ......................................... 32
Figura 3: Representação esquemática da técnica de inversão de fases. ...... 36
Figura 4: Imagem da Rapanea ferruginea e frutos. ....................................... 45
Figura 5: Estrutura química dos ácidos mirsinoicos A e B,
respectivamente. ....................................................................................... 46
Figura 6: Mecanismos de migração dos leucócitos para o sítio
inflamatório. (A) detalhe e (B) visão geral das etapas da
migração: 1. Rolamento, 2. Ativação das integrinas, 3. Adesão
estável e 4. Migração/diapedese.................................................... 53
Figura 7: Distribuição granulométrica dos frutos secos e moídos da R.
ferruginea. ...................................................................................... 76
Figura 8: Cromatografia em camada delgada da solução extrativa (SE) e
do extrato mole (EM), utilizando como padrões os ácidos
mirsinoicos A e B. .......................................................................... 79
Figura 9: Perfil cromatográfico das soluções extrativas e extratos mole
por CLAE, em comprimento de onda 260nm e 280nm. ................. 80
Figura 10: Nanoemusões contendo diferentes níveis de óleo e extrato,
após 24h de preparo. ..................................................................... 81
Figura 11: Tamanho de gotícula, PDI e potencial zeta nas nanoemulsões
contendo diferentes percentuais de óleo e extrato mole. ............... 83
Figura 12: Distribuição de tamanho das gotículas das nanoemulsões
contendo os diferentes percentuais de óleo e extrato mole. .......... 85
Figura 13: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo
diferentes percentuais de óleo e extrato mole no tempo zero
(24h) e após 30 dias. ..................................................................... 86
Figura 14: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo
extrato mole a 1,5%, com diferentes percentuais de óleo,
quando submetidas às alterações de temperatura a cada 24h
durante 28 dias (estabilidade preliminar). ...................................... 88
Figura 15: Perfil cromatográfico por CLAE, representativo das
nanoemulsões, sem e com extrato mole da R. ferruginea, em
comprimento de onda 280 nm e 260 nm. ..................................... 90
Figura 17: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo
extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, com diferentes percentuais
de tensoativo, quando submetidas às alterações de
temperatura a cada 24 h durante 14 dias (estabilidade
preliminar). ................................................................................... 92
Figura 18: Aspecto visual das nanoemulsões contendo extrato mole a
1,5%, óleo a 25%, com diferentes percentuais de tensoativo
no tempo zero (24 h). ................................................................... 93
Figura 19: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo
extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, tensoativo a 15%, contendo
diferentes percentuais de conservante, quando submetidas ao
estudo de estabilidade acelerada por 90 dias. ............................. 96
Figura 20: Perfil de viscosidade da nanoemulsão com e sem extrato mole
da R. ferruginea. .......................................................................... 98
Figura 21: Efeito do extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea, de
nanoemulsões com incorporação deste extrato no tempo 0 e
em 90 dias após o preparo e do ácido mirsinóico A na
migração de leucócitos induzida por carragenina 1% no
modelo de bolsa de ar. ............................................................... 102
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Exemplos de estudos de desenvolvimento de nanoemulsões
contento extratos vegetais de 2011 a 2016. ............................ 38
Quadro 3: Relação entre os compostos isolados e atividade farmacológica
da R. ferruginea. ...................................................................... 47
Quadro 4: Gradiente empregado para análise das soluções extrativas de
R. ferruginea. ........................................................................... 62
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Resultados da caracterização físico-química da solução
extrativa e extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea. ............... 78
Tabela 2: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de
estabilidade preliminar (ciclo 28 dias). ............................................... 90
Tabela 3: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de
estabilidade preliminar (ciclo 14 dias). ............................................... 94
Tabela 4: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de
estabilidade acelerada (90 dias). ....................................................... 97
Tabela 5: Análise da viscosidade média, índice de comportamento de
fluxo e tixotropia para as nanoemulsões com e sem extrato
mole de R. ferruginea durante o estudo de estabilidade
acelerada. .......................................................................................... 99
Tabela 6: Análise da pesquisa de contaminação microbiológica para as
nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea
durante o estudo de estabilidade acelerada. ................................... 100
LISTA DE ABREVIATURAS
AMA - Ácido mirsinoico A
AMB - Ácido mirsinoico B
CCD - Cromatografia em camada delgada
CLAE - Cromatografia de Alta Eficiência
DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO - Dimetilsufóxido
DPR - Desvio padrão relativo
EDTA - Ethylenedismine tetraacetic acid/ (ácido etilnodiamino tetra-
acético).
EPM - Erro padrão da média
EM - Extrato mole
EP – Estudo de estabilidade preliminar
Gm – granulometria média
HPLC – High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia líquida
de alta eficiência).
NE – Nanoemulsão
NIQFAR - Núcleo de Investigações Químico – Farmacêuticas.
PBS -Phosphate Base Saline (Tampão salina fosfato).
PDA – Potato Dextrose Agar (Ágar dextrose batata).
PDI – Polispersibility index (Índice de polidispersão).
Ppd – perda por dessecação
RS – Resíduo seco
SE - Solução extrativa
SNE - Sistema nanoemulsionado
S - Desvio padrão
SS - Ágar Salmonela Shigella
TF - Tampão fosfato
TGL - Triglicerídeo
TSA – Soybean Casein Agar (Ágar caseína de soja).
VRBD - Violet Red Bile Dextrose Agar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 27
2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 29
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 29
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 29
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 30
3.1 Emulsões, microemulsões e nanoemulsões .................................................. 30
3.2 Métodos de caracterização de nanoemulsões ............................................... 36
3.3 Desenvolvimento de nanoemulsões contendo derivados vegetais ............. 37
3.4 Estudo de estabilidade ..................................................................................... 42
3.5 Rapanea ferruginea .......................................................................................... 44
3.6 Inflamação e resposta inflamatória ................................................................. 51
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 55
4.1 Material .............................................................................................................. 55
4.1.1 Droga vegetal ................................................................................................. 55
4.1.2 Reagentes e materiais ................................................................................... 55
4.1.3 Equipamentos ................................................................................................ 56
4.2 Métodos ............................................................................................................. 58
4.2.1 Tratamento da droga vegetal ........................................................................ 58
4.2.2 Caracterização da droga vegetal .................................................................. 58
4.2.2.1 Análise granulométrica .............................................................................. 58
4.2.2.2 Perda por dessecação ................................................................................ 59
4.2.2.3 Determinação de cinzas totais ................................................................... 59
4.2.2.4 Determinação de cinzas insolúveis em ácido .......................................... 60
4.2.3 Obtenção da solução extrativa e extrato mole ............................................ 60
4.2.4 Caracterização dos derivados vegetais (solução extrativa e
extrato mole) ........................................................................................................... 60
4.2.4.1 Determinação do pH ................................................................................... 60
4.2.4.2 Determinação do resíduo seco .................................................................. 61
4.2.4.3 Análise do perfil cromatográfico dos derivados vegetais por
CCD .......................................................................................................................... 61
4.2.4.4 Quantificação dos marcadores por CLAE ................................................ 61
4.2.5 Desenvolvimento dos sistemas nanoemulsionados .................................. 63
4.2.5.1 Influência da concentração de óleo e extrato........................................... 64
4.2.5.2 Influência da concentração do tensoativo ................................................ 66
4.2.5.2 Influência da concentração do conservante............................................. 66
4.2.6 Caracterização dos sistemas nanoemulsionados desenvolvidos ............. 67
4.2.6.1 Características organolépticas (aspectos físicos) ................................... 68
4.2.6.2 Determinação do pH ................................................................................... 68
4.2.6.3 Análise de tamanho médio de partícula e PDI .......................................... 68
4.2.6.4 Perfil cromatográfico e teor de AMA em CLAE ........................................ 68
4.2.6.4 Análise de viscosidade aparente da nanoemulsão ................................. 69
4.2.6.5 Pesquisa de contaminação microbiológica das nanoemulsões ............. 69
4.2.7 Ensaio da atividade anti-inflamatória in vivo .............................................. 71
4.2.7.1 Animais ........................................................................................................ 71
4.2.7.2 Droga e tratamento ..................................................................................... 72
4.2.7.3 Inflamação no tecido subcutâneo dorsal - bolsa de ar ........................... 72
4.2.7.4 Análise estatística ...................................................................................... 73
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 75
5.1 Obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal ............................. 75
5.2 Caracterização da solução extrativa e extrato mole ...................................... 78
5.3 Otimização dos sistemas nanoemulsionados ................................................ 80
5.3.1 Influência do percentual de óleo e extrato nas nanoemulsões ................. 80
5.3.2 Influência do tensoativo nas nanoemulsões contendo óleo a
25% e extrato a 1,5% ............................................................................................... 91
5.3.3 Influência do conservante na nanoemulsão selecionada .......................... 94
5.3.3.1 Estudo reológico dos sistemas nanoemulsionados com e sem
extrato de R. ferruginea .......................................................................................... 98
5.3.3.2 Pesquisa de contaminação microbiológica das nanoemulsões ........... 100
5.4 Atividade anti-inflamatória in vivo dos sistemas
nanoemulsionados ............................................................................................... 101
6 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 105
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 107
APÊNDICES ........................................................................................................... 123
ANEXOS ................................................................................................................. 129
27
1 INTRODUÇÃO
A biodiversidade brasileira representa uma ampla fonte de insumos ativos
vegetais farmacêuticos, que podem ser incorporados em diferentes formulações
fitoterápicas para o desenvolvimento tecnológico de produtos (SARAF, 2010). Na
área de pesquisa e inovação no setor industrial farmacêutico no Brasil, destaca-se a
nanotecnologia (FRONZA et al., 2007; LEE, 2004; McCLEMENTS, 2012; RSRAE,
2004), cujas pesquisas tem apresentado crescimento expressivo (ABDI, 2010).
Dentre os tipos de sistemas nanométricos, as nanoemulsões são constituídas
por fases oleosa, aquosa e tensoativos, organizadas em gotículas, cujo tamanho
nanométrico, as tornam cineticamente estáveis frente à sedimentação ou
cremeação, além de prevenir a floculação e a coalescência (ANTON; VANDAMME,
2011; SOLANS; SOLÉ, 2012).
Assim sendo, o emprego da nanotecnologia representa uma estratégia para
aumentar a estabilidade física e química dos ativos e da formulação, bem como
potencializar a ação biológica, permitindo veicular e proteger as substâncias
internalizadas no sistema. Os estudos de desenvolvimento e otimização de sistemas
nanoemulsionados têm sido direcionados para as diferentes vias de administração e
aplicações terapêuticas, com ênfase para o controle do tamanho de fase interna da
emulsão, priorizando a menor concentração de tensoativos e a maior capacidade de
dispersão dos ativos (ALAM et al., 2013; ALI et al., 2012; BERNARDI, 2011;
BIDONE et al., 2014, CHAIITTIANAN; SRIPANIDKULCHAI, 2014; LIANG et al.,
2012; WANG et al., 2008).
Neste contexto, várias espécies vegetais têm sido estudadas como fonte de
novos produtos, como a Rapanea ferruginea, conhecida popularmente como
azeitona-do-mato, entre outros, estudada pelos pesquisadores do Núcleo de
Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da Universidade do Vale do Itajaí
há mais de 10 anos. O isolamento do ácidos mirsinoico A (AMA), abundante no
extrato dos frutos (COSTA, 2011; GAZONI, 2009), acompanhado da comprovação
de atividades do tipo anticolinesterásica (GAZONI, 2009; FILLIPIN, 2010), citotóxica
e antitumoral (TOMIO, 2011), cognitiva (COSTA, 2011) e antioxidante (BARRETA,
2011) dos extratos e ação anti-inflamatória oral (SOUSA, 2016) do composto AMA,
28
motivaram o desenvolvimento de sistemas nanoemulsionados para veicular e
potencializar o efeito terapêutico do extrato etanólico dos frutos (XAVIER, 2014;
XAVIER et al., 2015; CAZARIN; BRANDALISE, 2016).
O AMA apresenta característica lipofílica, muito pouco solúvel em metanol e
em acetonitrila, susceptível a degradação oxidativa, tanto na forma isolada quanto
no extrato, e fortemente suscetível a degradação quando exposto a radiação visível
(ZERMIANI, 2014). Dentre as principais vantagens das nanoemulsões, destaca-se a
sua função como veículos para a administração fármacos insolúveis, e a de ofercer
proteção contra a instabilidade (BHOSALE et al., 2014). Entretanto, o sistema
nanoemulsionado desenvolvido por Xavier (2014) na ordem de 10 nm de fase
interna, de consistência fluida, contendo 1% do extrato dos frutos de R. ferruginea,
não foi suficiente para proteger o AMA da oxidação e radiação visível. A formulação
apresentou potencial de irritação moderada, atribuído ao percentual de tensoativos
(MISHRA; MISHRA 2012) e ao tamanho manométrico (BRUXEL et al., 2012).
A nanoemulsão desenvolvida por Xavier (2014) apresentou tendência ao
aumento da fase interna ao final do estudo de estabilidade acelerada (90 dias), bem
como a influência do extrato na estabilidade física do sistema, mediante os valores
de potencial zeta.
Os estudos supracitados, referente às características e problemas da
formulação (XAVIER, 2014), e de estabilidade (ZERMIANI, 2014), e ao potencial
farmacológico do extrato por via oral, quanto a atividade antinociceptiva (XAVIER et
al., 2015), aliado aos estudos já reportados na literatura referente a atividade anti-
ínflamatória tópica do extrato (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002), motivaram o
seguimento das pesquisas com estes derivados vegetais.
Assim, este estudo representa a continuidade do desenvolvimento iniciado
por Xavier (2014), e tem por objetivos elevar o tamanho de gotículas da
nanoemulsão anterior, propondo variáveis quantitativas de formulação,
acompanhadas pela avaliação da estabilidade física, química e microbiológica, e
ainda avaliar a atividade anti-inflamatória via oral deste sistema, buscando ampliar o
potencial terapêutico antinociceptivo, pelo estudo da atividade anti-inflamatória das
nanoemulsões contendo extrato dos frutos da R. ferruginea.
29
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver sistemas nanoemulsionados contendo extrato mole dos frutos da
Rapanea ferruginea, avaliar a estabilidade e a atividade anti-inflamatória in vivo.
2.2 Objetivos Específicos
Obter e caracterizar a droga vegetal, as soluções extrativas e o extrato mole
dos frutos da Rapanea ferruginea;
Desenvolver sistemas nanoemulsionados (SNE) com variáveis de formulação
(concentrações de óleo, extrato, tensoativo e conservante), monitorando as
modificações na formulação por meio de estudos de estabilidade preliminar e
acelerado;
Caracterizar as formulações quanto ao parâmetros físicos (aspecto visual,
separação de fases após a centrifugação, tamanho médio e índice de
polidispersão da fase interna, potencial zeta e reologia), físico-químicos (pH e
viscosidade) e microbiológicos;
Avaliar a atividade anti-inflamatória in vivo por via oral, em camundongos, do
sistema nanoemulsionado desenvolvido, extrato dos frutos e composto
isolado (AMA).
30
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Emulsões, microemulsões e nanoemulsões
As emulsões são definidas como sistemas dispersos de fases imiscíveis, onde
uma fase está dispersa na forma de glóbulos (fase interna, descontínua ou dispersa)
é dispersa em outra (fase externa, contínua ou dispersante). Existem duas formas de
emulsões simples, a do tipo óleo em água (O/A), na qual as gotículas de óleo estão
dispersas na água, e a do tipo água em óleo (A/O), na qual gotículas de água estão
dispersas no óleo conforme apresentado na figura 1 (BECHER, 2001; CHEN; TAO,
2005).
As emulsões são sistemas heterogêneos e termodinamicamente instáveis,
estabilizados cineticamente pela adição de emulsionantes, também denominados
agentes tensoativos (FERNANDEZ et al., 2004; MORRISON, 2002). Normalmente,
não se formam espontaneamente, necessitam da energia mecânica do movimento
de agitação e suas propriedades dependem não apenas de condições
termodinâmicas, como também do método de preparação, das características físico-
quimicas da formulação e da ordem de adição de cada componente (LIN;
KURIHARA; OTHA, 1975).
Figura 1: Representação dos glóbulos de emulsão tipo A/O e O/A.
Fonte: McCLEMENTS, 2012.
31
Em geral, uma emulsão é considerada fisicamente instável se a fase interna
ou dispersa tender a formar agregados de gotículas, os quais podem vir a formar
uma camada concentrada de fase interna, ou ainda quando todo ou parte do líquido
da fase interna se separa e forma uma camada distinta na superfície ou no fundo do
recipiente (ALLEN Jr; POPOVICH; ANSEL, 2013).
As alterações como inversão de fases, cremagem, floculação, coalescência e
sedimentação, as quais estão representadas na figura 2, podem estar relacionadas
a fatores externos, aos quais o produto está exposto (temperatura, luz e oxigênio,
umidade, material de acondicionamento e micro-organismos) e a fatores intrínsecos,
os quais estão relacionados à natureza das formulações, tais como,
incompatibilidade física e a incompatibilidade química (dependente do pH e reações
de óxido-redução) e interação entre compostos da formulação e o material de
acondicionamento (ISAAC et al., 2008).
A inversão de fases é uma incompatibilidade física que envolve a mudança do
tipo da emulsão de O/A para A/O ou vice-versa (SINKO, 2008). A figura 2 ilustra os
fenômenos que afetam a estabilidade das emulsões. A floculação é a agregação das
gotículas dispersas em aglomerados frouxos, os quais podem ser redispersos
através da agitação (AULTON, 2005). Outro fator é a cremagem (creaming) a qual é
a separação da emulsão em duas fases, ou seja, pode ocorrer a formação da ―nata
da emulsão‖ ou a migração das gotículas da fase interna para a fase inferior da
emulsão. Isso, por sua vez é causado pela diferença de densidade entre as duas
fases, sendo que a direção no movimento depende da fase interna ser mais ou
menos densa do que a fase externa contínua, sendo esse processo reversível, no
qual a uniformidade da dispersão pode ser restabelecido mediante agitação da
emulsão (SINKO, 2008; ALLEN Jr; POPOVICH; ANSEL, 2013).
32
Figura 2: Esquematização dos fenômenos físico-químicos que podem afetar a estabilidade de nanoemulsões.
Fonte: McCLEMENTS et al. (2005).
A emulsão é um sistema dinâmico, contudo a floculação e a cremagem
representam importantes passos em direção a coalescência, a qual constitui a fusão
das gotículas em gotas maiores até a separação total e definitiva das fases. A
coalescência é um processo irreversível, uma vez que o filme formado ao redor das
gotículas é rompido (THOMSON, 2006; SINKO, 2008).
A presença de luz, a temperatura, o pH, determinados micro-organismos,
assim como a presença de outros fármacos ou excipientes podem vir a causar a
oxidação de um ou mais componentes numa preparação. A oxidação é
frequentemente acompanhada por alterações nas características organolépticas,
sobretudo na cor e odor, e físico-químicas, detectadas pelo pH e condutividade
elétrica (THOMSON, 2006; BOOK, 2007). Assim, justifica-se a necessidade da
adição de antioxidantes em emulsões susceptíveis à degradação devido ao oxigênio
e conservantes antimicrobianos, aqueles susceptíveis à oxidação de origem
microbiológica (AULTON, 2005).
Dependendo do tamanho dos glóbulos, as emulsões podem ser classificadas
em microemulsões, nanoemulsões e macroemulsões (McCLEMENTS, 2012). As
microemulsões, ao contrário das emulsões, são sistemas termodinamicamente
estáveis, opticamente transparentes, isotrópicos e de baixa viscosidade, constituídos
por gotículas de tamanho nanométrico, dispersas em uma fase contínua de um
33
solvente imiscível com a fase dispersa (ANTON; VANDAMME, 2011). De forma
geral, as microemulsões, são estabilizadas por um filme de compostos tensoativos,
geralmente em elevada concentração, localizados na interface de óleo e água
(OLIVEIRA et al., 2004; TADROS et al., 2004).
As nanoemulsões diferenciam-se das microemulsões basicamente em termos
de estabilidade termodinâmica. Apesar de ambas apresentarem componentes e
estruturas semelhantes, as microemulsões apresentam maior estabilidade
termodinâmica. As nanoemulsões são instáveis termodinamicamente, porém
estáveis cineticamente, pois sua cinética de desestabilização é lenta, em torno de
meses. A proporção de emulsionante nas microemulsões é maior, e podem ou não
apresentar a fase dispersa em formato esférico (ANTON; VANDAMME, 2011).
As macroemulsões ou emulsões tradicionais, são sistemas dispersos que
apresentam tamanho de partícula maior do que 1 μm (THAKUR et al., 2012).
Diferem das nanoemulsões por essas possuírem um diâmetro da fase interna ou
glóbulos na faixa de 100 a 500 nm (TEO et al., 2010). Estas apresentam aparência
translúcida quando o tamanho for inferior a 200 nm e leitosa quando se encontra
entre 200 e 500 nm, geralmente são obtidas com concentrações de tensoativos
entre 5 e 10%, menores que as microemulsões (GUGLIELMINI, 2008; TADROS et
al., 2004).
Um dos fatores de extrema importância no desenvolvimento de emulsões é a
seleção do sistema tensoativo para a fase dispersa (MCCLEMENTS, 2012). Os
tensoativos, por sua vez reduzem a tensão interfacial entre as gotículas imiscíveis,
formando um filme ao redor da fase dispersa, com propriedades estéricas ou
eletrostáticas (FERNANDEZ et al., 2004).
Uma das principais propriedades das moléculas tensoativas é a capacidade
de emulsionar dois líquidos imiscíveis. Os tensoativos que apresentam estas
características são chamados particularmente de agentes emulsificantes e atuam
facilitando a emulsificação, bem como estabilizando a emulsão resultante (DALTIN.
2011)
Em 1948, Griffin, estabelceu a relação de Equilíbrio Hidrófilo Lipófilo (EHL)
pela primeira vez, classificando o tensoativo numericamente numa escala de 1 a 20,
segundo as suas características de hidrofilia e lipofilia. Quanto maior o valor de EHL,
maior a hidroficilicidade do tensoativo, que predispõe a formação de emulsões O/A.
No EHL requerido para a fase dispersa, o tamanho do glóbulo é mínimo,
34
proporcionando maior estabilidade do sistema (FLORENCE; ATWOOD, 2003;
LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001).
Considerando a carga da superfície ativa, os tensoativos podem ser
classificados em tensoativos iônicos (aniônicos, catiônicos e anfóteros) e não
iônicos. Os tensoativos iônicos abrangem os tensoativos aniônicos, que possuem
um ou vários grupos ionizáveis em fase aquosa e uma vez dissociados em água
formam íons na superfície ativa carregados negativamente. Os catiônicos possuem
um ou vários grupamentos ionizáveis em fase aquosa, fornecendo íons com cargas
positivas, e os anfóteros: possuem caráter iônico duplo, possuindo propriedades dos
tensoativos aniônicos a altos valores de pH e dos tensoativos catiônicos a baixo
valores de pH (DALTIN, 2011).
Já os tensoativos não iônicos não fornecem íons em solução aquosa e sua
hidrofilia se deve à presença de grupamentos funcionais em suas moléculas, que
possuam forte afinidade pela água (DALTIN, 2011). Estes tensoativos são
amplamente usados devido à baixa toxicidade e estabilidade frente aos aditivos
(FLORENCE; ATWOOD, 2003). Tensoativos não iônicos do grupo dos poloxâmeros
e polioxietileno-sorbitanos (Tweens®) têm se mostrado promissores em combinação
com os fosfolipídeos, pois levam à formação de filmes mistos compactos, conferindo
maior estabilidade à formulação (KUMAR; RAJESHWARRAO, 2011).
Os tensoativos não-iônicos comercialmente conhecidos por Ultramona®
RH400, Alkest® entre outros, são resultantes da reação do óleo de mamona com
óxido de eteno (OE). Estes tensoativos diferenciam-se conforme o grau de
etoxilação, que se dá em função do número de unidades de OE, o que lhe
proporciona diferentes valores de equilíbrio hidrofílico-lipofílico (EHL). Aumentando-
se o grau de etoxilação, aumenta-se o caráter hidrofílico da molécula (maior EHL), o
que altera a sua solubilidade em água, permitindo que sejam utilizados como
emulsionantes (ALKEST CSO, 2016).
Emulsões com tamanho de gota em escala nanométrica são frequentemente
referidas na literatura como miniemulsões, nanoemulsões e emulsões ultrafinas (EL-
AASSER; SUDOL, 2004). Nanoemulsões são consideradas verdadeiras emulsões,
com uma fase dispersa e outra dispersante, estabilizados por um sistema tensoativo
adequado (FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA, 2004; GUTIÉRREZZ et al., 2008).
Em função do tamanho de gotícula, as nanoemulsões, apresentam-se com
aparência translúcida quando o tamanho é inferior a 200 nm e leitosa, entre 200 e
35
500 nm (FERNANDEZ et al., 2004; TADROS et al., 2004). Outros trabalhos
delimitam a faixa entre 10 a 100 nm para as nanoemulsões líquidas transparentes
ou translúcidas de baixa viscosidade. A estabilidade se deve principalmente ao
tamanho característico das gotículas, evitando a sedimentação (ASSIS et al., 2012;
FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA, 2004; KOURNIATIS et al., 2010; SONNEVILLE-
AUBRUN et al., 2004).
A preparação das nanoemulsões depende do fornecimento de energia ao
sistema a partir de dispositivos mecânicos, já que são um sistema de não-equilíbrio,
termodinamicamente instável (KENTISH et al., 2008). Os métodos de emulsificação
para se obter nanoemulsões são classificados de alta e baixa energia.
Os métodos que utilizam alta energia de emulsificação são baseados na
geração de energia mecânica, por meio de alta tensão de cisalhamento,
empregando a utilização de homogeneizadores de alta pressão, microfluidizadores
ou ultrassom (KENTISH et al., 2008; KOURNIATIS et al., 2010; NUCHUCHUA et al.,
2009; PUGLIA et al., 2010; SAKULKU et al., 2009). A homogeneização sob alta
pressão, em suas modalidades ―a frio‖ ou ―a quente‖, é um dos processos mais
importantes para obtenção da nanopartículas. Esta é empregada há algum tempo na
indústria para o preparo de emulsões (ASSIS, 2012).
A ultrasonificação é um método de alta energia, rápido e eficiente para gerar
nanoemulsões com baixa polidispersão. O método utiliza um sonotrodo para causar
vibrações mecânicas, com uma frequência superior a 20 kHz, seguido pela formação
acústica de cavitação (BEHREND, 2008; LIN, 2008; NAKABAYASHI et al., 2011).
A emulsificação com baixa energia emprega equipamentos convencionais, e
dependerá das propriedades físico-químicas do sistema e da inversão espontânea
na curvatura do tensoativo para a obtenção de glóbulos de tamanho reduzido
(IZQUIERDO, 2005; SAJJADI; ZERFA; BROOKS, 2006). A inversão de fase da
emulsão (Figura 3) pode se dar pelo aumento da temperatura ou pela alteração da
fração volumétrica (McCLEMENTS; RAO, 2011; SANTANA; PERRECHIL; CUNHA,
2013).
A técnica da temperatura de inversão de fases (Phase Inversion Temperature
– PIT) baseia-se no conceito de inversão transicional da curvatura, particularmente
de tensoativos não iônicos de acordo com a variação da temperatura. Na técnica de
inversão de fases pela alteração da fração volumétrica, a transição do sistema A/O
para O/A ocorre quando a afinidade do tensoativo pela fase aquosa e oleosa
36
alcança o equilíbrio (JAFARI et al., 2004). Além da alteração da fração volumétrica
(Emulsion Phase Inversion – EPI), a mudança de curvatura do tensoativo pode
ocorrer devido a alterações no valor de pH e da concentração de eletrólitos
(MAESTRO et al., 2008; SOLE et al., 2006).
Figura 3: Representação esquemática da técnica de inversão de fases.
Fonte: McCLEMENTS; RAO (2011).
3.2 Métodos de caracterização de nanoemulsões
A avaliação do tamanho médio de fase interna, a microscopia eletrônica de
transmissão, assim como a magnitude do potencial zeta são características
utilizadas para avaliar a estabilidade de uma emulsão (MORAIS et al., 2006).
O tamanho médio de gotícula está sob influência de fatores, como a técnica
de preparação, as propriedades físico-químicas entre os compostos utilizados na
composição, a viscosidade e a tensão interfacial (FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA,
2004).
Geralmente, quanto menor o tamanho dos glóbulos dispersos, maior a
estabilidade do sistema, de modo que o tamanho dos glóbulos dispersos de uma
emulsão determina fenômenos de instabilidade, como floculação e coalescência
37
(JEONG; OH; KIM, 2001).
A determinação do tamanho das gotículas é realizada para monitorar o
desenvolvimento e a otimização dos parâmetros da-e formulação e o processo
emulsificação (BEHREND, 2008; LIN, 2008; NAKABAYASHI et al., 2011). A aferição
do tamanho dos glóbulos após o preparo e durante o período de armazenamento
indica características sobre a estabilidade do sistema, sendo que quanto mais rápido
os glóbulos aumentam de tamanho, menor a estabilidade (ROLAND et al., 2003).
O índice de polidispersão está relacionado com a distribuição do tamanho de
partículas dentro do sistema disperso, assim esse valor indica se formulação tem
distribuição estreita ou polidispersa. Quanto mais polidisperso o sistema, mais
pronunciado será esse mecanismo de instabilidade, pois maior será a diferença de
solubilidade dos glóbulos em dispersão. Nos sistemas dispersos nanoemulsionados
esse parâmetro influencia diretamente na estabilidade da formulação, através do
fenômeno de ―Ostwald ripening‖, que ocorre devido a diferença de solubilidade entre
as partículas (CAPEK, 2004).
O potencial zeta está diretamente relacionado à repulsão eletrostática entre
glóbulos dispersos próximos, sendo um parâmetro que reflete a composição da
interface das nanoemulsões, seja em relação aos tensoativos formadores de filme
interfacial ou em relação a presença de fármacos ou outras moléculas associadas à
interface (MORAIS et al., 2006; SCHAFFAZICK, 2003). Um elevado valor de
potencial zeta em módulo (˃30 mV) é importante para estabilidade físico-química
das emulsões uma vez que forças repulsivas tendem a evitar possíveis agregações
da fase interna (FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA, 2004).
3.3 Desenvolvimento de nanoemulsões contendo derivados vegetais
Nos últimos anos, o avanço no desenvolvimento de novos sistemas de
liberação de ativos, como nanopartículas, nanocápsulas, lipossomas, nanoemulsões,
microesferas, a partir de insumos farmacêuticos ativos vegetais, vem sendo
expandido, com base nas vantagens que os sistemas apresentam sobre as
formulações convencionais, entre elas, o aumento da solubilidade,
biodisponibilidade, proteção contra a toxicidade, potencialização da atividade
farmacológica, aumento da estabilidade e proteção contra degradação física e
38
química (SARAF, 2010).
Vários extratos de plantas e até compostos isolados de extratos, apesar de
terem excelente atividade in vitro demonstram pouca ou nenhuma ação in vivo
devido à sua má solubilidade e/ou tamanho molecular inadequado, resultando em
má absorção e fraca biodisponibilidade. Quando administrados através de novo
sistema de liberação, mostram melhor perfil de absorção que permite atravessar a
membrana biológica, resultando em melhor biodisponibilidade (SARAF, 2010).
Estudos atuais de desenvolvimento de novas formulações contendo insumos
farmacêuticos ativos de origem vegetal, exploram como variáveis, a formulação, o
método de preparação, e os compostos ativos, buscando otimizar o tamanho de
gotícula, a atividade biológica, a estabilidade, bem como adequar ou ampliar as
aplicações para diferentes vias de administração.
Quadro 1: Exemplos de estudos de desenvolvimento de nanoemulsões contento extratos vegetais de 2011 a 2016.
Extrato vegetal
Formulação Tecnologia de obtenção Referência
Óleo de farelo de arroz
Polissorbitato 80 Oleato de sorbitano Polissorbato 60 PEG - 15 Óleo de rícino PEG - 30 PEG – 40
Inversão de fases: Agitação a 600 rpm / 75 ° C
BERNARDI et al. (2011)
Extrato de flores da Allamanda cathartica L.
Triglicerídeos de ácido cáprico e caprílico Óleo de mamona etoxilado hidrogenado a 40 unidades de óxido de eteno – O monooleato de sorbitano Phenonip® (fenoxietanol, metilparabeno, etilparabeno , propilparabeno, butilparabeno, isobutilparabeno)
Inversão de fases: Agitaçao a 600rpm/ 85° C
MULLER (2013)
39
Extrato seco de Calendula officinalis
Polissorbato 85 Água Nanopartículas de ouro revestidas com ácido lipóico Óleo de Nigella sativa Lecitina
1.Ultrassonificação/ 5 min/ 60% de amplitude em banho de gelo
GULER et al. (2014)
Extrato de tomate rico em licopeno
Acetato de etila Tween 20 Água BHT
Emulsificação-evaporação: 1.Agitação a 500 rpm durante 3 h (F.O.) 2.Homogeinização a 5000 rpm/5 min 3.Homogeneização com alta pressão 4.Evaporação do solvente
HA et al. (2015)
Extrato de Achyrocline satureioides
Solução etanólica Lecitina de ovo Octildodecanol
Emulsificação-evaporação: 1.Agitação magnética por 10 min 2. Evaporação do solvente
ZORZI et al. (2015)
Extrato hidroglicólico de Opuntia ficus-indica (L.)
Polissorbato 80 Oleato de sorbitano Triglicerídeos cáprico / caprílico Palmitato de etilhexila Benzoato de alquila Vaselina líquida Fenoxietanol Caprililglicol EDTA dissódico Goma xantana Água destilada
1.Adição da fase oleosa à fase aquosa a 11.000 rpm/ 5 min/ 75 °C 2.Agitação mecânica a 500 rpm durante 2 min em banho de gelo. 3.Adição do extrato e agitação por 2 min
RIBEIRO et al. (2015)
Extrato dos frutos de R. ferruginea
Gérmen de trigo, Vaselina líquida, Triglicerídeos do ácido cáprico e caprílico, Oleato de isodecila, Óleo de silicone. Polissorbato 80, Monoestearato de sorbitano, Monoestearato de sorbitano, Polissorbato, Óleo de mamona etoxilado 15 OE, Óleo de mamona etoxilado 54 OE, Óleo de mamona hidrogenado etoxilado 40 OE
Inversão de fases: Agitação mecânica de 600 rpm / 75 °C
XAVIER (2014);
DUTRA; SANTOS (2016)
40
Extrato das cascas de R. ferruginea
Miristato de isopropila Óleo de mamona hidrogenado 40 EO Monooleato de sorbitano
Inversão de fases: Agitação agitação magnética a 25 ± 2° C por 24 h
DAL MAS (2014)
Óleo de Salvia hispanica L.
Óleo de mamona 15 EO Polissorbato 80 Sepigel® (Poliacrilamida, isoparafina C13-14 e éter láurico-7)
Inversão de fases Agitação a 1000 rpm
WENG (2015)
Bernardi et al. (2011) (Quadro 1) desenvolveram nanoemulsões contendo
óleo de farelo de arroz, como protótipo de tratamento de doenças de pele como
dermatite atópica e psoríase. Foi possível obter nanoemulsões estáveis pelo método
de emulsificação de baixa energia, e formulações com baixo potencial de
irritabilidade in vitro, e melhora da hidratação cutânea in vivo.
Guler et al. (2014) (Quadro 1) desenvolveram nanoemulsões do tipo
óleo/água e água /óleo a base de óleo de Nigella sativa enriquecido com extrato de
Calendula officinalis e nanopartículas de ouro revestidas com ácido lipóico (NP-Au),
respectivamente, evidenciando o efeito superior do nas nanoemulsões contendo
óleo enriquecido com extrato ou nanopartículas, superior às nanoemulsões sem o
extrato ou NP-Au.
Ha et al. (2015) (Quadro 1) desenvolveram nanoemulsões contento extrato de
tomate rico em licopeno, visando preservar a atividade antioxidante e melhorar a
biodisponibilidade do ativo. Os autores avaliaram o efeito da condição de
homogeneização e técnica de emulsificação-evaporação do solvente, sobre as
características físico-químicas do sistema. A maior eficiência quanto a atividade
antioxidante foi proveniente das formulações com tamanho de gotícula entre 100 e
200 nm.
Zorzi et al. (2015) (Quadro1) avaliaram o efeito antioxidante de nanoemulsões
à base de extrato de Achyrocline satureioides (Lam) DC-Asteraceae, como uma
alternativa para formulação tópica contento o extrato etanólico, uma vez que a
aplicação direta do extrato não seria possível. Este estudo desenvolveu
nanoemusões com tamanho médio de gotícula entre 200-300 nm, PDI < 0,2 e
potencial zeta de -43,6 MV, as quais apresentaram-se eficientes para aplicação
41
tópica desejada.
Ribeiro et al. (2015) (Quadro 1) realizaram estudo de estabilidade preliminar e
acelerado aplicado ao desenvolvimento de sistemas nanoemulsionados contendo
extrato hidroglicólico de Opuntia ficus-indica (L.), avaliando a sua eficácia quanto a
hidratação cutânea. As formulações foram estáveis durante os testes preliminares e
acelerados, com pH 4,5-6,0, compatível com o pH da pele, tamanho de gotícula
entre 92,2-233,6 nm, PDI próximo a 0,2 e potencial zeta de -26,71 a -47,01 mV. As
nanoemulsões O/A contendo 1% de extrato de Opuntia ficus-indica (L.)
apresentaram estabilidade adequada durante 60 dias e promoveram aumento da
hidratação da pele por 5 h.
Muller (2013) (Quadro 1) desenvolveu e caracterizou sistemas
nanoemulsionados contento extrato de flores de A. cathartica a fim de avaliar o
potencial antioxidante das formulações. As formulações apresentaram-se como
nanoemulsões, microemulsões e cristais líquidos, sendo as nanoemulsões
caracterizadas com tamanho de gotícula menor que 500 nm, as quais apresentram
atividade antioxidante, porem com influência dos excipientes.
Dal Mas (2015) (Quadro 1) desenvolveu sistemas nanoemusionados contento
extrato mole das cascas de R. ferruginea e avaliou atividade anti-inflamatória tópica.
As formação de nanoemulsões foi confirmada pela análise do tamanho de gotícula a
qual foi de 47 nm, com PDI de 0,228, potencial zeta de -34,7 mV. Em relação a
atividade anti-inflamatória tópica, a formulação desenvolvida apresentou atividade
superior quando compara com creme convencional incorporado o extrato mole das
cascas de R. ferruginea.
Weng (2015) (Quadro 1) realizou estudo de desenvolvimento e estudo de
estabilidade de nanoemulsão contento ativo de origem natural (óleo de chia), a qual
apresentou-se com tamanho de partícula de 81,2 nm e potencial zeta de -18,1 mV.
Foi identificado o aumento do tamanho de gotícula, permanecendo porém, no limite
permitido (150,36 nm) no estudo de estabilidade, sem separação de fases e com os
aspectos organolépticos similares ao do início do estudo.
A aplicação de novas tecnologias ao desenvolvimento de produtos à base de
espécies vegetais, resulta num vasto potencial terapêutico a ser explorado. Contudo,
é notável que a investigação nesta área encontra muitos desafios, sobretudo para
elucidar a caracterização destes sistemas (SARAF, 2010).
42
3.4 Estudo de estabilidade
A estabilidade é definida como o tempo no qual um produto mantém, dentro
dos limites especificados e em todo seu período de utilização, as mesmas
propriedades e características que possuía no momento em que foi obtido. A
estabilidade depende de fatores relacionados ao próprio produto, fatores intrínsecos,
como a composição da forma farmacêutica, as propriedades físico-químicas dos
princípios ativos e excipientes, pH, as impurezas presentes, o tipo e as propriedades
dos materiais de embalagem e do processo empregado na sua obtenção. A
estabilidade também é influenciada por fatores relacionados ao ambiente, os fatores
extrínsecos, como temperatura, umidade, gases (oxigênio, dióxido de carbono) e luz.
O impacto dos fatores extrínsecos na estabilidade pode ser minimizado com o uso
de excipientes específicos, embalagens apropriadas e condições adequadas de
armazenamento (BRASIL, 2004).
O estudo de estabilidade, seja medicamento ou cosmético, deve expor o
produto a condições que acelerem mudanças passíveis de ocorrer durante o prazo
de validade, fornecendo informações sobre a estabilidade do produto no menor
tempo possível (BONTORIM, 2009; BRASIL, 2004; ISAAC et al., 2008).
Os parâmetros a serem avaliados durante o estudo de estabilidade devem ser
capazes de garantir a qualidade do produto e são divididos em parâmetros
organolépticos (aspecto, cor e odor) e de componentes da formulação. A sequência
sugerida de estudos (preliminares, acelerados e de prateleira) tem por objetivo
avaliar a formulação em etapas, buscando indícios que levem a conclusão sobre a
estabilidade. Por fim, a aprovação é dada, após um período determinado, quando
não se verificar nenhuma alteração nas propriedades já mencionadas (BRASIL,
2004).
No guia de estabilidade para cosméticos, recomenda-se submeter o produto
ao teste de centrifugação a 3.000 rpm, durante 30 min, antes de iniciar os estudos
de estabilidade. Considerado pela ANVISA, como teste de triagem, é eficiente para
pré-selecionar as emulsões que devem ser submetidas aos testes de estabilidade
acelerada e de prateleira (BRASIL, 2004). A centrifugação produz estresse na
amostra, simulando um aumento na força da gravidade, e mobilidade das partículas,
as quais poderão ser observadas na forma de precipitação, separação de fases,
coalescência entre outras (BONTORIM, 2009).
43
O estudo de estabilidade preliminar ou teste de curto prazo, segundo o guia
de estabilidade para cosméticos, é realizado através da utilização de condições
extremas de temperatura a fim de acelerar possíveis reações entre seus
componentes, os quais podem resultar em alterações nas características
organolépticas e/ou físico-química. A duração deste estudo é de aproximadamente
quinze dias e a periodicidade de avaliação das amostras pode variar, porém o usual
é que sejam avaliadas inicialmente, no tempo zero e durante todos os dias em que
estiverem submetidas às condições do estudo. Geralmente as amostras são
submetidas a ciclos alternados de resfriamento (refrigeradores) e aquecimento
(estufa) (BRASIL, 2004). É um estudo preditivo que pode ser empregado para
estimar o prazo de validade do produto. As formulações são submetidas a condições
menos extremas, como aquecimento, resfriamento, exposição a radiação luminosa e
a temperatura ambiente (SINKO, 2008).
O teste de estabilidade acelerada, segundo o guia de estabilidade de produtos
cosméticos, tem duração de noventa dias, porém pode ser estendido para seis
meses ou um ano, em função das características do produto a ser analisado. A
periodicidade da avaliação das amostras pode variar, porém o mais usual é que
sejam avaliadas inicialmente no tempo zero (24 h) e aos 7, 15, 30, 60 e 90 dias.
Caso o estudo se prolongue por mais tempo, recomendam-se avaliações mensais
até seu término (BRASIL, 2004).
Neste mesmo guia, os valores de temperatura, geralmente adotados, para
realizar esses testes são 37 °C, 40 °C, 45 °C ou 50 ± 2 °C, para temperaturas
elevadas. Para baixas temperaturas, emprega-se geladeira 5 ° ± 2 °C ou freezer –5
± 2 °C ou –10 ± 2 °C. Para os ciclos de 24 h, usa-se alternar as temperaturas de 40
± 2 °C e 4 ± 2° C a cada 24 h (BRASIL, 2004).
O protocolo para o estudo de estabilidade para medicamentos é guiado pela
Resolução - RE nº 1, de 29 de julho de 2005, que indica as condições de
temperatura e umidade, nas quais a amostra deve ser mantida para avaliar a
estabilidade. Estas condições variam conforme a forma farmacêutica, tipo de
embalagem, e condições normais de armazenamento, com a duração de doze
meses nas condições de longa duração e seis meses para estabilidade acelerada.
Para as formas farmacêuticas líquidas, quando armazenadas em embalagem
impermeável, entre 15 a 30 °C, são preconizadas as condições para o estudo de
estabilidade a temperatura de 40 °C ± 2 °C, no estudo de acelerado e a 30 °C ± 2 °C
44
no estudo de longa duração. Se as condições de armazenamento forem de 2 a 8 °C,
então o estudo deve ser conduzido a 25 °C no estudo acelerado e a 5 °C no de
longa duração (BRASIL, 2005).
3.5 Rapanea ferruginea
A espécie Rapanea ferruginea apresenta sinônimias como Myrsine floculosa,
Myrsine coreacea e Gaballeria ferruginea (LORENZI, 1992; LORENZI, 2000).
Recentemente, características botânicas reclassificaram esta espécie, que passou
da família Myrsinaceae para a Primulaceae (FREITAS; KINOSHITA, 2015).
O gênero denominado Rapanea é representado morfologicamente por
árvores de pequeno a médio porte, folhas simples alternadas no caule, encontrado
perto de áreas litorâneas (LORENZI, 2000). A R. ferruginea é uma espécie
pantropical e possui ampla distribuição pelo território brasileiro, nos estados da
Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa
Catarina e Rio Grande do Sul, bem como em outros países da América do Sul como
a Bolívia, México, Argentina, Paraguai e Uruguai (SPATHELF et al., 2001).
A R. ferruginea, representada na Figura 4, é popularmente conhecida como
canela-azeitona, azeitona-do-mato, camará, capororocaçu, capororoca-vermelha,
pororoca, capororoca, capororoca-mirim. É uma árvore de pequeno a médio porte
(Figura 4), floresce duas vezes ao ano e ocorre em quase todas as formações
vegetais, preferencialmente nas encostas e beiras de córregos. Os frutos são
pequenos (Figura 4), geralmente com 3-5 mm diâmetro, globulosos e de coloração
negro-arroxeada quando maduros, apresentando uma única semente e um
pericarpo delgado (PASCOTTO, 2007). Os frutos maduros são produzidos
anualmente em grande quantidade, possuem alto poder de germinação e servem de
alimento para diversas aves (SPATHELF et al., 2001).
45
Figura 4: Imagem da Rapanea ferruginea e frutos.
Fonte; ZERMIANI, 2015 Fonte: KUHLMANN, 2012
Plantas da família Myrsinaceae são conhecidas por apresentar inúmeras
propriedades farmacológicas interessantes, como atividades anti-inflamatória,
antiviral, antitumoral, citotóxica e leishmanicida (AL-MEKHLAFI et al., 2012).
Com relação aos aspectos farmacológicos do gênero Rapanea, os extratos e
seus compostos isolados possuem comprovada ação anti-inflamatória (MANGURO
et al., 2003; MIZUSHINA et al., 2000), citotóxica (CORDERO et al., 2004),
antinociceptiva (MOMTAZ; LALL; BASSON, 2008), antioxidante (MAKABE et al.,
2003), anti-tuberculose (LALL; MEYER, 1999), entre outras.
Pesquisas com a Rapanea ferruginea, conduzidas no Núcleo de
Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) – UNIVALI, tem mostrado
resultados promissores com extratos ou compostos isolados das partes aéreas, nos
últimos dez anos.
A espécie R. ferruginea apresenta uma concentração significativa de ácidos
benzoicos prenilados, conforme evidenciado nos primeiros trabalhos do grupo, a
partir de 2006 (HESS, 2006), com o isolamento ácido mirsinoico B (AMB) das cascas
do caule, e posteriormente, do ácido mirsinoico A (AMA) dos frutos (GAZONI, 2009).
Estes ácidos apresentam-se como os principais componentes do metabolismo
secundário desta espécie (Figura 5). O AMA é um composto fenólico encontrado
principalmente nos frutos, enquanto o AMB está em maior concentração em outras
partes da R. ferruginea, como nas cascas (Figura 5) (COSTA, 2011).
46
Figura 5: Estrutura química dos ácidos mirsinoicos A e B, respectivamente.
Fonte: XAVIER, 2014
Por meio de procedimentos cromatográficos com o extrato etanólico das
folhas e cascas dos caules da R. ferruginea, Gazoni (2009) isolou além do AMB, o
espinasterol, um ácido graxo de cadeia longa e um álcool de cadeia longa, e do
extrato etanólico dos frutos, isolou-se o AMA. Ambos os ácidos mirsonoicos e
espinasterol mostraram atividade anticolinesterásica (GAZONI, 2009).
Adicionalmente, estudos in vitro, utilizando tecidos cerebrais de ratos, demonstraram
que o AMA apresentou atividade superior ao AMB em todos os tecidos cerebrais,
revelando-se um composto promissor para melhora da transmissão colinérgica,
obtido de fontes naturais (FILLIPIN, 2010).
A atividade antitumoral e a citotoxicidade dos extratos etanólicos das cascas,
galhos, folhas e frutos bem como os compostos isolados da R. ferruginea (AMA,
AMB, AMC e derivados de AMB) foram investigadas por meio de ensaios in vitro e in
vivo de crescimento tumoral. Todos os compostos apresentaram níveis significativos
de citotoxicidade em concentração de 100 μg/mL para algumas das linhagens
celulares testadas, indicando a espécie como fonte promissora para o
desenvolvimento de moléculas bioativas frente às células tumorais (TOMIO, 2011).
Em estudos realizados com extrato diclorometano dos frutos da R. ferruginea
e com seus compostos isolados (AMA e AMB) sobre a memória de animais normais
e animais com doença de Alzheimer induzida, foi possível constatar melhora da
cognição nos animais tratados com o extrato de R. ferruginea, podendo estar
relacionada com a atividade farmacológica dos compostos isolados AMA e um
triglicerídeo não-identificado (TGL) (COSTA, 2011).
A avaliação da atividade antioxidante dos extratos etanólicos das cascas e
47
frutos e dos compostos isolados (AMA, AMB e AMC) da R. ferruginea foi realizada,
empregando os métodos radicalares indiretos: ORAC (capacidade de absorção do
radical oxigênio); DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina); ABTS+.(2,2‘-azino-bis-(3-
etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico); quantificação de fenólicos totais e teste de
quelação de metais. Os resultados demonstraram que tanto os extratos como os
compostos isolados apresentam potencial antioxidante significativo na concentração
de 10 μg/mL (BARRETTA, 2011).
Quadro 2: Relação entre os compostos isolados e atividade farmacológica da R. ferruginea.
Parte da Planta
Composto / Tipo de extrato
Atividade Modelo Referência
Cascas dos caules
AMB composto isolado
Antinociceptiva in vivo HESS (2006)
Frutos, folhas e
cascas dos caules
AMA, AMB, espinasterol/extrato
etanólico Anticolinesterásica
Bioautográfico e in vitro
GAZONI (2009)
Frutos, folhas e
cascas dos caules
AMA e AMB/extrato
etanólico Anticolinesterásica In vitro FILLIPIN (2010)
cascas dos caules, folhas e frutos
AMA, AMB, AMC, derivados/extrato
etanólico
Citotóxica e antitumoral
In vivo e in vitro
TOMIO (2011)
Frutos
AMA e triglicerídeo (TGL) não
identificado/extrato diclorometano
Cognitiva In vivo e in
vitro COSTA (2011)
cascas dos caules e frutos
AMA, AMB, AMC/extrato
etanólico Antioxidante In vitro
BARRETTA (2011)
Frutos AMA /extrato
etanólico Anti-inflamatória In vivo SOUSA (2016)
Zermiani (2015) realizou estudo de caracterização física, química e físico-
química (solubilidade, ponto de fusão, pKa, log P, espectroscopia por infra-vermelho-
48
IV, no ultra-violeta-UV, RMN de 1H e 13C, pureza, umidade e testes de degradação
forçada) dos marcadores AMA e AMB, presentes nos frutos e cascas dos caules,
respectivamente, da R. ferruginea. Além disso, desenvolveu e validou metodologias
por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação dos
marcadores em extratos e nanoemulsões. A caracterização dos marcadores mostrou
que o AMA é muito pouco solúvel e o AMB pouco solúvel em metanol e acetonitrila.
Ambos foram praticamente insolúveis em água. O AMA apresenta-se como um óleo
e o AMB apresentou-se sólido, com uma estrutura semi-cristalina com estruturas
ortorrômbicas e amorfas por MEV. Os resultados obtidos nesse estudo em relação
ao conhecimento das propriedades físico-químicas, bem como os métodos validados
para determinação do teor de AMA e AMB nos extratos e em nanoemulsões,
contribuiu para o desenvolvimento, controle de qualidade e padronização de novos
fitofármacos e fitoterápicos.
A padronização dos extratos obtidos dos frutos teve início com o trabalho de
Krachinski et al. (2014), resultando no desenvolvimento e otimização de soluções
extrativas hidroalcoólicas e extratos moles, a partir de diferentes graus alcoólicos,
tempo de extração e relação droga:solvente. O teor de marcadores (ácido mirsinoico
A - AMA) foi proporcional ao grau alcoólico. A otimização da extração indicou o
álcool 90ºGL ou 95% P.A como melhor sistema solvente, sendo apenas dependente
da relação droga:solvente. Apenas os extratos obtidos com o álcool 95% P.A. (10h/
5% planta:solvente; 5h/ 10% planta solvente) não foram citotóxicos in vitro, segundo
a avaliação da viabilidade celular por MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazólio]). Os extratos corroboraram a atividade antioxidante pelo método
DPPH, já relatada por Barreta (2011) e Xavier (2014), sendo proporcional ao grau
alcoólico, e consequentemente ao teor de AMA.
O desenvolvimeto de nanoemulsões contendo extrato dos frutos da R.
ferruginea teve incío com o trabalho de Xavier (2014), Santos e Dutra (2016), que
realizaram as etapas de seleção do óleo para incorporação do extrato mole dos
frutos da R. ferruginea. Estes estudos prévios cuminaram na seleção do óleo
triglicerideo de ácidos cáprico e caprílico, no sistema tensoativo, e na melhor
condição de emulsificação para nanoemulsão contento extrato mole dos frutos de R.
ferruginea, descritos a seguir. A determinação da fase oleosa foi através da
avaliação da solubilidade do extrato mole da R. ferruginea em diferentes óleos,
sendo eles o gérmen de trigo, a vaselina líquida, os triglicerídeos do ácido cáprico e
49
caprílico, o oleato de isodecila e o óleo de silicone. O EHL requerido pela fase
oleosa foi estabelecido, testando-se um sistema binário de tensoativos hidrofílico
(polissorbato 80, com EHL 14,9) e lipofílico (monoestearato de sorbitano, com EHL
4,3), com valores de EHL entre 6 e 11, monoestearato de sorbitano, polissorbato,
óleo de mamona etoxilado 15 OE (óxido de eteno), óleo de mamona etoxilado 54 OE
e óleo de mamona hidrogenado etoxilado 40 OE. Quanto aos métodos de
emulsificação, as variáveis testadas incluíram as condições de agitação e
temperatura para a incorporação do extrato. O sistema tensoativo escolhido foi
composto por monoestearato de sorbitano e óleo de mamona hidrogenado etoxilado
40 OE, com EHL 11, usando o método de emulsificação de baixa energia, com
agitação mecânica a 600 rpm, temperatura de 75 °C, com a adição do extrato na
fase oleosa, sem o polímero espessante.
Xavier (2014) deu continuidade ao desenvolvimento, aplicando o diagrama
ternário para selecionar a proporção de óleo, tensoativo e água, que resultasse em
nanoemulsões estáveis. Nesse estudo, foram obtidos sistemas nanoemulsionados
(SNE), caracterizados por microscopia de transmissão eletrônica, tamanho médio de
gotículas e potencial zeta. Dentre eles, foi selecionado para o estudo de estabilidade
o SNE, contendo 1% de extrato mole dos frutos de Rapanea ferruginea, 10% de
tensoativos (Ultramona® e Span®), 5% de Polymol®, 0,5% de conservante com um
tamanho médio de gotícula de 10 nm. O estudo de estabilidade mostrou que ocorre
uma tendência ao aumento de tamanho de fase interna e indício de contaminação
microbiológica ao final de 90 dias. Quanto aos indicadores de atividade e segurança
biológica, a formulação foi avaliada quanto a atividade antinociceptiva via oral,
revelando-se mais potente que o extrato e AMA isolado, na dose de 100 mg/kg, em
camundongos. Porém, o SNE apresentou irritação moderada pelo teste de agarose
overlay, provavelmente atribuída à composição rica em tensoativos da formaulçao,
uma vez que o extrato mole não mostrou irritação no mesmo teste.
Custodio Junior (2016) avaliou a estabilidade física, química e microbiológioca
da nanoemulsão desenvolvida por Xavier (2014), contendo extrato dos frutos verdes
da R. ferrugínea. O estudo de estabilidade foi realizado em três temperaturas
diferentes 40 ºC, 30 ºC e 5 ºC ± 2ºC, durante 60 dias com amostragens em 0 (24 h),
45 e 60 dias. Os sistemas nanoemulsionados demonstraram valores de pH, tamanho
de gotícula , PDI e potencial zeta entre tempo zero (24h) e 90 dias com variações
entre 5% e 10%, mantendo-se relativamente estáveis neste período. O teor de AMA
50
mostrou-se estável nos diferentes ambientes com oscilações menores do que 10%
no período de 45 dias..
Sousa (2016) avaliou as propriedades anti-inflamatórias da Rapanea
ferruginea in vivo, utilizando o modelo de bolsa de ar, tratados com extrato mole dos
frutos da R. ferruginea, via oral,nas doses de 3, 30 e 300 mg/kg e nanoemulsões
contendo este extrato nas doses de 3, 30 e 100 mg/kg. A formulação de NE avaliada
por Sousa (2016) foi desenvolvida por Xavier (2014), contendo 1% de extrato mole
dos frutos de Rapanea ferruginea, 10% de surfactante (Ultramona® e Span®), 5% de
Polymol®, 0,5% de conservante com um tamanho médio de gotícula de 10 nm. O
extrato e a nanoemulsão inibiram a migração de leucócitos e neutrófilos para a
cavidade formada. No entanto, a nanoemulsão nas doses de 30 e 100 mg/kg
apresentou maior atividade anti-inflamatória que o extrato. Os resultados sugerem
que o extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea possui atividade anti-
inflamatória e que a formulação de nanoemulsão potencializou a atividade anti-
inflamatória.
O mesmo sistema nanoemulsionado desenvolvido por Xavier (2014) contendo
extrato etanólico dos frutos de R. ferruginea, foi avaliado quanto ao efeito sobre a
memória de animais normais e com Doença de Alzheimer (DA) induzida por
peptídeo amiloide Aβ1-42. Este estudo foi realizado por Cazarin e Brandalise (2016),
que avaliaram a nanoemulsão como veículo para o extrato, levando em conta o
efeito anteriormente comprovado sobre a atividade cognitiva para o extrato e
compostos isolados (COSTA, 2011). A avaliação do desempenho motor foi feita
utilizando o modelo de Open Field. Os animais com DA induzida foram tratados por
sete dias com NE de R. ferruginea nas doses 0,1, 0,5 e 1,0 mg/Kg e veículo (salina)
e submetidos a diferentes modelos de memória. Resultados obtidos mostraram que
o tratamento com a NE produziu efeito nootrópico em animais normais e com DA,
sem afetar o sistema motor, apontando a R. ferruginea como potencial insumo
farmacêutico ativo vegetal para a DA (CAZARIN; BRANDALISE, 2016).
Todos estes estudos relacionados às promissoras propriedades
farmacológicas do extrato dos frutos e compostos isolados, bem como os problemas
relacionados a estabilidade dos mesmos, tem motivado o seguimento das
pesquisas, empregando a nanotecnologia como plataforma tecnológica no
aprimoramento da performance dos produtos obtidos.
51
3.6 Inflamação e resposta inflamatória
A inflamação é um processo patofisiológico que ocorre em resposta a um
agente lesivo por meio da ativação de resposta imune humoral e celular. A
exposição a um patógeno induz a migração de células circulantes, que são
direcionadas pela produção de substâncias quimiotáticas no sítio de lesão
(CRUVINEL et al., 2010; HEADLAND; NORLING, 2015; NOURSCHARGH; ALON,
2014). O processo inflamatório tem como principal objetivo a resolução da infecção
ou reparação ao dano tecidual, com estabelecimento do estado de homeostasia
(BARTON, 2008; JONES et al., 2016; SOSA et al., 2002; SUGIMOTO et al., 2016).
Em decorrência da instalação do processo inflamatório, a área inflamada que
apresenta sinais clínicos como rubor, calor, edema, dor e prejuízo funcional
(CRUVINEL et al., 2010).
As células do sistema imune em conjunto com mediadores químicos
secretados desenvolvem a resposta de defesa contra micro-organismos infecciosos
ou substâncias estranhas. A capacidade migratória das células do sistema imune,
permite a interação entre o sangue periférico, a circulação linfática e os tecidos, o
que é de fundamental importância para formação de resposta imune inata e
adaptativa, bem como a inflamação (ABBAS et al., 2011).
A inflamação pode ser classificada como aguda e crônica, sendo a inflamação
aguda relativamente de curta duração, caracterizada por vasodilatação, exsudação
plasmática e migração de células. Dentre estas, o neutrófilo é a primeira célula em
alcançar o foco inflamatório, desta forma, desempenha um papel crítico no processo
inflamatório. Os neutrófilos estão em maior número no sangue periférico de
humanos, o que permite que sua locomoção em maior número e velocidade para o
foco de lesão, sendo esta fase parte da resposta imune inata (KIM; LUSTER, 2015).
A inflamação crônica, por sua vez, é caracterizada por um tempo de resolução
prolongado e até mesmo sem resolução, onde a inflamação está ativa e a destruição
e a reparação tecidual ocorrem simultaneamente, apresentando histologicamente
infiltração de células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos) e fibrose
tecidual (JONES et al., 2016; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; SUGIMOTO
et al., 2016 ).
A inflamação pode induzir, manter ou agravar muitas doenças devido a sua
complexidade e o envolvimento de mediadores inflamatórios (SOSA et al., 2002).
52
Além disso, a inflamação é o processo de base de diferentes doenças, como
doenças cardiovasculares, neurológicas, câncer, diabetes, entre outras (MÓCSAI;
WALZOG; LOWELL, 2015), o que evidencia a importância do conhecimento
molecular e celular do processo inflamatório nas diferentes patologias, bem como a
busca por fármacos com propriedade anti-inflamatória.
A resposta inflamatória gerada pelo sistema imunológico tem a finalidade de
remover o estímulo indutor da resposta e iniciar a recuperação tecidual do local
agredido (CRUVINEL et al., 2010; JONES et al., 2016; ORTEGA-GÓMEZ;
PERRETTI; SOEHNLEIN, 2013; SUGIMOTO et al., 2016). A resposta inflamatória
tem início imediatamente após o dano, quando as células residentes do tecido
lesado são estimuladas e a fase vascular é iniciada, havendo a vasodilatação local e
aumento da permeabilidade capilar, mediados por aminas vasoativas, como a
histamina e serotonina, liberadas por mastócitos e monócitos. Estes eventos
permitem que um exsudato rico em proteínas e água extravase para o espaço
extravascular. Além disto, o endotélio ativado passa a expressar moléculas de
adesão de superfície que favorecem a aderência e migração de leucócitos para o
tecido lesado. Também são ativados componentes do sistema complemento, de
cininas e de coagulação. Adicionalmente, os macrófagos residentes no tecido lesado
liberam citocinas inflamatórias, como IL-1β, TNF-α e quimiocinas, que facilitará de
maneira coordenada a migração de leucócitos para o foco inflamatório (CRUVINEL
et al., 2010; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
A mobilização leucocitária entre os diferentes compartimentos, medula óssea,
sangue periférico e tecido, é um evento fundamental para uma resposta imune
adequada. Durante o processo inflamatório, o tráfego de leucócitos é modificado e,
na maioria das vezes, o que se observa é a exacerbação do processo fisiológico,
para que os leucócitos se locomovam em maior número e com maior velocidade
entre os diferentes compartimentos para alcançarem o sítio de agressão. Neste
contexto, na reação inflamatória ocorre mobilização celular dos compartimentos de
reserva e recrutamento sequencial destas células no curso do processo – neutrófilos
seguidos pelas células mononucleares e eosinófilos (KOLACZKOWSKA; KUBES,
2013).
A migração leucocitária (Figura 6) acontece com a ativação do endotélio. As
selectinas permitem a adesão fraca dos neutrófilos, as integrinas promovem a
adesão forte e as quimiocinas ativam e estimulam a migração dos neutrófilos para o
53
foco inflamatório. Estas interações fazem com que os neutrófilos rolem pela parede
do vaso e sejam expostos aos fatores quimiotáticos. O gradiente quimiotático
crescente direciona a migração dos neutrófilos ao sítio inflamatório.
Simultaneamente a este processo, os mediadores lipídicos, derivados do ácido
araquidônico, também são produzidos em consequência da ativação de fosfolipases,
que clivam fosfolipídios constituintes da membrana celular, gerando prostaglandinas,
leucotrienos e PAF (fator de ativação plaquetária). Este processo se inicia com um
dano à membrana celular, que é constituída fundamentalmente por fosfolipídios.
Quando uma lesão afeta esta membrana, a enzima fosfolipase A2, presente nos
leucócitos e plaquetas, é ativada por citocinas pró-inflamatórias como a interleucina
IL-1. Esta enzima leva à degradação dos fosfolipídios, resultando na produção de
ácido araquidônico. Este, ao ser metabolizado, forma os leucotrienos, pela ação da
enzima lipooxigenase, e também forma prostaglandinas, prostaciclinas e
tromboxanos, pela ação da enzima ciclooxigenase (HILÁRIO; TERRERI; LEN, 2006;
MESQUITA Jr et al., 2008).
Figura 6: Mecanismos de migração dos leucócitos para o sítio inflamatório. (A) detalhe e (B) visão geral das etapas da migração: 1. Rolamento, 2. Ativação das integrinas, 3. Adesão estável e 4. Migração/diapedese.
Fonte: MESQUITA Jr et al. (2008).
54
Os neutrófilos são indispensáveis para a resposta do hospedeiro e
desempenham papel chave no sistema imune inato, já que respondem prontamente
a estímulos inflamatórios, com rápida mobilização da medula para o sangue, o que
permite rápida migração para a área lesada (DUCHENE et al., 2007; HAYHOE et al.,
2006; NATHAN, 2002).
Por muito tempo, os neutrófilos assumiram o papel de células efetoras da fase
aguda da resposta inflamatória, no entanto, o papel importante destas células na
fase de resolução do processo inflamatório e restabelecimento da homeostasia tem
sido demonstrado (JAILLON et al., 2013). A resolução do processo inflamatório é
importante para o retorno da homeostasia, pois limita a injúria excessiva do tecido e
previne o desenvolvimento de inflamações crônicas. Este processo ocorre
primeiramente com a supressão na liberação de mediadores pro-inflamatórios,
indução da secreção de mediadores anti-inflamatórios, incluindo IL-10 e TGF-1β,
liberação de enzimas proteolíticas e mediadores lipídicos. A mudança para um
ambiente anti-inflamatório facilita a apoptose dos neutrófilos, os quais são
fagocitados (eferocitose) por macrófagos residentes. Após a fagocitose, os
macrófagos são estimulados para a secreção de altos níveis de mediadores, como
as resolvinas, lipoxinas e sirtuinas (LEE; SURH, 2012; ORTEGA-GÓMEZ et al.,
2013).
55
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Droga vegetal
Frutos da R. ferruginea foram coletados, gentilmente pela profª Drª Angela
Malheiros, no município de Blumenau, Rua Belo Horizonte, Santa Catarina, Brasil
(Latitude: 26°97‘69,66‖ S, longitude: 49/06‘24,31‖ O e altitude: 200 m), em 18 de
agosto e 02 de outubro de 2014. Uma exsicata desta espécie está depositada no
Herbário Barbosa Rodrigues em Itajaí sob o código HBR 52715.
4.1.2 Reagentes e materiais
Acetato de etila P.A. ACS, Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;
Acetonitrila grau HPLC, J.T. Baker;
Ácido acético Glacial P.A., Biotec;
Ácido clorídrico P.A., Vetec Química Fina;
Ácido fosfórico, Merck® lote: K36616573641;
Ácido mirsinoico A (AMA), obtido por isolamento a partir dos frutos de R.
ferruginea no laboratório de Fitoquímica da Univali;
Ácido mirsinoico B (AMB), obtido por isolamento no laboratório de Fitoquímica
da Univali;
Ágar Salmonela Shigella (Ágar SS);
Ágar dextrose batata (PDA);
Ágar caseína de soja (TSA);
Ágar Violet Red Bile Dextrose (VRBD);
Ágar McConkey;
Água purificada obtida por sistema de purificação de osmose reversa,
Gehaka;
56
Água ultrapurificada, Barnstead – Easy pure LF;
Álcool etílico absoluto P.A. ACS, Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;
Alkest® CSO 400, Oxiten®;
Anisaldeído sulfúrico;
Caldo lactosado;
Cloridrato de Ketamina;
Cloridrato de Xilazina;
Cromatoplacas de sílica gel 60 GF 254, 20 μm de espessura, Merck®;
DMSO (dimetilsulfóxido) P.A., Dinamica;
EDTA dissódico, Merck;
Filtros de membrana de celulose (0,45 μm), Millex®;
Filtros de membrana de celulose (47 mm x 0,45 μm), Sartorius Stedim®;
Hexano (mistura de isômero) P.A., Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;
Indometacina, Fagron;
Liquido de Turk;
Meio DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium), Cultilab;
Metanol grau HPLC, J.T. Baker;
Phenonip® (Phenoxietanol parabenos), Pharma Special;
Polymol® (Triglicerídeos do ácido cáprico e caprílico), Mapric Produtos
Farmacosméticos;
Salina 0,9%;
Span 80® (monooleato de sorbitano), Sigma-Aldrich;
Tampão fosfato;
Tampão salina fosfato;
Ultramona RH400® (óleo de mamona etoxilado hidrogenado a 40 mols de
óxido de eteno OE), Oxiteno.
4.1.3 Equipamentos
Agitador magnético (Constant Temperature Magnetic Stirrier) – 78HW-1
(Vertex);
Agitador mecânico – 713D (Fisatom);
Agitador de tubos Vortex – QL-901 (Biomixer);
57
Autoclave vertical (Phoenix);
Balança analítica – AY220 (Shimadzu);
Balança analítica– AG204 (Mettler Toledo);
Balança analítica (Denver Intrument);
Balança analítica (Ohaus – Precision Plus);
Balança analítica – 250A (UMark);
Balança digital – AS2000 (Marte)
Bomba de vácuo;
Banho de ultrassom- USC 5000 (Unique);
Banho de aquecimento com circulação – MA159 (Marconi);
Cabine de Fluxo Laminar (Veco);
Câmara de Neubauer;
Centrífuga – Z300 (Hermle);
Centrífuga excelsa baby II – 206-R (Fanem);
Chapa de aquecimento (Fisatom);
Chapa de aquecimento (Ética);
Coluna Kinetex C18(150 X 4,6 mm X 2,6m);
Compressor aspirador FANEM – 089-CAL;
Conjunto de tamises (Bertel);
Cromatógrafo (CLAE) com bomba (LC-20AT) (Shimadzu);
Cromatoplacas de sílica gel 60 F254 (Merck);
Destilador de água – MA-255 (Marconi);
Espectrofotômetro UV - Vis UV-1601PC (Shimadzu);
Estufa – 316B25 (Quimis);
Estufa CO2 (Ultra-Safe);
Estufa de cultura/controlador microprocessado – 502C (Fanem);
Geladeira – 280 L (Consul);
Incubadora de Bancada – 400 (Gefran);
pHmetro – DM 20 (Digimed) ;
Moinho – MA085 (Marconi);
Mufla – 318D24 (Quimis);
Rota-evaporador - E5CSZ (Omron – Fisatom)
Rota-evaporador – TE-211 (Tecnal);
Sensor SV-DIN;
58
Sonicador ultra Cleaner – 800 A (Unique);
Tecidos Sontara® (Dupont);
Termocontrolador Haake® DC30;
Viscosimetro rotacional UT 550 Haake®;
Zetasizer Nano ZS – Zen3600 (Malvern Instruments).
4.2 Métodos
4.2.1 Tratamento da droga vegetal
Após recebimento, os frutos foram separados dos caules, pesados, e
mantidos em bandejas na sala de secagem, para secagem no período de uma
semana. Após as etapas de triagem e secagem, os frutos foram moídos em moinho
de martelos com abertura de malha de 1 mm.
4.2.2 Caracterização da droga vegetal
4.2.2.1 Análise granulométrica
Cerca de 25,0 g da droga vegetal triturada foram submetidos à passagem por
tamises, com aberturas de malhas de diferentes tamanhos (0,150; 0,250; 0,500;
0,850; 1,40; 2 mm). A tamisação foi realizada a 50 vibrações por segundo, durante
15 min. Em seguida, as frações retidas nos tamises e no coletor foram pesadas.
(BRASIL, 2010). Esta análise foi realizada em duplicata. Os resultados foram
representados pela porcentagem retida em cada tamis e tamanho médio de
partículas, segundo as equações 1 e 2.
59
(1) (2)
Onde: P1= peso da amostra retida em cada tamis (g); P2= soma dos pesos retidos
em cada tamis e no coletor (g); 100 = fator de porcentagem.
Onde dmédio = diâmetro médio aritmético (mm); AM = abertura média de malha (mm)
e a Fr% = fração retida percentual em cada tamis.
4.2.2.2 Perda por dessecação
Cerca de exatamente 1,0 g da droga vegetal foi transferida e distribuída
uniformemente em cadinho, previamente dessecado em estufa a 105 °C por 2 h. Em
seguida, o cadinho contendo a amostra foi colocado em estufa a 105 °C por 2 h.
Após este tempo, o cadinho foi resfriado à temperatura ambiente em dessecador e
pesado. O procedimento foi repetido por períodos de 30 min de secagem até peso
constante, para cálculo da porcentagem de perda por dessecação da amostra em
relação à droga inicialmente pesada. Os resultados representam a média de três
determinações (BRASIL, 2010)
4.2.2.3 Determinação de cinzas totais
Cerca de exatamente 3,0 g da droga vegetal foram transferidos e distribuídos
uniformemente em cadinho, previamente dessecado em estufa a 105 °C por 2 h. As
amostras foram incineradas aumentando gradativamente a temperatura, até que
todo o carvão fosse eliminado. O gradiente de temperatura usado foi 30 min a 200
°C, 60 min a 400 °C e 90 minutos a 600 °C. Após este tempo, o cadinho foi resfriado
à temperatura ambiente em dessecador, e pesado para cálculo da sua porcentagem
em relação à droga seca ao ar (BRASIL, 2010).
60
4.2.2.4 Determinação de cinzas insolúveis em ácido
Após a determinação das cinzas totais, o resíduo obtido foi fervido durante 5
minutos com 25 mL de solução de ácido clorídrico a 7% em cadinho coberto com
vidro de relógio. Após, o vidro de relógio foi lavado com 5 mL de água quente,
juntando esta água ao cadinho com resíduo. O resíduo insolúvel em ácido foi retido
sobre papel de filtro isento de cinzas, lavando-o com água quente até que o filtrado
se tornasse neutro. O papel de filtro contendo o resíduo foi transferido para o
cadinho original, seco sobre chapa quente e incinerado em mufla, a cerca de 500 ºC
por 2 horas, até peso constante. A porcentagem de cinzas insolúveis em ácido foi
calculada em relação à droga seca ao ar (BRASIL, 2010).
4.2.3 Obtenção da solução extrativa e extrato mole
A solução extrativa foi preparada na proporção planta/solvente 5% (m/V),
empregando como solvente etanol 95% P.A, pelo método de maceração dinâmica,
em agitador mecânico na velocidade de 300 rpm, à temperatura ambiente, durante 5
h, conforme estabelecido em estudos anteriores (KRACHINSKI, 2014; XAVIER,
2014) A solução extrativa foi filtrada em papel filtro qualitativo, em filtro de Büchner
acoplado à bomba a vácuo, acondicionada em frasco de vidro âmbar e armazenada
à temperatura ambiente. Para obtenção do extrato mole, a solução extrativa foi
submetida ao aquecimento em banho de água a 50 °C em rotaevaporador, com
auxílio de vácuo, até evaporação máxima do solvente em sistema à vácuo,
permanecendo em aquecimento em banho de água a 45 ºC até alcançar o mínimo
de 70% de sólidos.
4.2.4 Caracterização dos derivados vegetais (solução extrativa e extrato mole)
4.2.4.1 Determinação do Ph
Para determinação do pH, as amostras foram medidas a 25 ºC em
potenciômetro previamente calibrado com soluções tampão fosfato pH 7,0 e acetato
61
pH 4,0. A leitura do pH das soluções extrativas foi realizada de forma direta, sem
previa diluição. Para a leitura do pH do extrato mole foi realizada diluição do extrato
em etanol 95% P.A, na concentração de 1% (m/V), com agitaçãoo em banho de
ultrassom por 15 min.
4.2.4.2 Determinação do resíduo seco
Cerca de exatamente 2,0 g da amostra de solução extrativa ou 0,2 g de
extrato mole foram pesados em cadinho de porcelana previamente dessecado a 105
ºC por 2 h. As amostras foram levadas a secura sobre chapa de aquecimento. Após
evaporação do solvente, as amostras foram dessecadas em estufa a 105 °C, por 4
h, resfriadas em dessecador e pesadas. O resíduo seco foi calculado e expresso em
% (m/m) (BRASIL, 2010).
4.2.4.3 Análise do perfil cromatográfico dos derivados vegetais por CCD
Na análise química qualitativa por CCD, foram utilizadas como fase
estacionária, cromatoplacas de sílica gel Merck® e uma mistura de hexano e acetato
de etila (6:4) como sistema eluente. Após eluição da amostra pela fase móvel, e
secagem da placa, a temperatura ambiente, a cromatoplaca foi visualizada com
câmara de UV em 254 nm, e revelada com anisaldeído sulfúrico, seguido de
aquecimento (COSTA, 2011). Foram aplicados com tubos capilares cerca de 20 µL
de cada amostra: solução extrativa, sem prévia diluição, extrato mole a 1%, em
etanol 95%; padrões de AMA e AMB (isolados), dissolvidos em acetona. Os
cromatogramas foram desenvolvidos de forma ascendente, em cubas saturadas com
o sistema eluente até a altura de aproximadamente 10 cm (XAVIER, 2014).
4.2.4.4 Quantificação dos marcadores por CLAE
As amostras de solução extrativa e extrato mole foram analisadas conforme
metodologia analítica desenvolvida e validada por Zermiani et al. (2016). A solução
62
extrativa foi diluída na proporção de 1:5 com metanol, e o extrato mole foi dissolvido
em etanol 95%, a 1 µg/mL, em triplicata. As soluções amostra foram filtradas em
membrana de 0,45 µm e injetadas no cromatógrafo. Para expressar o teor de AMA,
o valor lido no software em função da curva de calibração do AMA em g/mL foi
multiplicado pelo fator de correção (5) para as amostras de SE. O valor lido para a
análise do EM foi diretamente expresso sem fator de correção, pois a amostra foi
injetada a 1 mg/mL de EM. Para expressar o teor de AMA por grama de resíduo
seco, a concentração foi dividida pelo resíduo seco (g/mL), obtendo-se o valor em
mg de AMA por g de resíduo seco da solução extrativa ou extrato mole.
O software LC Solution® foi utilizado para registrar os cromatogramas e medir
as áreas dos picos. A detecção por varredura de espectro foi realizada na faixa de
comprimentos de onda entre 190 nm até 400 nm, sendo registrado o cromatograma
em 260 e 280 nm. A fase estacionária empregada foi uma coluna de fase reversa
Kinetex® C18 150 x 4,6 mm, com partículas core-shell com tamanho de 2,6 μm. A
fase móvel utilizada foi composta por acetonitrila (grau HPLC), metanol (grau HPLC)
e água acidificada com ácido fosfórico a pH 2,5. Os solventes solventes da fase
móvel foram filtrados a vácuo com membrana de celulose regenerada 47 mm de
diâmetro e 0,45 μm de porosidade e degaseificados em ultrassom. O método
gradiente está apresentado no Quadro 3.
Quadro 3: Gradiente empregado para análise das soluções extrativas de R. ferruginea.
Tempo (min) Acetonitrila (%) *H20 (%) Metanol (%)
0 5 70 25
2 5 70 25
5 30 45 25
10 60 15 25
12 70 5 15
15 84 1 15
25 84 1 15
30 5 70 25
35 5 70 25
*H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5
Fonte: (ZERMIANI et al., 2016).
63
4.2.5 Desenvolvimento dos sistemas nanoemulsionados
Xavier (2014) realizou estudo de pré-formulação e determinou a composição
de nanoemulsões, contendo como fase oleosa o Polymol® (triglicerídeos de ácido
cáprico e caprílico) (p/p%) e os tensoativos Span® 80 (monooleato de sorbitano) e
Ultramona® RH400 (óleo de mamona etoxilado hidrogenado a 40 unidades de óxido
de eteno - OE) (p/p%), e Phenonip® (fenoxietanol, metilparabeno, etilparabeno ,
propilparabeno, butilparabeno , isobutilparabeno) a 0,5% (p/p%) como conservante.
A partir das formulações descritas no quadro 2, desenvolvidas por Xavier
(2014), foram introduzidas variáveis para otimização do sistema, iniciando-se pelo
percentual de óleo e extrato mole, conforme descrito nos itens a seguir.
Quadro 4: Formulações desenvolvidas por Xavier (2014) e utilizadas como como referência no presente estudo.
Formulação
Óleo (% p/p)
Tensoativos (% p/p) Conservante (% p/p)
Extrato mole
(%p/p) Total Span Rh400
NE 1.1 15 10 3,16 6,84 0,5 BRANCO NE 1.2 15 10 3,16 6,84 0,5 1
NE 2.1
20 10 3,16 6,84 0,5 BRANCO
NE 2.2 20 10 3,16 6,84 0,5 1
*Os primeiros algarismos 1 e 2 correspondem a 15 e 20 % de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, e ―.2‖ correspondem a 0,5% de extrato mole.
O método selecionado para a preparação das nanoemulsões foi o de inversão
de fases por baixa energia (DUTRA et al., 2014). As amostras foram preparadas em
um total de 20 mL, por aquecimento em banho-maria a 75 ± 5 ºC das fases aquosa e
oleosa, separadamente. A fase aquosa foi gotejada sobre a oleosa contendo os
tensoativos e o extrato mole dos frutos de R. ferruginea, sob aquecimento e agitação
mecânica a 600 rpm. Após completa adição de água, o sistema permaneceu sob
agitação e aquecimento por mais 5 min. Decorrido este tempo, as emulsões foram
retiradas do banho-maria, mantendo-se a agitação com agitador mecânico por mais
5 min.
64
4.2.5.1 Influência da concentração de óleo e extrato
A partir do sistema nanoemulsionado desenvolvido por Xavier (2014), foram
propostas algumas variáveis de formulação. Inicialmente, foi avaliada a influência da
proporção óleo/tensoativo (p/p%), perfazendo três grupos de formulação (15/10%,
20/10% e 25/10%), frente ao percentual do extrato, em três níveis (0,5, 1 e 1,5%),
totalizando 09 formulações. Cada formulação foi produzida em duplicata, com e sem
o extrato mole. A composição das formulações, variando as proporções de óleo e
extrato mole dos frutos da R. ferruginea está descrita no quadro 5.
Quadro 5: Nanoemulsões (NE) contendo diferentes proporções de óleo e extrato mole dos frutos da R. ferruginea.
Formulação
Óleo (% p/p)
Tensoativos (% p/p) Conservante
(% p/p)
Extrato mole
(%p/p) Total Span Rh400
Gru
po
1
NE 1.1 15 10 3,16 6,84 0,5 Branco
NE 1.2 15 10 3,16 6,84 0,5 0,5
NE 1.3 15 10 3,16 6,84 0,5 1
NE 1.4 15 10 3,16 6,84 0,5 1,5
Gru
po
2
NE 2.1 20 10 3,16 6,84 0,5 Branco
NE 2.2 20 10 3,16 6,84 0,5 0,5
NE 2.3 20 10 3,16 6,84 0,5 1
NE 2.4 20 10 3,16 6,84 0,5 1,5
Gru
po
3
NE 3.1 25 10 3,16 6,84 0,5 Branco
NE 3.2 25 10 3,16 6,84 0,5 0,5
NE 3.3 25 10 3,16 6,84 0,5 1
NE 3.4 25 10 3,16 6,84 0,5 1,5
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente
65
No tempo zero (24 h), as formulações desenvolvidas foram avaliadas a partir
da visualização macroscópica e do teste de centrifugação a 3000 rpm por 30 min,
assim como o tamanho médio da fase interna, índice de polidispersão (PDI) e
potencial zeta. As formulações do quadro 5 foram mantidas em temperatura
ambiente e ao abrigo da luz, e novamente caracterizadas após 30 dias.
As formulações contendo o maior percentual de extrato (1,5%) foram
novamente produzidas, em duplicata, com e sem extrato mole (quadro 6)
acondicionadas em tubos de ensaio com tampa e submetida ao teste de estabilidade
preliminar (ciclo de 28 dias), como parâmetro de avaliação de comportamento das
formulações quando submetidas a diferentes temperaturas. As formulações foram
avaliadas no tempo zero (24 h) 14 e 28 dias por meio dos testes descritos no item
4.2.6, exeto análise da viscosidade e pequisa de contaminação microbiológica. As
NE foram ainda avaliadas no tempo zero(24 h) e 28 dias quando ao teor de AMA por
CLAE (item 4.2.6.4).
As condições do teste de estabilidade preliminar foram: 14 ciclos gelo-degelo
(40 ± 2 ºC – estufa / 5 ± 2 ºC – geladeira) a cada 24 h. Uma amostra de cada lote foi
mantida a 25 ± 2 ºC (temperatura ambiente) e outra a 5 ± 2 ºC (geladeira), sendo
estas amostras controle (BRASIL, 2004).
Quadro 6: Nanoemulsões (NE) contendo 1,5% de extrato, selecionadas para o estudo de estabilidade preliminar de 28 dias, variando o percentual de óleo.
Formulação
Óleo (% P/P)
Tensoativos (% p/p) Conservante
(% p/p)
Extrato mole
(%p/p) Total Span Rh400
Grupo 1
NE 1.1 15 10 3,16 6,84 0,5 Branco
NE 1.4 15 10 3,16 6,84 0,5 1,5
Grupo 2
NE 2.1 20 10 3,16 6,84 0,5 Branco
NE 2.4 20 10 3,16 6,84 0,5 1,5
Grupo 3
NE 3.1 25 10 3,16 6,84 0,5 Branco
NE 3.4 25 10 3,16 6,84 0,5 1,5
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole.
66
4.2.5.2 Influência da concentração do tensoativo
A formulação selecionada a partir do item 4.2.5.1, foi modificada elevando a
percentual de tensoativo para 15 e 20% (quadro 7). Todas as formulações foram
obtidas em duplicata, acondicionadas em tubos de ensaio com tampa e submetidas
ao novo teste de estabilidade preliminar, este por sua vez, um ciclo de 14 dias, como
parâmetro de avaliação do comportamento das formulações. As formulações foram
caracterizadas no tempo zero (24 h) 7 e 14 dias por meio dos testes descritos no
item 4.2.6 eceto análise da viscosidade e pequisa de contaminação microbiológica.
As NE foram ainda avaliadas no tempo zero (24 h) e 14 dias quanto ao teor de AMA
por CLAE (item 4.2.6.4 ).
As condições de análise para a estabilidade preliminar foi: 7 ciclos gelo-
degelo (40 ± 2 ºC – estufa / 5 ± 2 ºC – geladeira) a cada 24 h. Uma amostra de cada
lote foi mantida a 25 ± 2 ºC (temperatura ambiente) e outra a 5 ± 2 ºC (geladeira),
sendo estas amostras controle (BRASIL, 2004).
Quadro 7: Nanoemulsões (NE) selecionadas para o estudo de estabilidade preliminar de 14 dias, variando o percentual de tensoativos.
Formulação
Óleo (% P/P)
Tensoativos (% p/p) Conservante
(% p/p)
Extrato mole
(%p/p) Total Span Rh400
Gru
po
3
NE 3.1 – T 15 25 15 4,74 10,26 0,5 Branco
NE 3.4 – T 15 25 15 4,74 10,26 0,5 1,5
NE 3.1 – T 20 25 20 6,32 13,68 0,5 Branco
NE 3.4 – T 20 25 20 6,32 13,68 0,5 1,5
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.
4.2.5.2 Influência da concentração do conservante
A formulação selecionada a partir do item 4.2.5.1 foi modificada elevando o
percentual do conservante para 1 e 2% (quadro 8), a qual foi submetida ao estudo
67
de estabilidade acelerado. As formulações foram obtidas em duplicata e
acondicionadas em frascos de vidro âmbar. As condições de temperatura estudadas
foram 40 ± 2 °C (estufa), 5 ± 2 °C (geladeira) e 25 ± 2 °C (temperatura ambiente). As
avaliações foram realizadas no tempo zero (24 h), 30, 60 e 90 dias (BRASIL, 2004),
por meio dos testes descritos no item 4.2.6.
Nessa etapa do desenvolvimento as formulações foram ainda avaliadas
quanto a viscosidade no tempo zero (24 h), 30, 60 e 90 dias nas condições de
temperatura ambiente (estufa a 25 °C), estufa a 40 °C e geladeira a 5 °C.
Como análise complementar, a pesquisa de contaminação microbiológica foi
realizada no tempo zero (24 h) e após 9 meses com as formulações mantidas em
estufa a 40 °C. Os testes foram realizados conforme a Farmacopeia Brasileira
(BRASIL, 2010), tendo-se escolhido a condição mais crítica de armazenamento,
para testar o efeito do sistema conservante.
Quadro 8: Nanoemulsões (NE) contendo diferentes proporções de conservante.
Formulação
Óleo (% P/P)
Tensoativos (% p/p) Conservante
(% p/p)
Extrato mole
(%p/p) Total Span Rh400
NE 3.1 – T 15 (C1) 25 15 4,74 10,26 1,0 Branco
NE 3.4 – T 15 (C1) 25 15 4,74 10,26 1,0 1,5
NE 3.1 – T 15 (C2) 25 15 4,74 10,26 2,0 Branco
NE 3.4 – T 15 (C2) 25 15 4,74 10,26 2,0 1,5
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.
4.2.6 Caracterização dos sistemas nanoemulsionados desenvolvidos
Todas as amostras das formulações desenvolvidas foram caracterizadas,
sempre 24 h após o preparo, considerado tempo zero, e após os tempos
estabelecidos para os estudos de estabilidade preliminar e acelerado, em cada
condição de temperatura .Os testes descritos a seguir, foram aplicaos a todas as
amostras, exceto quando diferentemente especificado.
68
4.2.6.1 Características organolépticas (aspectos físicos)
As formulações foram analisadas quanto à cor, transparência, separação de
fases e cremeação. A separação de fases foi verificada por percepção direta, após
centrifugação a 3000 rpm por 30 min, conforme descrito no guia de estudo de
estabilidade de produtos cosméticos da ANVISA, para análise de sistemas
emulsionados (BRASIL, 2004).
4.2.6.2 Determinação do pH
A determinação do pH foi realizada com potenciômetro calibrado com
soluções de fosfato e acetato, pH 7,0 e 4,0, respectivamente. As amostras foram
diluídas 1:10 (g/mL) com água purificada.
4.2.6.3 Análise de tamanho médio de gotícula e PDI
O tamanho médio de fase interna, o índice de polidispersividade (PDI) e o
potencial zeta das formulações foram determinados pelo método de espalhamento
de luz dinâmico usando equipamento Zetasizer Nano ZS. As análises foram
realizadas em um ângulo de 90° e a temperatura constante (25 °C). As amostras
foram diluídas em água ultrapura na proporção de 1:100. Para o processamento de
dados das análises foi utilizado o software Dynamic Light Scattering versão 5.43.
4.2.6.4 Perfil cromatográfico e teor de AMA em CLAE
As amostras foram analisadas conforme metodologia analítica desenvolvida
por Zermiani et al. (2015), descrita no item 4.2.4.4.
Para as nanoemulsões submetidas à estabilidade preliminar e acelerada,
pesou-se exatamente cerca de 0,5 g das formulações em balão volumétrico de 5 mL,
no qual foi adicionado cerca de 2,5 mL de acetonitrila e colocado em ultrassom por
20 min. Foi completado o volume do balão, e a amostra foi centrifugada a 3000 rpm
69
por 10 min. O sobrenadante foi filtrado em membrana de celulose regenerada de
0,45 µm de porosidade e analisado em triplicata. Para análise do extrato mole, foi
preparada uma solução a 1 mg/mL de EM em metanol grau HPLC, a solução foi
filtrada nas mesmas condições citadas, e analisada em triplicata.
Esta etapa foi realizada com a colaboração da aluna de graduação Ana
Cristina Gon no laboratório de técnicas analíticas do Curso de Farmácia (UNIVALI).
4.2.6.4 Análise de viscosidade aparente da nanoemulsão
A análise de viscosidade foi realizada com 15 g de amostra, na temperatura
de 25 °C no viscosímetro rotacional VT 550 Haake® acoplado ao termocontrolador
Haake® DC30, utilizando o sensor SV-DIN e software Rheowin® 4 Data Manager
430.0013 e Rheowin® 4 Job Manager, avaliando-se os parâmetros de viscosidade e
o índice de fluxo, através do modelo da Lei da Potência. A analise foi realizada
variando-se a taxa de cisalhamento entre 6,5 a 100 s-1 (curva ascendente), seguido
de uma etapa intermediária, fixada em 100 s-1. A curva descendente variou de 100 a
6,5 s-1. Em cada uma das etapas foram coletados 100 pontos, perfazendo o total de
6 minutos. O modelo empregado para a determinação do fluxo foi o da Lei da
Potencia.
4.2.6.5 Pesquisa de contaminação microbiológica das nanoemulsões
Uma alíquota de 1,0 mL da NE foi transferida em cabine de segurança
biológica, com auxílio de espátula estéril, em frasco contendo 99 mL de tampão
fosfato (T.F) pH 7,2. O frasco foi homogeneizado e deixado em contato por no
mínimo 10 minutos. O mesmo procedimento foi realizado em frasco contento caldo
lactosado. Para as análises do estudo de estabilidade acelerado, cada NE foi
armazenada diretamente em frasco estéril, e colocada no ambiente estufa (foi
selecionado o pior caso sujeito a contaminação). As análises de contagem de
fungos, leveduras, bactérias foram realizadas pelo método em semeadura em
profundidade, com análise em duplicata.
70
A contagem de bactérias aeróbias foi realizada transferindo-se 1 mL das
diluições em tampão fosfato para as placas de Petri estéreis, nas quais foi
adicionado de maneira asséptica de 15 a 20 mL de ágar caseína de soja (TSA), a
45-50 °C, em cada uma das placas. As placas foram homogeneizadas com
movimentos leves e giratórios (sentido horário e anti-horário), e mantidas levemente
abertas próximas à chama no bico de Bunsen, até solidificar. As placas foram
incubadas (invertidas) em estufa bacteriológica a 35 ± 2 °C por 48 h.
A contagem de fungos e leveduras foi realizada transferindo-se 1 mL das
diluições em tampão fosfato para as placas de Petri estéreis, nas quais foram
adicionados de maneira asséptica de 15 a 20 mL de ágar dextrose batata (PDA),
resfriado a 45-50 °C a cada uma das placas. O meio foi homogeneizado nas placas
com movimentos leves e giratórios (sentido horário e anti-horário), e mantido
próximo a chama do bico de Bunsen, com a placa levemente aberta, até a
solidificação do meio. Após, foram incubadas na posição invertida em estufa
bacteriológica a 25 ± 2 °C por 5 a 7 dias.
A contagem de bactérias Gram Negativas foi realizada, transferindo-se uma
alíquota de 1 mL das diluições em caldo lactosado para as placas, nas quais foram
adicionados 15 mL do meio de cultura ágar VRBD. O meio foi homogeneizado nas
placas com movimentos leves e giratórios (sentido horário e anti-horário), e mantido
próximo a chama do bico de Bunsen, com a placa levemente aberta, até a
solidificação do meio. Após, foram incubadas na posição invertida em estufa
bacteriológica a 35 ± 2 °C por 48 a 72 h.
Todas as colônias foram contadas (tanto as de superfície como as de
profundidade) nas placas contento entre 30 e 300 colônias por placa para as
bactérias e 15 a 150 colônias para fungos e leveduras, e o resultado foi expresso em
UFC/mL ou g, segundo a equação 3.
(3)
Resultado = média n° de colônias x diluição da amostra (caso necessário)
Para a pesquisa de patógenos foi realizada inicialmente a fase de
enriquecimento da amostra, com uma diluição inicial feita em caldo lactosado,
incubando-se a 35 ± 2° C por 24 a 48 h. Como resultado foi observado a turvação da
71
amostra. Em caso de turvação, procedeu-se a fase seletiva para cada micro-
organismo.
Para a pesquisa de Escherichia coli e Salmonella, a amostra foi estriada, com
alça de platina, no caldo lactosado em 4 quadrantes nos meios ágar MacConkey e
ágar SS, o qual foi incubado a 35 ± 2 °C por 24 a 48 h. Foi observada a presença de
crescimento de colônias com morfologias característica do meio, e o resultado foi
expresso em presença ou ausência dos patógenos.
Esta etapa foi realizada com a colaboração do aluno de graduação do Curso
de Engenharia química, Odair José Custódio Junior e supervisão da Profa. Dra.
Josiane de Carvalho Vitorino, no laboratório de Controle Microrbiológico 310
.
4.2.7 Ensaio da atividade anti-inflamatória in vivo
A formulação com percentual de conservante a 1% (item 4.2.5.2) foi avaliada
quanto a atividade anti-inflamatória no tempo de 24 h (tempo zero) e após 90 dias, a
fim de monitorar a estabilidade do sistema quanto a sua ação farmacológica como o
passar do tempo.
4.2.7.1 Animais
Foram utilizados camundongos machos Balb/C pesando entre 25-30 g
provenientes do Biotério da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais
foram mantidos em caixas de polipropileno com enriquecimento ambiental (canos e
papeis), em salas com controle de temperatura (22-25 °C), umidade constante (60%)
e ciclos controlados (claro/escuro 12 h cada), tendo ração e água ad libitum. Como
agente anestésico foi utilizado cloridrato de ketamina 77 mg/kg + cloridrato de
xilazina, 7 mg/kg.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos
de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal (CONCEA), e após a aprovação do CEUA sob o parecer
número 044/15 (Anexo 1). Antes dos experimentos os animais foram mantidos
72
durante sete dias para ambientação no biotério do laboratório de farmacologia (209)
do bloco F6.
4.2.7.2 Droga e tratamento
Durante os experimentos, foram utilizadas as seguintes substâncias:
indometacina (controle positivo), extrato mole dos frutos da R. ferruginea, veículo do
extrato mole (salina 0,9% NaCl e DMSO – controle negativo EM), nanoemulsão com
extrato e sem extrato (controle negativo). As drogas foram dissolvidas em salina
0,9% NaCl e DMSO. As doses escolhidas tiveram por base os trabalhos anteriores
(HESS et al., 2010). A formulação selecionada para monitorar a atividade anti-
inflamatória, foi a mesma submetida ao estudo de estabilidade acelerada, apenas a
formulação com percentual de conservante a 1% (item 4.2.5.2). Os testes foram
realizados nos tempos de 24 h e 90 dias para as NE, com e sem extrato, em
temperatura ambiente (estufa a 25 °C).
4.2.7.3 Inflamação no tecido subcutâneo dorsal - bolsa de ar
Um compartimento estéril, denominado bolsa de ar, foi desenvolvido pela
administração de 3 mL de ar estéril no tecido subcutâneo da região dorsal dos
animais, os quais foram anestesiados previamente a este procedimento. Cinco dias
após a primeira injeção de ar, um reforço foi realizado pela injeção de 3 mL de ar
estéril, segundo procedimento descrito por Sedgwick (1986) e por Jain e Parmar
(2011).
Dez dias após a primeira injeção, os animais foram tratados por via oral com
extrato mole dos frutos de R. ferruginea nas doses de 3, 30 e 300 mg/kg,
indometacina (30 mg/kg), nanoemulsão do EM de R. ferruginea nas doses de 3, 30 e
100 mg/kg, nanoemulsão branca na dose de 100 mg/kg, ácido mirsinóico A (30
mg/kg) ou veículo. Adicionalmente, as nanoemulsões foram avaliadas ao final do
estudo de estabilidade, na dose que apresentou melhor atividade no tempo 0. Após
uma hora dos tratamentos, a carragenina 1% em volume final de 1 mL de solução
tamponada de fosfato (PBS), foi injetado diretamente na bolsa. Quatro horas mais
73
tarde, os animais foram anestesiados e uma pequena incisão foi realizada na bolsa
de ar para obtenção do lavado do infiltrado inflamatório, no qual foi determinado o
número de leucócitos. O número total de células no lavado da bolsa de ar foi
quantificado com auxílio da câmara de Neubauer, após diluição de 1:100 em Líquido
de Türk.
4.2.7.4 Análise estatística
Os resultados obtidos nos experimentos foram expressos em média ± erro
padrão da média (E.P.M.) e analisados estatisticamente por análise de variância
com comparações múltiplas (ANOVA) e, quando necessário, serão utilizados como
pós-teste o teste de Tukey-Kramer ou Dunett. Os dados foram analisados no
programa GraphPad Prism, admitindo como significativamente estatístico o p<0,05.
74
75
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal
Os frutos da Rapanea ferruginea podem ser coletados em diferentes estágios
de maturação. Neste trabalho a coleta ocorreu nos meses de agosto e outubro. Os
frutos foram coletados, em sua maioria ainda verdes, pela disponibilidade no
momento da coleta, uma vez que estes frutos são silvestres e consumidos pelos
pássaros quando maduros (SPATHELF et al., 2001). Cabe também salientar que
Xavier (2014) e Krackinski et al. (2014) verificaram que o grau de maturação não foi
determinante para os parâmetros avaliados como resíduo seco, pH e teor de AMA e
TGL nas soluções extrativas.
Nos trabalhos realizados com os frutos da espécie R. ferruginea, pelo grupo
de pesquisadores do NIQFAR, a coleta tem sido realizada sempre nestes mesmos
meses e local (COSTA, 2011; XAVIER, 2015).
Posteriormente os frutos foram submetidos ao processo de secagem. Este
consiste em retirar a maior parte de água existente nos órgãos vegetais (folhas,
flores, raízes, frutos), atuando na inativação enzimática que, por sua vez, paralisa o
metabolismo vegetal, que poderia degradar os metabólitos ativos da planta. A
quantidade elevada de água da planta recém-coletada pode propiciar o crescimento
de micro-organismos. Desta forma, a secagem tem por finalidade a manutenção da
integridade dos constituintes químicos e da qualidade microbiológica, por período de
tempo mais longo, e do seu potencial terapêutico. A planta medicinal fresca, após o
processo de seleção da parte usada e a secagem desta, dá origem ao que se
denomina droga vegetal (BRASIL, 2004; LEITE, 2009).
Nos compêndios oficiais e farmacopeias, não há monografias para a espécie
R. ferruginea. Desta forma os resultados obtidos nesse trabalho tornam-se
importantes para o conhecimento e caracterização da espécie, tendo-se como droga
vegetal os frutos da planta.
Os ensaios de controle de qualidade tem por objetivo avaliar as
características físicas, químicas e microbiológicas das matérias-primas, produtos em
processo e produto acabado. A verificação da conformidade das especificações
76
deve ser vista como um requisito necessário para a garantia da qualidade,
segurança e eficácia do produto, e não somente como uma exigência regulatória
(BRASIL, 2007).
Os ensaios de controle de qualidade realizados para amostras de origem
vegetal caracterizam-se principalmente em: determinação de água no material a ser
analisado (teor de umidade), e determinação de cinzas totais ou insolúveis (BRASIL,
2007). No presente estudo, os frutos foram mantidos em sala de secagem, com
controle de umidade, e armazenados em embalagens de papel pardo em estantes
de alumínios abertas, fora do contato com pisos e paredes, conforme recomendado
na literatura (LEITE, 2009). Os frutos estabilizaram após um período de uma
semana, tiveram perda por secagem de 73,88% (s = 0,45; DPR% = 0,60) em relação
ao peso inicial, calculada pela pesagem diária. Após a secagem, os frutos foram
moídos, os quais representam a droga vegetal.
A granulometria média foi 0,675 mm (s = 0,24, DPR% = 36,66) e a
distribuição granulométrica está apresentado na Figura 7. Mais de 60% da
granulometria da droga vegetal ficou compreendida entre os tamises com abertura
de malha de 0,85 e 1,4 mm. A classificação granulométrica deste pó aproxima-se de
um pó grosso, pois segundo a Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), as partículas
passam em sua totalidade pelo tamis com abertura nominal de malha 1,7 mm e, no
máximo, 40% pelo tamis com abertura nominal de malha de 355 µm. A
granulometria do material triturado é um parâmetro que influencia a eficiência e
reprodutibilidade do processo extrativo (MIGLIATO et al., 2007).
Figura 7: Distribuição granulométrica dos frutos secos e moídos da R. ferruginea.
77
A perda por dessecação das amostras foi 8,70% (s = 0,39, DPR% = 4,55),
dentro desses limites, demonstrando que a operação de secagem pós-colheita foi
efetiva.
A quantidade excessiva de água em drogas vegetais propicia o
desenvolvimento de micro-organismos, insetos, hidrólise e a consequente
deterioração dos constituintes da droga vegetal. Por isto, há necessidade de
estabelecimento de limites de umidade, cujo aceitável de umidade recomendado
pela Farmacopeia (BRASIL, 2010) para drogas vegetais varia de 6% a 16%,
determinado através de metodologias analíticas específicas e em drogas que
contém substancias voláteis como óleos essenciais, emprega-se o teste de perda
por dessecação (FISHER, 2007).
O teor de cinzas totais foi 2,73%(s = 0,06, DPR% = 2,37) e demonstram
valores relativamente baixos, indicando que há pouca presença de cinzas não
fisiológicas na droga vegetal.
A determinação de cinzas totais destina-se a estabelecer a quantidade de
substância residual não volátil no processo de incineração especificado. As cinzas
totais incluem as derivadas de tecido vegetal (cinzas fisiológicas) e de materiais
estranhos especialmente areia e terra aderente à superfície da droga (cinzas não
fisiológicas), que devem ser evitadas no tratamento do material (LEITE, 2009).
A porcentagem de cinzais insolúveis para as amostras teve uma média de
0,14% (s = 0,01, DPR% = 7,14) e indica o baixo índice de contaminação da droga
vegetal. A presença de altos teores de cinzas sulfatadas demonstra a presença de
cinzas não fisiológicas, proveniente de areia e terra, mostrando tratamento impróprio
durante colheita, secagem e armazenagem (LEITE, 2009).
As cinzas insolúveis compreende o resíduo não volátil à incineração na
presença de ácido sulfúrico. Esta análise visa determinar o teor de impurezas
inorgânicas contidas na droga vegetal (LEITE, 2009). Estas análises indicam baixo
índice de contaminação, resultado este já esperado, visto que os frutos ficam
suspensos nas árvores não estando em contato direto com terra ou areia.
Os resultados de obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal
assemelham-se ao estudo anterior de caracterização dos frutos da R. ferruginea
(XAVIER, 2014).
78
5.2 Caracterização da solução extrativa e extrato mole
Neste trabalho, foi preparado primeiramente a solução extrativa a qual deu
origem ao extrato mole, os quais foram avaliados quanto pH, resíduo seco e
quantificado o teor de AMA por CLAE (Tabela 1).
O pH obtido para solução extrativa e extrato mole foi levemente ácido, e
estão na faixa de 5,3 e 5,4 (Tabela 1). A análise do pH é um parâmetro auxiliar para
controle da estabilidade, fornecendo indicativos sobre a natureza química do
conjunto de compostos presentes em solução (ISAAC et al., 2008).
A média de resíduo seco obtido das amostras para extrato mole foi de 82% e
está dentro do mínimo de 70% (Tabela 1). Extratos moles dessecados a 105 °C, a
perda de água varia entre 15 a 20%, devendo então apresentar no mínimo 70% de
resíduo seco (BRASIL, 2010; LEITE, 2009).
A quantificação do marcador AMA para solução extrativa e extrato mole está
descrito do tabela 1. É possível observar que o teor de AMA é maior no extrato mole
os quais foram obtidos da soluçõe extrativa. Este aumento pode estar relacionado às
condições do processo de evaporação, no qual a solução extrativa é exposta ao
aquecimento por longo período de tempo. Ressalta-se que o valor o teor em ambos
os derivados vegetais está expresso em relação ao resíduo seco, o qual é bastante
variável (Tabela 1), no extrato mole especialmente, devido a sua composição oleosa.
Tabela 1: Resultados da caracterização físico-química da solução extrativa e extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea.
Parâmetros pH - média (s) Resíduo seco
(µg/g) - média (s)
Teor de ama
(µg/g) Média (s)
Solução extrativa 5,34 (0,19) 1,05 (0,21) 79,15 (4,70)
Extrato mole 5,42 (0,13) 82,36 (8,83) 113, 09 (0,08)
*s (desvio padrão),
79
A solução extrativa e extrato mole foram submetidos a análise por CCD,
juntamente com os padrões dos ácidos mirsinoicos AMA e AMB (Figura 8).
A qual permitiu evidenciar e comprovar a presença do ácido mirsinoico AMA
na solução extrativa a partir dos frutos da R. ferruginea, e no extratos moles
desenvolvidos a partir da solução extrativa respectivamente (Figura 8).
Figura 8 Cromatografia em camada delgada da solução extrativa (SE) e do extrato mole (EM), utilizando como padrões os ácidos mirsinoicos A e B.
*Como fase estácionaria utilizou-se sílica gel (gh254) e como fase móvel, hexano: acetato de etila (6:4), após revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento.
Nos perfis cromatográficos da solução extrativa e extrato mole em diferentes
comprimentos de onda por CLAE,foi quantificado ácido mirsinoico AMA o qual foi
detectado em comprimento de onda de 260 nm, comprovando sua presença tanto
na solução extrativa quanto no extrato mole, foi possível observar a presença de um
triglicerídeo ainda não totalmente elucidado o qual tem absorção em comprimento de
onda de 280 nm (Figura 9).
80
Figura 9: Perfil cromatográfico das soluções extrativas e extratos mole por CLAE, em comprimento de onda 260nm e 280nm.
*Fase estacionária: coluna de fase reversa Kinetex®C18150 x 4,6 mm,com partículas core-shellcom tamanho de 2,6 μm. Fases móveis: acetonitrila (ACN), metanol (MeOH) e água acidificada com ácido fosfórico a pH 2,5. Leitura em comprimento de onda = 260 nm
5.3 Otimização dos sistemas nanoemulsionados
5.3.1 Influência do percentual de óleo e extrato nas nanoemulsões
De acordo com o sugerido pelo guia de estudo de estabilidade da ANVISA
(BRASIL, 2004), recomenda-se submeter o produto em desenvolvimento ao teste de
centrifugação, antes de iniciar o estudo de estabilidade. O produto deve permanecer
estável e qualquer sinal de instabilidade indica a necessidade de reformulação. Se
aprovado nesse teste, o produto pode ser submetido aos testes de estabilidade
(BRASIL, 2004). Esta condição de estresse tem sido a mais usada para rapidamente
avaliar a estabilidade de uma emulsão (RIBEIRO et al., 2015).
Todas as formulações contendo diferentes níveis de óleo e extrato, conforme
descrito na metodologia (item 4.2.5.1) apresentaram-se com aparência leitosa e
consistência fluida, sem separação de fases, quando submetidas ao teste de
centrifugação no tempo zero (24 h) (Figura 10).
81
Figura 10: Nanoemusões contendo diferentes níveis de óleo e extrato, após 24h de preparo.
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente
A coloração das NE variou conforme a concentração do EM e de óleo, sendo
que na medida em que se aumentou o percentual de óleo a coloração foi menos
intensa (Figura 10). Este comportamento se deve ao efeito de diluição do extrato na
presença de maiores quantidades de óleo, assim como ao tamanho de gotícula.
Com o aumento da quantidade de óleo, também se observou o aumento no tamanho
de gotícula, configurando maior opacificação do sistema. No menor percentual de
óleo, a NE ficou mais transparente, sendo possível observar o efeito da coloração
inerente ao extrato. Portanto, a intensidade da coloração se deve ao reduzido
tamanho da gotícula , que permite um maior espalhamentoda luz, conferindo mais
transparência ao sistema (HA et al., 2015; McCLEMENTS, 2012).
O tamanho médio das gotículas das nanoemulsões (NE) está apresentado na
na Figura 11. A determinação de tamanho de gotícula é um dos métodos mais
comuns utilizados para avaliar a estabilidade de nanoemulsões, porque o tamanho
de gotícula interfere em fenômenos de floculação e coalescência, sendo este um um
82
parâmetro importante para definir aplicação e estabilidade de nanoemulsões
(GIANETI et al., 2011).
É conhecido que nanoemulsões com um elevado teor de óleo podem não ser
necessariamente estáveis e podem resultar no aumento do tamanho das gotículas
ou separação de fases (MOSTAFA; EL-ALIM; ASFOUR, 2015). Assim, o resultado
sobre a redução do tamanho é preferível para a estabilidade do sistema. Sabe-se
que quanto menor o tamanho de gotícula melhor é a estabilidade da emulsão,
devido ao movimento browniano que se torna mais importante que a força da
gravidade (CHIBOWSKI, 1999; KONG; PARK, 2011; WIACEK , 1999).
No presente trabalho, verificou-se também que percentual de óleo foi o fator
determinante para o tamanho de gotículas. De modo semelhante, o estudo de
otimização de sistema nanoemulsionado, utilizando ácido oleico, como fase oleosa,
mostrou que o tamanho de fase interna aumentou de 60 a 100 nm, com os
percentuais de 24 e 28% de óleo, respectivamente (ZHONGCHENG; XUEFENG;
XIAO-BIM, 2016).
Dentro de cada grupo, verificou-se também a influência do extrato mole em
relação às NE brancas. Nas formulações com óleo a 15 % (grupo 1), o EM
interferiu, levando a uma diminuição do tamanho de gotícula em relação a NE
branca. No grupo das formulações com óleo a 20% (grupo 2), o EM interferiu,
aumentando o tamanho de gotículas. Entretanto, nas formulações com óleo a 25%
(grupo 3), o percentual do EM não influenciou no tamanho de gotículas (Figura 11).
O efeito do extrato vegetal sobre o tamanho de gotícula pode ser muito
variável, dependente de cada formulação, composição do extrato e método.
Observando resultados de outros estudos que desenvolveram NE contendo extratos
vegetais, por exemplo, verificou-se tanto a redução de tamanho em NE contendo
extrato de tomate rico em licopeno (HA et al., 2015), como o seu aumento em NE
contendo extrato de Achyrocline satureioides (Lam) DC-Asteraceae (ZORZI et al.,
2015).
O tamanho de gotículas também foi analisado quanto ao índice de
polidispersão (PDI) , que se refere à distribuição das gotículas da fase interna. Uma
distribuição é homogênea quando PDI é inferior a 0,2 (CAPEK, 2004).
83
Figura 11: Tamanho de gotícula, PDI e potencial zeta nas nanoemulsões contendo diferentes percentuais de óleo e extrato mole.
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente.
Na Figura 11, quando analisado o índice de polidispersão (PDI) nas
formulações do grupo 1 e 2 (óleo 15 e 20%, respectivamente), observa-se um
aumento com a presença do EM, porém não linear. Já para o grupo 3 (óleo 25%) o
PDI tende a diminuir quando o EM está em 1 e 1,5%. Observa-se que nas
formulações com mais óleo e mais extrato, tem-se a menor polidispersão. Em geral
independente do percentual de óleo e extrato mole, todas as formulações
apresentaram PDI inferior a 0,2, indicando que a população de gotículas é
monodispersa (TANG et al., 2012).
Embora as formulações tenham PDI menor que 0,2, observa-se na Figura 12,
uma discreta tendência ao aumento de tamanho de gotículas, tendo em vista o
deslocamento da curva de distribuição para a direita.
84
O potencial zeta (Figura 11) indica o grau de repulsão entre as partículas
adjacentes e carregadas em uma dispersão. Assim, o potencial zeta demonstra a
tendência das gotículas se agregarem, preconiza-se que quanto maior o potencial
zeta menor a tendência de agregação de partículas (FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA,
2004). Quando o potencial zeta é baixo, a atração excede a repulsão e assim a
dispersão floculará. A linha que divide os sistemas em estáveis e instáveis é
marcada em +30 ou -30 mV, desta forma partículas com potencial zeta positivo
acima de +30 mV ou mais negativo que -30 mV, são considerados estáveis. No caso
de nanoemulsões que possuem partículas pequenas, um potencial zeta alto confere
estabilidade ao sistema (HE et al., 2011).
Observa-se que o potencial zeta (Figura 11) aumenta na presença do extrato
mole em relação a NE branca, independente dos percentuais de óleo e EM. Os
valores obtidos para as NE branca ficaram entre -15 mV e -17 mV, já na presença do
EM esses valores passam para -38 mV até -46 mV (Figura 11). Em geral, os
resultados demonstram que o EM melhora a estabilidade do sistema, sendo que um
valor de potencial zeta entre -25 mV e -30 mV já é suficiente para criar uma barreira
de energia entre as gotículas, assim evitando a coalescência (SHANMUGAM;
ASHOKKUMAR, 2014).
85
Figura 12: Distribuição de tamanho das gotículas das nanoemulsões contendo os diferentes percentuais de óleo e extrato mole.
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente.
86
Para subsidiar a escolha da formulação para a sequencia do estudo de
desenvolvimento, repetiram-se os mesmos testes após 30 dias do preparo das NE,
que foram mantidas nas condições de bancada, sem controle de temperatura.
Em todos os grupos de formulações, o tamanho de gotícula aumentou de 6,5
a 14%, após o período de 30 dias , motivando as demais etapas deste trabalho
(Figura 13).
O PDI sofreu variações, sempre abaixo do limite recomendado. Mudanças no
tamanho de partícula, mas não em PDI foram relatados em estudos realizados por
Saberi, Fang e McClements (2013) (Figura 13).
Em relação ao potencial zeta, todas as formulações mantiveram o mesmo
padrão de comportamento, sem alterações relevantes .
Figura 13: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo diferentes percentuais de óleo e extrato mole no tempo zero (24h) e após 30 dias.
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente.
87
A estabilidade da emulsão é intimamente relacionado com a distribuição do
tamanho das gotículas. Um maior tamanho de gotícula pode aumentar o fenômeno
de maturação de Ostwald, levando à cremeação e coalescência (PIORKOWSKI;
McCLEMENTS, 2013). Sabe-se que a estabilidade da emulsão é inversamente
proporcional à temperatura de armazenamento (RIBEIRO et al, 2015), o que pode
explicar em parte estes resultados.
Considerando então, o aumento do tamanho médio de gotículas, após 30
dias, decidiu-se prosseguir o estudo de desenvolvimento, submetendo a formulação
com o maior percentual de EM (1,5%), em três níveis de percentual de óleo (15, 20 e
25%), ao estresse térmico (estabilidade praliminar), para conhecer melhor o efeito da
temperatura, como um dos fatores que interferem na estabilidade.
Os resultados desta etapa estão representados na Figura 14. Em relação aos
aspectos físicos todas as formulações permaneceram de consistência fluida e
aspecto leitoso. O comportamento de estabilidade frente a oscilação forçada de
temperatura, mostrou que todas as formulações contendo EM, apresentaram um
leve sedimento, após centrifugação, inclusive as formulações dos grupos controles
(5 C e 25 C). Estes resultados sugerem que a presença do EM a 1,5%, associada
ao tensoativo a 10%, não mantém o sistema estável frente a estresse forçado de
temperatura.
A coloração das NE manteve-se marrom, porém, quando o EM e óleo estão
em maior percentual a tonalidade do sistema é mais clara, conforme já apresentado
anteriormente, comportamento relacionado ao percentual de óleo e tamanho de fase
interna.
Em relação ao tamanho de gotícula, houve um aumento de cerca de 2 a 5% ,
para todas as formulações ao final do ciclo (28 dias) em relação ao tempo zero (24
h). O mesmo foi observado para as amostras dos grupos controles (± 5 °C e ± 25
°C). Esse aumento foi identificado a partir de 14 dias, em relação ao tempo zero (24
h) (Figura 14). Quando comparado com os resultados obtidos anteriormente com a
formulação analisada após 30 dias , em condições normais de bancada, esse
aumento não foi relevante. Essas diferenças podem ser decorrentes das variações a
cada lote de preparação.
88
Figura 14: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo extrato mole a 1,5%, com diferentes percentuais de óleo, quando submetidas às alterações de temperatura a cada 24h durante 28 dias (estabilidade preliminar).
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole.
Todas as formulações, incluindo as NE brancas, também apresentaram valor
de PDI aceitável (menor que 0,2) no tempo zero (24 h), com leves variações ainda
dentro dos níveis desejados após 14 e 28 dias no ciclo gelo degelo (Figura 14).
Em relação ao potencial zeta, os valores para as NE branca encontraram-se
abaixo de -20 mV e para as NE com extrato mole acima de -40 mV. Como já
observado, a presença do EM aumenta o potencial zeta das NE. Observou-se que
esse aumento é mantido ao final de 28 dias e que a temperatura não interfere nesse
fenômeno, visto que as formulações quando submetidas ao ciclo gelo-degelo
apresentaram o potencial zeta na mesma faixa do tempo zero (24 h). O mesmo
comportamente foi observado para as NE dos grupos controle (± 5 °C e ± 25 °C) .
89
Para as formulações sem EM observou-se que o pH teve valor mínimo de
6,09 e máximo de 6,61, e nas formulações com EM, houve o decréscimo para 5,07
a 5,38, confirmando a presença do ácido mirsinoico no EM, característica
determinada por Zermiani et al (2016) e já relatado para o extrato mole no presente
estudo, com pH igual a 5,42 (tabela 1).
Estudo anterior com nanoemulsões contento extrato mole da R. ferruginea
submetido ao mesmo teste nas mesmas condições, apresentou resultados
semelhantes quanto a caracterização do sistema nanoemulsionado frente a
alterações de temperatura (XAVIER, 2014). O mesmo apresentou resultados
promissores quando na presença do extrato mole nas formulações, demonstrando a
influência do mesmo na estabilidade de sistemas nanoemulsionados, corroborando
que o extrato mole da R. ferruginea melhora a estabilidade de nanoemulsões.
O perfil cromatográfico das nanoemulsões, em 260 nm, é semelhante aos
perfis dos EM e SE (item 5.2 – Figura 9). A Figura 15 representa os cromatogramas
para todas as condições e tempos de análises, uma vez que os perfis foram
semelhantes. O cromatograma das nanoemulsões com extrato mole apresentam
outros picos, relacionados aos excipientes das formulações, conforme apresentado
no cromatograma das nanoemulsões sem o extrato. Porém, a presença de vários
picos presentes nas formulações demonstram a ausência de interferência dos
mesmos com o marcador AMA, indicando que o método empregado é específico
para a análise do marcador na formulação (ZERMIANI et al., 2015).
90
Figura 15: Perfil cromatográfico por CLAE, representativo das nanoemulsões, sem e com extrato mole da R. ferruginea, em comprimento de onda 280 nm e 260 nm.
A análise por CLAE foi realizada a fim de verificar se o teor de AMA
permanecia constante quando as nanoemulsões submetida a mudança de
temperatura. Observa-se que o teor de AMA permanece relativamente constante no
final do ciclo (28 dias) em relação ao tempo zero (24 h) para todas as formulações,
com e sem EM (Tabela 2).
Tabela 2: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de estabilidade preliminar (ciclo 28 dias).
Teor de AMA (µg/g)
Formulações Tempo zero
24 horas Tempo final
28 dias Controle
28 dias (±5°c) Controle
28 dias (±25°c)
NE 1.4 116,46 (6,12) 114,78 (0,49) 107,76 (1,01) 114,56 (8,80)
NE 2.4 116,52 (5,00) 113,90 (6,64) 111,91 (9,57) 113,16 (6,11)
NE 3.4 119,61 (0,80) 118,98 (5,97) 104,01 (10,97) 101,26 (7,90)
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole.
91
Ocorreu separação de fases, com uma leve sedimentação após o processo
de centrifugação nas NE contendo o EM, isto apontou a necessidade de aprimorar a
formulação. Dando continuidade ao desenvolvimento, optou-se por avaliar a
influência do tensoativo nos maiores percentuais de EM e óleo, conforme descrito a
seguir.
5.3.2 Influência do tensoativo nas nanoemulsões contendo óleo a 25% e
extrato a 1,5%
A seleção do melhor percentual de tensoativo é crucial para melhorar a
estabilidade da emulsão (KIM et al., 2014). Nesta etapa de desenvolvimento, o
tensoativo passou de 10% para 15 e 20% (conforme descrito na metodologia item
4.2.5.2).
Em resposta ao aumento do tensoativo, observou que o tamanho de gotícula
das formulações com EM, sofreu uma redução em relação à formulação branco em
todos os tempos e condições, porém menor para o tensoativo a 20% (Figura 16).
Quanto maior o percentual de tensoativo, menor o tamanho de gotícula , conforme
esperado e observado em estudos semelhantes (KIM et al., 2014).
Porém, todas as formulações apresentaram aumento no tamanho de gotícula
ao final do ciclo (14 dias) em relação ao tempo zero (24 h). O mesmo ocorreu para
as formulações controles (± 5 °C e ± 25 °C) (Figura 16).
De modo geral, as formulações apresentaram o valor de PDI menor que 0,2,
em todos os tempos e condições de análises. O índice de polidispersão (PDI)
apresentou-se maior para as formulações com tensoativo 20%, sendo que o
tamanho de gotícula é menor nessa condição (Figura 16).
Conforme já verificado anteriormente , a presença do EM aumentou o
potencial zeta em relação ao branco, os valores obtidos seguem os mesmo
comportamento que anteriormente, valores esses mantidos no decorrer do tempo,
mesmo sem a interferência da concentração do tensoativo nesta etapa.
À medida que a concentração de tensoativo aumenta, o tamanho da gotícula
tende a ser menor. Entretanto, nos métodos que induzem a uma maior redução no
tamanho de gotículas, como na emulsificação de alta energia, que empregam
homogeneizadores de alta pressão, requerem maior quantidade de tensoativo para
92
envolver e estabilizar as gotículas formadas (CHOI et al., 2009; KIM et al., 2014).
Porém, o PDI e o potencial zeta não se correlacionaram com a quantidade de
tensoativo.
Figura 16: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, com diferentes percentuais de tensoativo, quando submetidas às alterações de temperatura a cada 24 h durante 14 dias (estabilidade preliminar).
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.
Os valores de pH, também apresentaram-se como no ciclo anterior, na faixa
de 5,17 a 7,05, sendo que as formulações com EM apresentam pH menor que as NE
branco.
Visualmente, em resposta ao aumento do tensoativo, observou-se que todas
as formulações apresentaram-se de consistência viscosa e aspecto opalescente
(Figura 17), diferentemente das formulações com menor percetual de tensoativo
(Figura 10), as quais eram fluidas e leitosas.
Nesta etapa, todas as formulações permaneceram estáveis, sem separação
de fases, após o processo de centrifugação, em todos os tempos e condições de
análises, demonstrando que a maior concentração de tensoativo confere maior
estabilidade ao sistema, conforme esperado e demonstrado por estudos com
objetivo semelhante (KAH; HOFMANN, 2014), priorizando porém, a menor
quantidade possível de tensoativo, tendo em vista um menor potencial de toxicidade
ou efeito irritante dos tensoativos.
93
Figura 17: Aspecto visual das nanoemulsões contendo extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, com diferentes percentuais de tensoativo no tempo zero (24 h).
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.
Um estudo de estabilidade para o extrato mole dos frutos de R. ferruginea
(ZERMIANI et al., 2015) foi verificado que o teor de AMA é muito variável. No
presente estudo, quando o extrato foi incoproado nas NE, verificou-se o mesmo
comportamento. Os resultados apontam para uma suposta interferência do
percentual de tensoativo, na estabilidade do AMA ao longo do tempo, tanto nas
condições de estresse de temperatura, e nas condições usadas como controle
(Tabela 3), na mesma intensidade, e inversamente proporcional ao tensoativo.
94
Tabela 3: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de estabilidade preliminar (ciclo 14 dias).
Teor de AMA mµ/g – ciclo 14 dias
Formulações Tempo zero
24 horas Tempo final
14 dias Controle
14 dias (±5°c) Controle
14 dias (±25°c)
NE 3.4 – T15 111,64 (1,40) 129,64 (2,05) 123,41 (2,66) 122,60 (2,01)
NE 3.4 – T20 130,22 (8,98) 118,99 (0,22) 103,75 (1,09) 111,48 (5,03)
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.
Analisando o comportamento das formulações, o tamanho de gotícula, PDI e
potencial zeta, não foram discriminativos para os percentuais de tensotivos
empregados. Porém, considerando a maior estabilidade do teor de AMA e o aspecto
mais fluido da formulação, contendo tensoativo a 15%, decidiu-se avaliar o
percentual de conservante em 1 e 2%, a fim de assegurar a estabilidade física,
química e microbiolpógica da formulação desenvolvida.
5.3.3 Influência do conservante na nanoemulsão selecionada
A formulação NE 3.4 - T15 (a 25% de óleo, 1,5% de EM e 15% de tensoativo)
foi selecionada e submetida ao estudo de estabilidade acelerada, alterando o
conservante em 1 e 2% (conforme metodologia descrita item 4.2.5.2). Essa alteração
teve por objetivo verificar se o percentual de conservante interfere no tamanho
médio de gotícula, PDI e potencial zeta, e preserva a qualidade microbiológica das
NE. Esta escolha se justifica com base em estudo anterior de NE com a mesma
composição qualitativa (XAVIER et al., 2015), em termos de excipientes e extrato,
porém que empregava o conservante a 0,5%, e que apresentou indício de
contaminação após 90 dias, quando as formulações foram submetidas a
estabilidade acelerada nas mesmas condições.
Em relação aos aspectos físicos, todas as formulações apresentaram-se de
consistência viscosa e aspecto opalescente, independente da alteração no
95
percentual do conservante. Todas as formulações permaneceram estáveis, sem
separação de fases após o processo de centrifugação para todas as condições de
análises, nos tempos de 24 horas, 30 e 60 dias, apresentando uma leve separação
de fase após período de 90 dias.
A coloração das NE manteve-se marrom, com a tonalidade mais clara,
conforme já descrito, não havendo alterações devido a alteração do conservante.
Na análise de caracterização o tamanho de gotícula diminuiu em todas as
formulações com EM, comparadas com suas respectivas formulações sem o EM,
exceto para a formulação NE 3.4 –T15 (C2) apenas no tempo de 24 h.
Quando analisado o comportamento das nanoemulsões sem o EM observou-
se que as formulações nas condições de temperatura ambiente e estufa
apresentaram aumento do tamanho de gotícula em todos os tempos de análises
quando comparadas com a do tempo zero (24 h), mantendo-se estáveis na
condições de geladeira, esse comportamento ocorreu independente da
concentração do conservante (Figura18).
Para as formulações contendo EM, o comportamento das nanoemulsões se
invertem, em relação ao branco, observando-se a redução do tamanho de gotícula
quando submetidas a temperatura ambiente e estufa, mantendo-se estáveis também
quando submetida a geladeira, comparadas com o tempo zero (24h) em todos os
tempos, independente da concentração do conservante (Figura 18).
Provavelmente, em consequência destas alterações, sobretudo do
conservante, que passou de 0,5% , para 1 e 2% o tamanho de gotícula foi
modificado.A faixa de variação do PDI também foi ampliada, ultrapassando o limite
máximo recomendável (Figura 18). A influência do conservante sobre a estabilidade
dos sistemas nanoemulsionados é um fator importante a ser considerado no
desenvolvimento das formulações, como já apontado por Schmitt (2015) durante a
sua pesquisa sobre a eficácia do sistema conservante em nanoemulsões.
Entretanto, não foi encontrada nehuma publicação referindo a relação do
conservante com a estabilidade física do sistema, decorrente da interação entre os
componentes da formulação.
Sabe-se que a alteração física pode ser decorrente da alterção
microbiológica, ao longo do tempo. Porém, neste estudo, o aumento do tamanho de
gotícucla já foi observado no início do estudo (tempo de 24 horas).
96
Figura 18: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, tensoativo a 15%, contendo diferentes percentuais de conservante, quando submetidas ao estudo de estabilidade acelerada por 90 dias.
* O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.
97
O potencial zeta, assim como na estabilidade preliminar, aumentou na
presença do EM, mantendo-se abaixo de -20 mV para as NE branca, e acima de -40
mV na presença do extrato mole, característica observada para todos os tempos e
temperatura, independente do percentual de conservante.
Em todos os sistemas nanoemulsionados analisados neste trabalho, desde o
item 5.3, foi possível observar que a presença do EM nas NE é determinante para a
estabilidade do sistema, em termos de potencial zeta.
Observou-se novamente que a presença do EM diminui o valor de pH,
característica essa observada após 90 dias para todas as condições de análises.
Em relação ao teor de AMA, não foi possível identificar um padrão de
comportamento devido a influência do percentual de conservante, uma vez que os
valores aumentaram ou diminuíram aleatoriamente (Tabela 4). Mais uma vez é
possível identificar essa variabilidade nos percentuais de AMA como já citado
anterioremte, conforme estudo realizado por Zermiani et al. (2015).
Tabela 4: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de estabilidade acelerada (90 dias).
Condições Temperatura
Formulação
Tempo
24 Horas 30 Dias 60 Dias 90 Dias
Teor AMA (µg/g) – médias (s)
Ambiente (±25 °C)
NE 3.4 – T15 (C1)
109,67 (0,24)
126,67 (0,40)
145,35 (1,36)
102,59 (0,40)
NE 3.4 – T15 (C2)
118,00 (0,53)
140,70 (0,20)
145,24 (0,71)
130,89 (0,73)
Estufa (±40° C)
NE 3.4 – T15 (C1)
--------- 111,49 (0,18)
105,32 (0,39)
95,76 (0,20)
NE 3.4 – T15 (C2)
--------- 172,50 (0,50)
103,70 (0,45)
149,70 (0,20)
Geladeira (±5° C)
NE 3.4 – T15 (C1)
--------- 123,23 (0,26)
135,89 (0,98)
113,31 (0,06)
NE 3.4 – T15 (C2)
--------- 116,96 (0,08)
114,59 (0,30)
115,11 (1,25)
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E o ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.
98
5.3.3.1 Estudo reológico dos sistemas nanoemulsionados com e sem extrato
de R. ferruginea
A reologia estuda o modo como os materiais deformam ao longo do tempo
quando submetidos a tensões. Para determinação das propriedades reológicas de
um material, deve-se medir a deformação provocada por uma dada tensão ou medir
a tensão requerida com a finalidade de se produzir uma dada deformação num
tempo determinado (JOHNSON et al., 2000).
A viscosidade de sistema líquido ou fluido depende da temperatura e de
composição e da tensão de cisalhamento ou taxa de deformação, do tempo de
cisalhamento provocado sobre ele. A classificação mais geral dos fluidos, que leva
em consideração o comportamento da relação taxa de deformação/tensão de
cisalhamento, subdivide tais materiais em newtonianos e não-newtonianos (Figura
14) (JOHNSON et al., 2000).
O comportamento reológico dos sistemas nanoemulsionados com e sem EM,
apresentou um aumento não linear da tensão de cisalhamento frente a taxa de
deformação, ou seja, o comportamento foi não newtoniano com redução da
viscosidade com o aumento da taxa de deformação, sendo classificado como
pseudoplástico, com índice de comportamento de fluxo inferior a 1.
Figura 19: Perfil de viscosidade da nanoemulsão com e sem extrato mole da R. ferruginea.
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ refere-se ao tensoativo 15. E (C1) refere-se a 1% de conservante.
99
A Figura 19 é representativa quanto ao comportamento de viscosidade e de
perfil de escoamento das nanoemulsões, sendo possível observar o comportamento
tipo pseudoplástico, caracterizados pelo decréscimo na viscosidade, com o aumento
da taxa de deformação.
Em relação a viscosidade média, a presença do EM aumentou a viscosidade
da nanoemulsão em relação a NE sem o EM no tempo de 24 h. Quando analisado
nos tempos de 30, 60 e 90 dias, observou-se uma aumento da viscosidade, mais
discreto para as nanoemulsões com o extrato, se comparado com a NE branca,
sugerindo que a presença do EM confere estabilidade as formulações, como já visto
nas análises de potencial zeta, tamanho de gotícula anteriormente, e ainda mantém
a viscosidade do sistema (Tabela 5).
Tabela 5: Análise da viscosidade média, índice de comportamento de fluxo e tixotropia para as nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea durante o estudo de estabilidade acelerada.
Condições Temperatura
Formulação Tempo
24 Horas 30 Dias 60 Dias 90 Dias
VISCOSIDADE (mpa.s)
Ambiente (±25 °C)
NE 3.1 – T15 (C1) 29,52(0,90) 49,45(1,83) 52,49(2,83) 65,22(2,15)
NE 3.4 – T15 (C1) 46,49(2,75) 53,97(1,81) 56,83(2,18) 48,43(3,03)
Estufa (±40° C)
NE 3.1 – T15 (C1) --------- 46,54(2,31) 40,59 (0,00) 81,18(0,00)
NE 3.4 – T15 (C1) ---------- 45,94(1,86) 56,64(1,78) 71,42(1,81)
Geladeira (±5° C)
NE 3.1 – T15 (C1) --------- 45,85(1,85) 47,88(4,98) 38,75(1,87)
NE 3.4 – T15 (C1) ---------- 46,59(1,81) 46,03(2,04) 47,85(3,03)
Índice de fluxo
Ambiente (±25 °C)
NE 3.1 – T15 (C1) 0,7378 0,5237 0,7823 0,8239
NE 3.4 – T15 (C1) 0,6897 0,8756 0,7793 0,9078
Estufa (±40° C)
NE 3.1 – T15 (C1) ---------- 0,609 0,6429 0,6031
NE 3.4 – T15 (C1) --------- 0,8584 0,7793 0,861
Geladeira (±5° C)
NE 3.1 – T15 (C1) --------- 0,5296 0,7464 0,8285
NE 3.4 – T15 (C1) --------- 0,7194 0,7731 0,9078
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.
100
5.3.3.2 Pesquisa de contaminação microbiológica das nanoemulsões
A formulação selecionada para esse estudo foi desenvolvida com diferentes
percentuais de conservantes (1 e 2%). As análises microbiológicas ocorreram nos
tempo zero (24h) e 9 meses, conforme metodologia item 4.2.6.6.
A pesquisa de contaminação microbiológica nas nanoemsulsões foi realizada
com o objetivo de verificar se o percentual de conservante interferiria na
conservação do sistema nanoemulsionado ao longo do tempo de armazenamento,
na condição mais crítica (estufa a 40 C).
Conforme as análises realizadas no tempo inicial (24 h), nenhuma NE
apresentou crescimento de bactérias ou fungos, nos diferentes meios de culturas,
sendo aprovado conforme os limites estabelecidos pela Farmacopéia Brasileira
(2010) para ensaios microbiológicos para produtos não estéreis (Tabela 6).
Mesmo nos testes realizados nas diluições com concentrações de 10-3 e 10-4
g/L, não houve variações significativas na contagem do número de colônias, o que
significa que o conservante está inativado, assegurando a confiabilidade do
resultado.
Tabela 6: Análise da pesquisa de contaminação microbiológica para as nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea durante o estudo de estabilidade acelerada.
Testes Critério (Farmacopeia
Brasileira, 2010)
Contagem total – 40 °C
24 Horas 9 meses
NE 3.1 –T15 (C1)
NE 3.4 – T15 (C1)
NE 3.1 – T15 (C2)
NE 3.4 – T15 (C2)
NE 3.1 –T15 (C1)
NE 3.4 – T15 (C1)
NE 3.1 – T15 (C2)
NE 3.4 – T15 (C2)
Fungos e Leveduras
≤104
UFC/g < 102 UFC/g
< 102 UFC/g
< 102 UFC/g
< 102 UFC/g
1,7 x 105
UFC/g
< 104 UFC/g
2 x 104 UFC/g
< 102 UFC/g
Bactérias ≤102
UFC/g < 102 UFC/g
< 102 UFC/g
< 102 UFC/g
< 102 UFC/g
7,1 x 105
UFC/g
< 102 UFC/g
102 UFC/g
102 UFC/g
Bactérias Gram
Negativas
<102 UFC/g
< 102 UFC/g
< 102 UFC/g
< 102 UFC/g
< 102 UFC/g
4,2 x 103
UFC/g
< 102 UFC/g
< 102 UFC/g
< 102 UFC/g
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ refere-se ao tensoativo 15%. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.
101
Ao final de 9 meses, o teste indicou a contaminação para a NE branca e com
EM, porém ainda dentro dos limites apenas para esta última, o que evidencia a
influência positiva do extrato sobre a conservação microbiana (Tabela 7). Este
resultado é coerente com a propriedade antimicrobiana já comprovada para o extrato
dos frutos da R. ferruginea, o qual demonstrou que os compostos identificados como
ácidos mirsinoicos A e B apresentaram atividade antibacteriana significativa contra
Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis (CRUZ et al., 2013).
5.4 Atividade anti-inflamatória in vivo dos sistemas nanoemulsionados
Este estudo investigou a atividade anti-inflamatória do extrato bruto dos frutos
da Rapanea ferruginea in vivo utilizando o modelo de bolsa de ar. Os resultados
mostram que nos camundongos tratados com o extrato dos frutos da R. ferruginea
houve redução do número total de leucócitos migrados para a cavidade formada no
modelo bolsa de ar nas doses de 3, 30 e 300 mg/kg, assim como nas doses de 3, 30
e 100 mg/kg da nanoemulsão quando comparadas com o grupo veículo. No entanto,
pode-se observar que as preparações de nanoemulsões apresentaram maior
atividade inibitória da migração de leucócitos quando comparadas com o extrato em
todas as doses testadas. O tempo de preparo das nanoemulsões não induziu
diferença significativa na atividade testada. Ainda, quando comparadas com o grupo
tratado com indometacina, as doses de 30 e 100 mg/kg da nanoemulsão houve
diferença significativa. A nanoemulsão branca, ou seja sem a incorporação do
extrato, inibiu a migração de leucócitos para o foco inflamatório quando comparado
com o grupo que recebeu apenas veículo (Figura 20). O composto isolado, ácido
mirsinóico A, inibiu significativamente a migração de leucócitos para a cavidade
formada no modelo de bolsa de ar.
102
Figura 20: Efeito do extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea, de nanoemulsões com incorporação deste extrato no tempo 0 e em 90 dias após o preparo e do ácido mirsinóico A na migração de leucócitos induzida por carragenina 1% no modelo de bolsa de ar.
*Foram empregados camundongos Balb/C tratados com extrato bruto dos frutos de Rapanea ferruginea nas doses de 3, 30 e 300 mg/kg, indometacina (Indo, 30 mg/kg), nanoemulsão do extrato bruto de Rapanea ferruginea nas doses de 3, 30 e 100 mg/kg, nanoemulsão branca na dose de 100 mg/kg, ácido mirsinóico (30 mg/kg) ou veículo. Os resultados expressam a média ± e.p.m de células coletadas de 06 animais em cada grupo e foram analisados por ANOVA. *p<0,05 e ***p<0,001 vs veículo; #p<0,05 vs indometacina.
Em conjunto, os dados obtidos sugerem a atividade anti-inflamatória do
extrato da R. ferruginea, a nanoemulsão contendo o extrato e do ácido mirsinóico A,
pois inibiram a migração de leucócitos nas doses testadas. Da mesma forma, os
resultados obtidos no presente estudo também foram observados, em plantas da
mesma família, como a Ardisia tinctoria. De acordo com Kim e colaboradores (2014),
ainda, Ardisia tinctoria inibiu consideravelmente a espessura do edema na pata
induzida pela carragenina. A redução do edema é um importante marcador da
atividade anti-inflamatória.
Igualmente, trabalhos realizados com a Myrsine seguinii (Rapanea neriifolia),
planta da mesma família, espécie da qual foram isolados os ácidos mirsinoicos A, B,
C e F, os quais mostraram atividade anti-inflamatória tópica suprimindo edema de
orelha em ratos induzidos por TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato), sendo que
o AMB (ácido mirsinoico B) apresentou redução de 83% do edema gerado no grupo
controle (HIROTA et al., 2002; MAS, 2015). Estudo realizado com ratos, usando o
modelo de edema de orelha induzido por TPA, demonstrou que a atividade anti-
Veículo Indo 3 30 300 Branca Branca 3 30 100 100 AMA0
2
4
6
8
10
Nanoemulsões de
R. ferruginea (mg/kg)
T0 T0 T90
***
*
******
#
***
#
***
#
NS*
Extrato bruto dos frutos
R. ferruginea (mg/kg)
***
T90
**
NS
To
tal
de l
eu
có
cit
os
(x10
6 c
élu
las)
***
103
inflamatória do AMA inibe seletivamente a DNA polimerase em mamíferos,
diminuindo a proliferação celular. Segundo os autores, o efeito inibitório sobre as
polimerases tem relação com a supressão do processo inflamatório (MIZUSHINA et
al., 2000; MAS, 2015).
104
105
6 CONCLUSÃO
Em conjunto, a caracterização da droga vegetal, da solução extrativa e do
extrato mole contribuem para o conhecimento da espécie e para o controle do
processo de obtenção dos derivados vegetais em estudo.
O teor de AMA apresenta alta variabilidade nas suas diferentes formas de
apresentação (solução extrativa, extrato mole e nanoemulsões), provavelmente
associado a sua natureza fluida e oleosa, refletindo numa dificuldade analítica.
No estudo de desenvolvimento dos sistemas nanoemulsionados, o nível de
óleo mostrou ser um fator determinante para o aumento do tamanho de gotícula,
independente da concentração do extrato mole. O aumento do percentual de
tensoativo confere maior estabilidade as formulações frente ao estresse forçado pela
centrifugação.
No decorrer dos estudos de estabilidade preliminar e acelerado, evidenciou-
se a influência positiva do extrato mole nas características físicas dos sistemas
nanoemulsionados, sobre o potencial zeta e PDI.
No estudo de estabilidade acelerada, a viscosidade aumenta no decorrer do
tempo. A contaminação microbiológica foi aceitável até o período de análise de 9
meses manteve-se estável apenas na presença do extrato mole.
A alteração no percentual de conservante influencia não somente a
estabilidade microbiológica dos sistemas, visto que uma maior concetração de
conversante, manteve o índice de contaminação menor após 9 meses dos sistemas
nanoemulsionados, mas também o tamanho de gotícula e PDI, que mostraram
alterações relevantes.
A análise farmacológica sugere que o extrato mole dos frutos da R. ferruginea
exibe efeito anti-inflamatório em animais, via oral, com diminuição de edema, efeito
esse potencializado quando o extrato mole está nanoemulsionado.
Por fim, o presente estudo otimizou uma nanoemulsão com tamanho de
gotícula de 200 nm, a qual mostra-se um sistema estável e com potencial efeito anti-
inflamatório em estudo in vivo.
106
107
REFERÊNCIAS
ABBAS, A.K. Imunologia celular e molecular. 7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2011. ALAM, M.S.; ALI, M.S.; ALAM, N.; SIDDIQUI, M.R.; SHAMIM, M.; SAFHI, M.M. In vivo study of clobetasol propionate loaded nanoemulsion for topical application in psoriasis and atopic dermatitis. Drug Invention Today, v. 5, p. 8-12, 2013. ALI, M.S.; ALAM, M.S.; IMAM, F.; SIDDIQUI, M.R. Topical nanoemulsion of turmeric oil for psoriasis: characterization, ex vivo and in vivo assessment. International Journal of Drug Delivery, v. 4, n. 2, p. 184 -197, 2012. ALKEST CSO, Óleo de Mamona Etoxilado, Boletim Técnico: Oxiteno. Disponível em: <http: //www.oxiteno.com.br/cms/media/53920/26.03.13 alkest_cso_pc_ptpdf>, acesso em 12 julho, 2016. ALLEN, L.V.JR.; POPOVICH, N.G.; ANSEL, H.C.. Formas farmacêuticas e sistemas de liberação de fármacos. 9. ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. AL-MEKHLAFI, N.A.; SHAARI, K.; ABAS, F.; KNEER, R.; JEYARAJ, E.J.; STANSLAS, J.; YAMAMOTO, N. Alkenylresorcinols and cytotoxic activity of the constituents isolated from Labisia pumila. Phytochemistry, v. 80, p. 42-49, 2012. ANTON, N.; VANDAMME, T. F. Nano-emulsions and micro emulsions:clarifications of the critical differences. Pharmaceutical Research, v. 28, n. 5, p. 978-985, 2011. ANTONIALLI, C. de S. Avaliação do efeito do ácido mirsinóico b em diferentes modelos de hipernocicepção inflamatória e neuropática persistente em camunfdongos. 2009. 97f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2009. ANTONIALLI, C.S.; DA SILVA, G.F.; ROCHA, L.W.; MONTEIRO, E.R.; DE SOUZA, M.M.; MALHEIROS, A.; YUNES, R.A.; QUINTÃO, N.L. Antihyperalgesic effects of myrsinoic acid B in pain-like behavior induced by inflammatory and neuropathic pain models in mice. Anesthesia & Analgesia, v. 115, n. 2, p. 461-469, 2012. ASSIS, L.M.; ZAVAREZE, E.; SOUZA-SOARES, L.A. Características de nanopartículas e potenciais aplicações em alimentos. Brazilian Jounal of Food Technology, v. 15, n. 2, p. 99-109, 2012. AULTON, M.E. Delineamento de formas farmacêuticas. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. AULTON, M.E. Pharmaceutics: The science of dosage form design. New York: Churchill Livingstone, 1988. p. 724. BARRETA, C. Atividade antioxidante de extratos e compostos isolados de Eugenia umbelliflora e Rapanea ferruginea. 2011. 103f. Dissertação de Mestrado
108
– Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2011. BARTON, G.M. A calculated response: control of inflammation by the innate immune system. The Journal of Clinical Investigation, v. 118, n. 2, p. 413-420, 2008. BECHER, P. Emulsions, Theory and Practice. New York: Oxford University Press, ed.3, p. 514, 2001.
BEHREND, O.; AX, K.; SCHUBERT, H. Influence of continuous phase viscosity on emulsification by ultrasound. Ultrasonics Sonochemistry, v. 7, p. 77–85, 2008.
BERNARDI, D.; PEREIRA, T.; MACIEL, N.; BORTOLOTO, J.; VIERA, G.; OLIVEIRA, G.; ROCHA-FILHO, P.A. Formation and stability of oil-in-water nanoemulsions containing rice bran oil: In vitro and in vivo assessments. Journal of Nanobiotechnology, v. 9, p. 44. 2011. BERNARDI, D.S. Desenvolvimento de nanoemulsão de óleo de arroz como adjuvante no tratamento de dermatite atópica e psoríase. 2011. 104f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. BHOSALE, R.R.; OSMANI, R.A.; GHODAKE, P.P.; SHAIKH, S.M.; CHAVAN, S.R. Nanoemulsion: A Review on Novel Profusion in Advanced Drug Delivery. Indian Journal of Pharmaceutical and Biological Research , v. 2, n. 1, p. 122-127, 2014. BIDONE, J.; ZORZI, G.K.; CARVALHO, E.L.; SIMÕES, C.M.; KOESTER, L.S.; BASSANI, V. L.; TEIXEIRA, H.F. Incorporation of Achyrocline satureioides (Lam.) DC extracts into topical nanoemulsions obtained by means of spontaneous emulsification procedure. Industrial Crops and Products, v. 62, p. 421-429, 2014. BLUNT, S.B.; CHEN, T.B.; WIEMER, D.F. Prenylated benzoic acid and from Rapanea myricoides. Jounal of Natural Products, v. 6, p. 749-760, 1998. BONTORIM, G. Estudo de Estabilidade de emulsão cosmética utilizando reologia e técnicas convencionais de análise. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Federal do Paraná. 74p. Curitiba, 2009. BOOCK, K.P. Desenvolvimento e avaliação da estabilidade física de emulsões contendo cristais líquidos e ativos hidratantes à base de manteiga de cupuaçu (Theobroma grandiflorum) ou cacau (Theobroma cacau). Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. 112p. São Paulo, 2007. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Farmacopeia Brasileira. 4ªed. Atheneu, São Paulo, 1988. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Farmacopeia Brasileira. 5ª ed. Brasília, 2010.
109
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de Controle de Qualidade de Produtos Cosméticos. Brasília: ANVISA, 2007 BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos.1.ed. Brasília: ANVISA, 2004. BRASIL. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução- RDC 79, de 28 de agosto de 2000. Estabelece normas e procedimentos para registros de produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes e adota a definição de produtos cosméticos. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/cosmeticos/guia/html/79_2000.pdf. Acesso em: 21 abr. 2014. BRASIL. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n° 26 de 13 de maio de 2014 . Dispõe sobre o registrode medicamentos fitoterápicos e produtos tradicionais fitoterápicos nacionais. Diário oficial da União. Brasília, 14 mai.2014. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE n° 1 de 29 de julho de 2005. Publica o Guia para a Realização de Estudos de Estabilidade de Produtos Farmacêuticos. Diário oficial da União, 01 ago. 2005. BRUXEL, F.; LAUX, M.; WILD, L.B.; FRAGA, M.; KOESTER, L.S.; TEIXEIRA, H.F. nanoemulsões como sistemas de liberação parenteral de fármacos. Química Nova, v. 35, n. 9, p.1827-1840, 2012. CAPASSO, R.; IZZO, A.A.; PINTO, L; BIFULCO, T.; VITOBELLO, C.; MASCOLO, N. Phytotherapy and quality of herbal medicines. Fitoterapia, n. 71, p. 58-65, 2000. CAPEK, I. Degradation of kinetically-stable o/w emulsions. Advances in Colloid and Interface Science. v. 107, p. 125-155, 2004. CAZARIN, C.; BRANDALISE, L. Utilização de sistema nanemulsionados contendo extratos de Rapanea ferruginea para otimizar os seus efeitos nootrópicos sobre os déficits cognitivos em animais com Alzheimer induzido pelos peptídeos aβ 1-42. 2016. Monografia (Graduação) - Curso de Biomedicina, Universidade do Vale do Itajaí, 2016. CHAIITTIANAN, R.; SRIPANIDKULCHAI, B. Development of a nanoemulsion of Phyllanthus emblica L. branch extract. Drug Development and Industrial Pharmacy, v. 40, n. 12, p. 1597-606, 2014. CHEN, G.; TAO, D. An experimental study of stability of oil – water emulsion. Fuel Processing Technology, v.86, p.499-508, 2005. CHOI, A.J.; KIM, C.J.; CHO, Y.J.; HWANG, J.K.; KIM, C.T. Effects of surfactants on the formation and stability of capsaicin loaded nanoemulsions. Food Science and Biotechnology, v. 18, p. 1161−1172, 2009.
110
CHOI, H-K.; KIM, D-H.; KIM, J.W.; NGADIRAN, S.; SARMIDI, M.R.; PARK, C.S. Labisia pumila extract protects skin cells from photoaging caused by UVB irradiation. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 109, n. 3, p. 291–296, 2010. CHUA, L.S.; LATIFF, N.A.; LEE, S.Y.; LEE, C.T.; SARMIDI, R.M.; AZIZ, R.A. Flavonoids and phenolic acids from Labisia pumila (Kacip Fatimah). Food Chemistry, v. 127, p. 1186–1192, 2011. CIOLA, R. Fundamentos da cromatografia á liquido de alto desempenho HPLC. São Paulo: Edgard Blucher, 2000, p.28-41. CORDERO, C.P.; GÓZMEZ-GONZÁLEZ, S.; LEÓN-ACOSTA, C.J.; MORANTES-MEDINA, S.J.; ARISTIZABAL, F.A. Cytotoxic activity of five compounds isolated from Colombian plants. Fitoterapia, v. 75, p-225-227, 2004. COSTA, P. Avaliação da atividade do extrato dos frutos de Rapanea ferruginea e dos compostos isolados ácido mirsinóico A e triglicerídeo sobre a memória de animais normais e com Alzheimer induzido. 2011. 133f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2011. CRUVINEL, W. de M.; MESQUITA JÚNIOR, D.; ARAÚJO, J.A.P.; CATELAN, T.T.T.; SOUZA, A.W.S. de; SILVA, N.P. da; ANDRADE, L.E.C. Sistema imunitário –parte I Fundamentos da imunidade inata com ênfase nos mecanismos moleculares e celulares da resposta inflamatória. Revista Brasileeira de Reumatologia, v. 50, n. 4, p. 434-461, 2010. CRUZ, A. B.; KAZMIERCZAK, K.; GAZONI, V. F.; MONTEIRO, E. R.; FRONZA, L. M.; MARTINS,P.; YUNES, R. A.; BÜRGER, C.; TOMIO, T. A.; FREITAS, R. A.; MALHEIROS, A. Bio-guided isolation of antimicrobial compounds from Rapanea ferruginea and its cytotoxic and genotoxic potential. Journal of Medicinal Plants Research, v. 7, n.19, p.1323-1329, 2013. CUSTODIO-JUNIOR, O. J. Avaliação da estabilidade química, física e microbiológica dos sistemas nanoemulsionados contendo extrato dos frutos da Rapanea ferruginea. Relatório final. Bolsas do Artigo 170 do Governo do Estado de SC. Março, 2016. DAL MAS, J. Nanoemulsão contento extrato da casca de Rapanea ferrugine com atividade anti-inflamatória tópica. 2015. 167f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Univali, 2015. DALTIN, D. Tensoativos: química, propriedades e aplicações. São Paulo: Blucher, 2011. DONG, M.; NAGAOKA, M.; MIYAZAKI, S.; IRIYE, R.; HIROTA, M. 3-geranyl-4-hydroxy-5-(3'-methyl-2'-butenyl) benzoic acid as an anti-inflammatory compound from Myrsine seguinii. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, v. 63, n. 9, p. 1650-1653, 1999.
111
DUCHENE J.; LECOMTE, F.; AHMED, S.; CAYLA, C.; PESQUERO, J.; BADER, M.; PERRETTI, M.; AHLUWALIA, A. A novel inflammatory pathway involved in leukocyte recruitment: role for the kinin B1 receptor and the chemokine CXCL5. Journal Immunology. v. 179, n. 7, p. 4849-4856, 2007. DUTRA, I. de A.; XAVIER, B.B.; COUTO, A. G.; NETZ, D. J. A. Desenvolvimento de nanoemulsões visando a incorporação de fitoderivados. In: XIII Seminário de Iniciação Científica, 2014, Itajaí. Anais do XIII Seminário de Iniciação Científica, 2014. EL-AASSER, M.S.; SUDOL, E.D. Miniemulsions: overview of research and applications. Journal of Coatings Technology and Research, v. 1, n. 1, p. 20-31, 2004. FERNANDEZ, P.; ANDRÉ, V.; RIEGER, J.; KÜHNLE, A. Nanoemulsion formation by emulsion phase inversion. Colloids and Surfaces A: Physicochemistry Engineering Aspects, v. 251, p. 53-58, 2004. FILLIPIN, F.B. Avaliação da atividade anticolinesterásica dos ácidos mirsinóicos A e B, isolados da Rapanea ferruginea. 2010. Trabalho de conclusão de curso (Graduação em Farmácia) – Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2010. FISHER, D.C.H. Controle de qualidade de fitoterápicos.. In: GIL, E. S. (Org.). Controle físico-químico de qualidade de medicamentos. São Paulo: Pharmabooks, cap.16. p. 289-327, 2007. FREITAS, M. F.; KINOSHITA, L. S. Myrsine (Myrsinoideae- Primulaceae) no sudeste e sul do Brasil. Rodriguésia, v. 66, n. 1, p. 167-189, 2015. FLORENCE, A.T.; ATTWOOD, D. Princípios Físico-Químicos em farmácia. 3ª ed São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo, p. 446, 2003. FRONZA, T.; CAMPOS, A.; TEIXEIRA.H. Nanoemulsões como sistemas de liberação para fármacos oftálmicos. Acta Farmacêutica Bonaerense, v.23, n.4, p.558-566, 2004. FRONZA, T.; GUTERRES S.; POHLMANN A.; TEIXEIRA H. Nanocosméticos: em direção ao estabelecimento de marcos regulatórios. Porto Alegre: UFRGS, 2007. functionality using structural design principles. Current Opinion in Colloid & Interface Science, v.17, n. 5, p. 235–245, 2012. GALLARATE, M.; CHIRIO, D.; BUSSANO, R.; PEIRA, E.; BATTAGLIA, L.; BARATTA, F.; TROTTA, M. Development of O/W nanoemulsions for ophthalmic administration of timolol. International Journal of Pharmaceutic, v. 440, p. 126–134, 2013. GALVAN, F. Avaliação da atividade anti-hiperalgésica do extrato bruto da Rapanea sp (Myrsinaceae) e do ácido mirsinóico B sobre a neuropatia diabética. 2007. 39f. Trabalho de conclusão de concurso (Graduação em Farmácia) – Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2007.
112
GAZONI, V. F. Análise fitoquímica e avaliação do efeito anticolinesterásico do extrato e compostos isolados da Rapanea ferruginea. 2009. 84f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2009. GIANETI, M.D.; WAGEMAKER, T.A.L.; SEIXAS, V.C.; MAIA, P.M.B.G.C. The use of nanotechnology in cosmetic formulations: The influence of vehicle in the vitamin a skin penetration. Current Nanoscience, v. 8, p. 526–534, 2011. GUGLIELMINI, G. Nanostructured novel carrier for topical application. Clinics in Dermatology, v. 26, n. 4, p. 341 346, 2008. GULER, E.; BARLAS, B.; YAVUZ, M.; DEMIR, B.; GUMUS, Z.P.; BASPINAR, Y.; COSKUNOL, H.; TIMUR, S. Bio-active nanoemulsions enriched with gold nanoparticle, marigold extracts and lipoic acid: In vitro investigations. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 121, p. 299–306, 2014. GUTIERRE , J.M.; GON LE , M.; SOL , I.; PE , C.M.; NOLLA, J. Nano-emulsions: new applications and optimization of their preparation. Current Opinion in Colloid and Interface Science, v. 13, n. 4, p. 245-251, 2008. HA, T.V.A.; SAEHOON, K.; CHOI, Y.; KWAK, H.S.; LEE, S.J.; WENC, J.; OEY, I.; SANGHOON, K. Antioxidant activity and bioaccessibility of size-different nanoemulsions for lycopene-enriched tomato extract. Food Chemistry, v. 178, p. 115–121, 2015. HAYHOE, R. P. G.; KAMAL, A. M.; SOLITO, E.; FLOWER, R.J.; IANNE COOPER, D.; PERRETTI, M. Annexin 1 and its bioactive peptide inhibit neutrophil-endothelium interactions under flow: indication of distinct receptor involvement. Blood Journal. v. 107, n. 5, 2016. HE, W.; TAN Y.; TIAN, Z.; CHEN, L.; HU, F.; WU, W. Food protein-stabilized nanoemulsions as potential delivery systems for poorly water-soluble drugs: preparation, in vitro characterization, and pharmacokinetics in rats. International Journal of Nanomedicine, v. 6, p. 521-533, 2011. HEADLAND, S. E.; NORLING, L. V. The resolution of inflammation: Principles and challenges. Seminars in Immunology. v. 27, p.149–160, 2015. HESS, S. Atividade antinoceptiva do ácido mirsinóico B. Itajaí, 2006. 107f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2006. HILÁRIO, M.O.E.; TERRERI, M.T.; LEN, C.A. Antiinflamatórios não-hormonais: inibidores da ciclooxigenase 2. Jornal de Pediatria. v. 82, n. 5 (supl), p. 206-212, 2006.
113
HIROTA, M.; MIYAZAKI, S; MINAKUCHI, T.; TAKAGI, T.; SHIBOTA, H. Myrsinoic acids B, C and F, anti-inflammatory compounds from Myrsine seguinii. Biosci Biotechonol Biochem, v.66, n.3, p.655-659, 2012. ISAAC, V.L.B.; CEFALI L.C.; CHIARI, B.G.; OLIVEIRA, C.C.L.G.; SALGADO H.R.N.; CORRÊA, M.A. Protocolo para ensaios físico-químicos de estabilidade de fitocosméticos. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v. 29, n.1, p. 81-96, 2008. IZQUIERDO, P.; FENG, J.; ESQUENA, J.; TADROS, T.; DEDEREN, J.C.; GARCIA, M.J.; AZEMAR, N.; SOLANS, C. The influence of surfactant mixing ratio on nanoemulsion formation by the PIT method, Journal of Colloid and Interface Science, v. 285, p. 388-394, 2005. JAFARI, S.M.; ASSADPOOR, E.; HE, Y.; BHANDARI, B. Re-coalescence of emulsion droplets during high-energy emulsification. Food Hydrocolloids, v.22, p.1101-1202, 2008. JAILLON, S.; GALDIERO, M. R.; DEL PRETE, D.; CASSATELLA, M. A, .;GARLANDA C.; MANTOVANI A. Neutrophils in innate and adaptive immunity. Seminars in Immunopathology, v. 35, n. 4, p. 377-94, 2013. JEONG, M.W.; OH, S.G.; KIM, Y.C. Effects of amine oxide compounds on the zeta potential of emulsion droplets stabilized by phosphatidylcholine. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v.181, p. 247-256, 2001. JOHNSON, S.B., FRANKS, G.V.; SCALES, P.J.; BOGER, D.V.; HEALY, T.W. Surface chemistry-rheology relationships in concentrated mineral suspensions. International Journal of Mineral Processing, v. 58, n. 1-4, p. 267-304, 2000. JONES, J. W.; SINGH, P.; GOVIND, C. K. Recruitment of Saccharomyces cerevisiae Cmr1/Ydl156w to Coding Regions Promotes Transcription Genome Wide. PLoS One. v.11, n. 2, 2016. KAH, M.; HOFMANN, T. Nanopesticide research: Current trends and future priorities. Environment International, v. 63, p. 224–235, 2014. KENTISH, S.; WOOSTER, T.J.; ASHOKKUMAR, M.; BALACHANDRAN, S.; MAWSON, R.; SIMONS, L. The use of ultrasonics for nanoemulsion preparation. Innovative Food Science and Emerging Technologies, v. 9, n. 2, p. 170-175, 2008. KIM, H.S; PARK, J.W; KWON, O.K; KIM, J.H; OH, S.R; LEE, H.K; BACH, T.T; QUANG, B.H; AHN, K.S.. Anti-inflammatory activity of a methanol extract from Ardisia tinctoria on mouse macrophages and paw edema. Molecular medicine reports, v.9, p.1388-1394. 2014 KIM, J.H.; KO, J.A.; KIM, J.T.; CHA, D.S.; CHO, J.H.; PARK, H.J.; SHIN, G.H. Preparation of a Capsaicin-Loaded Nanoemulsion for Improving Skin Penetration. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 62, p. 725−732, 2014.
114
KIM, N. D.; LUSTER, A. D. The role of tissue resident cells in neutrophil recruitment. Trends in Immunology. v. 36, n. 9, p. 547–555, 2015. KOLACZKOWSKA, E.; KUBES, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. v.13, n.3, p.159-75, 2013. KONG, M.; PARK, H.J. Stability investigation of hyaluronic acid based nanoemulsion and its potential as transdermal carrier. Carbohydrate Polymers, v. 83, p.1303-1310, 2011. KOURNIATIS, L.R.; SPINELLI, L.S.; MANSUR, C.R.E. Nanoemulsões óleo de laranja/água preparadas em homogeneizadores de alta pressão. Química Nova, Rio de Janeiro, v. 33, n. 2, p. 295-300, jan.2010. KRACHINSKI, S.V. Desenvolvimento e otimização de extrato fitocosmético dos frutos da Rapanea ferruginea e avaliação das atividades anti-oxidante, fotoprotetora e citotóxica. Relatório final do projeto Probic. Julho de 2014. KRACHINSKI, S.V. Desenvolvimento e otimização de extrato fitocosmético dos frutos da Rapanea ferruginea e avaliação das atividades anti-oxidante, fotoprotetora e citotóxica. Relatório final do projeto Probic. Julho de 2014. KUHLMANN, M. Frutos e sementes do cerrado atrativos para fauna: guia de campo. Brasília: Ed. Rede de sementes do cerrado, 2012. 360p. KUMAR, G.P.; RAJESHWARRAO, P. The Nonionic surfactant vesicular systems for effective drug delivery- an overview. Association Acta Pharmaceutica Sinica B, v. 1, n. 4, p. 208-219, 2011. LACHMAN, L.; LIEBERMAN, H.A.; KANIG, J.L. Teoria e Prática na Indústria Farmacêutica. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2001. LALL, N.; MEYER, J.J.M. In vitro inhibition of drug-resistant and drug-sensitive strains of Mycobacterium tuberculosis by ethnobotanically selected South African Plants. Jounal of Ethnopharmacology, v. 66, p.347-354, 1999. LEE, H.N.; SURH, Y.J. Therapeutic potential of resolvins in the prevention and treatment of inflammatory disorders. Biochem Pharmacol. v.84, n.10, p. 1340-50. Nov, 2012. LEE, V.H. Nanotechnology: challenging the limit of creativity in targeted drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 56, p. 1527-1528, 2004. LEITE, J.P.V. Fitoterapia: Bases Cientificas e Tecnológicas. São Paulo: Atheneu, 2009. LIANG, R.; XU, S.; SHOEMAKER, C.F.; LI, Y.; ZHONG, F.; HUANG, Q. Physical and antimicrobial properties of peppermint oil nanoemulsions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 60, p. 7548-7555, 2012.
115
LIN, C.; CHEN, L. Comparison of fuel properties and emission characteristics of two- and three-phase emulsions prepared by ultrasonically vibrating and mechanically homogenizing emulsification methods. Fuel, v.87, p. 2154– 2161, 2008. LIN, T.J.; KURIHARA, H.; OTHA, H. Effects of phase inversion and surfactant location on the formation of O/W emulsions. Journal of Society of Cosmetics Chemists, v. 26, p. 121-139, 1975. LORENZI, H. Árvores Brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas do Brasil. Nova Odessa: Instituto Plantarum de Estudos da Flora, 1992. LORENZI, H.; SOUZA, H. M. Plantas ornamentais no Brasil: arbustivas, herbáceas e trepadeiras. 3 ed. Nova Odessa: Instituto Plantarum de Estudos da Flora, 2000. MAESTRO, A.; SOLÈ; GONZÁLEZ, C.; SOLANS, C.; GUTIÉRREZ, J. M. Influence of the phase behavior on the properties of ionic nanoemulsions prepared by the phase inversion composition method. Journal of Colloid and Interface Science, v. 327, n. 2, p.433-439, 2008. MAKABE, H.; MIYAZAKI.; KAMOT, T.; HIROTA, M. Myrsinoic acid E an antiinflamatory compound from Myrsine seguinii. Bioscience Biotechnology Biochemistry, v.67, n.9, p.2038-2041, 2003 MANGURO, L.O.A.; MIDIWO, J.O.; KRAUS, W.; UGI, I. Benzoquinone derivatives of Myrsine africana and Maesa lanceolata. Phytochemistry, v. 64, p. 855-862, 2003. MARQUES, L.C. Preparação de extratos vegetais. Jornal Brasileiro de Fitomedicina. v. 3, n. 2, p. 74-76, 2005. MARTINS, M.R.F.M; VEIGA, F. Promotores de permeação para a liberação transdérmica de fármacos: uma nova aplicação para as ciclodextrinas. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 38, n. 1, p. 33-54, 2002. MARTINS, Z.R.; CASTRO, D.M.; CASTELLANI, D.C.; DIAS, J.E. Plantas Medicinais. v. 1, Viçosa: UFV, 1994 MAS, J.D. Nanoemulsão contendo extrato da casca de Rapanea ferruginea com atividade anti-inflamatória tópica. 2015, 167f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, SC, 2015. McCLEMENTS, D, J. Nanoemulsions versus microemulsions: terminology, differences and similarities. Soft Matter, Cambridge, v. 8, p. 1719-1729, 2012. McCLEMENTS, D. J. Advances in fabrication of emulsions with enhanced functionality using structural design principles. Current Opinion in Colloid & Interface Science, v.17, n. 5, p. 235–245, 2012.
116
McCLEMENTS, D.J.; RAO, J. Food grade nanoemulsions: formulation, fabrication, properties, performance, biological fate and potencial toxicity. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, New York, v. 51, n. 4, p. 285-330, 2011. McCLEMENTS, D.J.; WEISS. J. Lipid emulsions: Bailey‘s industrial oil and fat products. 3. Ed. New York: John Wiley & Sons, 2005. MENDHAM, J.; DENNEY, R. C.; BARNES, J.D.; THOMAS, M.J.R. Cromatografia em camada fina. In Vogel – Análise Quimica Quantitativa. 6.ed. TC, Rio de Janeiro, 2002. MESQUITA JR, D.; ARAÚJO, J.A. .; CATELAN, T.T.T.; SOUZA, A.W.S. de.; SILVA, N.P. da.; ANDRADE, L.E.C.; CRUVIEL, W de M. Aspectos celulares e moleculares da inflamação. Sinopse de Reumatologia, p. 66 -81, 2008. MIGLIATO, K.F.; MOREIRA, R.R.D.; MELLO, J.C.P.; SACRAMENTO, L.V.S.; CORRÊA, M.A.; SALGADO, H.R.N. Controle da qualidade do fruto de Syzygium cumini (L.) Skeels. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.17, n.1, p. 94-101, 2007. MISHRA, R.K.; SONI, G.C.; MISHRA, R.P. A review article : on nanoemulsion . World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, v. 3, n. 9, p. 258-274, 2014. MIZUSHINA, Y.; MIYAZAKI, S.; IRIYE, R.; HIROTA, M. Novel anti-inflammatory compounds from Myrsine seguinii, terpeno benzoic acids are inhibitors of mammalian DNA polymerase. Biochimica et Biophysica Acta, v.1475, p.1-4, 2000. MOCSAI, A.; WALZOG, B.; LOWELL, C. A. Intracellular signalling during neutrophil Recruitment. Cardiovascular Research. v.107, p. 373–385, 2015. MOMTAZ, S.; LALL, N.; BASSON, A. Inhibitory activities of mushroom tyrosine and DOPA oxidation by plant extracts. South African Journal of Botany, v. 74, p. 577-582, 2008. MORAIS, J. M.; SANTOS, O.D.H.; DELICATO, T.; ROCHA-FILHO, P.A.. Characterization and evaluation of electrolyte influence on canola oil/water nanoemulsion . Journal of Dispersion Science and Technology, v. 27, n. 7, p. 1009-1014, 2006. MORRISON, I.D.; ROSS, S. Emulsions, In: Colloidal dispersions- Suspensions, Emulsions and Foams. New York: Jonh Wiley & Sons, p. 420-455, 2002. MOSTAFA, D.M; EL-ALIM, S.H.A.; ASFOUR, M.H. Transdermal nanoemulsions of Foeniculum vulgare mill. essential oil: preparation, characterization and evaluation of antidiabetic potential. Journal of Drug Delivery Science and Technology, v. 29, p. 99–106, 2015. MUKHERJEE, P.K.; MAITYA, N.; NEMA, N.K.; SARKAR, B K. Bioactive compounds from natural resources against skin aging. Phytomedicine, v. 19, p. 64-73, 2011.
117
MULLER, A.F.F. Desenvolvimento de sistemas nanoemulsionados content extrato de flores de Allamanda cathartica L para aplicação cosmética. 2013. 140f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2013. NAKABAYASHI. K.; AMEMIYA. F.; FUCHIGAMI. T.; MACHIDA. K.; TAKEDA. S.; TAMAMITSUB. K.; ATOBE. M. Highly clear and transparent nanoemulsion preparation under surfactant-free conditions using tandem acoustic emulsification, Chemical Communications, v.47 p. 5765–5767, 2011. NATHAN C. Immunology. Catalytic antibody bridges innate and adaptive immunity. Science. v.13, n.298, p. 2143-2144, dez. 2002. NOURSHARGH, S.; ALON, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Review. v. 41, n. 5, p. 694–707, 2014. NUCHUCHUA, O.; SAKULKU, U.; UAWONGYART, N.; PUTTIPIPATKHACHORN, S.; SOOTTITANTAWAT, A.; RUKTANONCHAI, U. In vitro characterization and (Aedes aegypti) repelent activity of essential-oils-loaded. American Association of Pharmaceutical Scientists, v. 10, n. 4, p. 1234-1242, 2009 . OLIVEIRA. A.G.; SCARPA. M.V.; CORREA, M.A.; CERA, L.F.R.; FORMARIZ, T.P. Microemulsão: Estrutura e aplicações como sistema de liberação de fármacos. Quimica Nova, v. 27, n. 1, p. 131-138, 2004. ORTEGA-GÓMEZ, A.; PERRETTI, M.; SOEHNLEIN, O. Resolution of inflammation: an integrated view. EMBO Molecular Medicine. v. 5, n. 5, p. 661-74, 2013. PASCOTTO, M.C. Rapanea ferruginea (Ruiz & Pav.) Mez. (Mirsynaceae) como uma importante fonte alimentar para aves em uma mata de galeria no interior do Estado de São Paulo. Revista Brasileira de Zoologia, v. 24, n. 3, p. 735-741, 2007. PIORKOWSKI, D.; McCLEMENTS, D.J. Beverage emulsions: Recent developments in formulation, production, and applications. Food Hydrocollois, v. 42, p. 5-41, 2013. PUGLIA, C.; RIZZA, L.; DRECHSLER, M.; BONINA, F. Nanoemulsions as vehicles for topical administration of glycyrrhetic acid: Characterization and in vitro and in vivo evaluation. Drug Delivery, v. 17, n. 3, p, 123-129, 2010. RIBEIRO, R.C.A.; BARRETO, S.M.A.G.; OSTROSKY, E.A.; ROCHA-FILHO, P.A.; VERÍSSIMO, L.M.; FERRARI, M. Production and Characterization of Cosmetic Nanoemulsions Containing Opuntia ficus-indica (L.) Mill Extract as Moisturizing Agent. Molecules, v. 20, p. 2492-2509, 2015. ROLAND, I.; PIEL, G.; DELATTRE, L.; EVRARD, B. Systematic characterization of oil-in-water emulsions for formulation design, International Journal of Pharmaceutics, New York, v.263, p.85-94, 2003.
118
RSRAE. Nanoscience and nanotechnologies: opportunities and uncertainties. Royal Society and Royal Academy of Engineering: Londres, 2004. Disponível em: <www.nanotec.org.uk/finalReport.htm>. Acesso em: 24 abr. 2013. SABERI, A.H.; FANG, Y.; McCLEMENTS, D.J. Fabrication of vitamin E-enriched nanoemulsions: Factors affecting particle size using spontaneous emulsification. J. Colloid and Interface Science, v. 391, p. 95-102, 2013. SAJJADI, S.; ZERFA, M.; BROOKS, B.W. Phase inversion in p-xylene/ water emulsions with the non-ionic surfactant pair: sorbitano monolaurate/ polyoxyethylene sorbitano monolaurate (Span 20/ tween 20). Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v. 252, p. 27-32, 2003. SAKULKU, U.; NUCHUCHUA, O.; UAWONGYART, N.; PUTTIPIPATKHACHORN, S.; SOOTTITANTAWAT, A.; RUKTANONCHAI, U. Characterization and mosquito repelent activity of citronel a oil nanoemulsion. International Journal of Pharmaceutics, v. 372, n. 1-2, p. 105–111, 2009. SANTANA, R. C.; PERRECHIL, F.A.; CUNHA, R. L. High and low energy emulsifications for food applications: a focus on process parameters. Food Engineering. Troy, v. 5, n. 2, p. 107-122, 2013. SANTOS, D.C.M.; DUTRA, I.A. Pré-formulação de nanoemulsão contendo extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea (Myrsinaceae). 2016. 56f. Trabalho de conclusão de concurso (Graduação em Farmácia) – Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2016. SARAF, A.S. Applications of novel drug delivery system for herbal formulations. Fitoterapia, v. 81, p. 680–68, 2010. SCHAFFAZICK, S.R.; GUTERRES, S.S.; FREITAS, L.L.; POHLMANN, A.L. Caracterização e estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados para administração de fármacos. Química Nova, v.26, n.5, p. 726-737, 2003 SCHIBLI, A.; REICH, E. Modern TLC: a key technique for identification and quality control of botanicals and dietary supplements. Journal Planar Chromatograf. -Mod.TLC, v.18, n.101, p. 34-38, 2005. SCHMITT, O. P. Influência de excipients farmacêuticos sobre a eficácia de sistemas conservantes. 2015. 93f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, SC, 2015. SHANMUGAM, A.; ASHOKKUMAR, M. Ultrasonic preparation of stable flax seed oil emulsions in dairy systems—Physicochemical characterization. Food Hydrocolloids, v. 39, p.151–162, 2014.
119
SHERWOOD, E.R.; TOLIVER-KINSKY, T. Mechanisms of the inflammatory response. Best Practice & Research Clinical Anaesthesiology, v. 18, n. 3, p. 385-405, 2004. SINKO, P.J. Martin: físico-farmácia e ciências farmacêuticas. 5 ed. Porto Alegre: Artmed, 2008. SOLANS, C.; IZQUIERDO, P.; NOLLA. J.; AZEMAR, N.; GARCIA – CELMA, M. J. Nanoemulsions. Current Opinion in Colloid and Interface Science, v.10, n.3-4, p.102-110, 2005. SOLANS, C.; SOLÈ, I. Nano-emulsions: formation by low -energy methods. Current Opinion in Colloid & Interface Science, v. 17, n. 5, p.246-254, 2012. SOLÉ, I.; MAESTRO, A.; PEY, C. M.; GONZÁLEZ, C.; SOLANS, C.; GUTÍERREZ, J. M. Nano-emulsions preparation by low energy methods in an ionic surfactant system. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v. 288, p.138-143, 2006. SONNEVILLE-AUBRUN, O.; SIMONNET, J. T.; L‘ALLORET, F. Nanoemulsions a new vehicle for skincare products. Advances in Colloid and Interface Science, Oxford, v. 108-109, p. 145-149, 2004. SOSA, S.; BALICK, M. J.; ARVIGO, R.; ESPOSITO, R.G.; PIZZA, C.; ALTINIER, G.; TUBARO, A. Screening of the topical anti-inflammatory activity of some Central American plants. Journal of Ethnopharmacology, v. 81, p. 211-215, 2002. SOUZA, A.N. Avaliação da atividade anti-inflamatoria do extrato hidroalcolico das folhas Rapanee ferrugínea em camundongos no modelo de bolsa de ar. 2016. Monografia (Graduação) -Curso de Biomedicina, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2016. SPATHELF, P.; BERGER, R.; VACCARO, S.; TONINI, H.; BORSOI, G.A. Crescimento de espécies nativas de uma floresta estacional decidual/ombrófila mista do Rio Grande do Sul. Ciência Florestal, v. 11, n. 2, p. 103-119, 2001. SUGIMOTO, M. A.; SOUSA, L. P.; PINHO, V.; PERRETTI, M.; TEIXEIRA, M. M. Resolution of Inflammation: What Controls Its Onset?. Frontiers in Immunology. v.7, p. 160, 2016. TADROS, T.; IZQUIERDO, P.; ESQUENA, J.; SOLANS, C. Formation and stability of nano-emulsions. Advances in Colloid and Interface Science, v. 108-109, p. 303-318, 2004. TANG, S.Y.; MANICKAM, S.; WEI, T.K.; NASHIRU, B. Formulation development and optimization of a novel Cremophore EL-based nanoemulsion using ultrasound cavitation. Ultrasonics Sonochemistry, v. 19, p. 330-345, 2012. TEO, B.S.; BASRI, M.; ZAKARIA, M.R.; SALLEH, A.B.; RAHMAN, R.N.; RAHMAN, M.B. A potential tocopherol acetate loaded palm oil esters-in-water nanoemulsions
120
for nanocosmeceuticals. Journal of Nanobiotechnology, v. 8, n. 4, p. 1 -11, fev. 2010. THAKUR, N.; GARG, G.; SHARMA, P.K.; KUMAR, N. Nanoemulsions: a review on various pharmaceutical application. Global Journal of Pharmacology, v. 6, n. 3, p. 22-225, 2012. THOMSON, J.E. A prática farmacêutica na manipulação de medicamentos. Porto Alegre: Artmed, 2006. TOMIO, T.A. Atividade citotóxica e antitumoral dos extratos e compostos isolados de Rapanea ferruginea e Piper aduncun. 2011. 171f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2011. TURMINA, M. Estudo fitoquímico com as cascas da Rapanea sp.2005. 35f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) –Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2005. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE – USDA. Dr. Duke‘s phytochemical and etnobotanical databases. Base de dados. Disponível em: http://www.ars-grin.gov/duke/. Acesso em: 20 jun 2016. VALENTE, L.M. M.; ALVES, F. F.; BEZERRA, G. M.; ALMEIDA, M. B. S.; ROSARIO, S.L.; MA EI, J.L.; D‘ VILA, L.A.; SIANI, A.C. Desenvolvimento e aplicação de metodologia por cromatografia em camada delgada para determinação do perfil de alcalóides oxindólicos pentacíclicos nas espécies sul-americanas do gênero Uncaria. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.16, n. 2, p. 216-223, 2006. WANG, X.; JIANG, Y.; WANG, Y.; HUANG, M.; HO, C.; HUANG, Q. Enhancing anti-inflammation activity of curcumin trough O/W nanoemulsions. Food Chemistry, v. 108, p. 419-424, 2008. WENG, C.C.V. Estudo de estabilidade preliminar e acelerada de nanoemulsões contendo óleo de chia (Salvia hispanica L.) para uso tópico. 2015. 101f. Trabalho de conclusão de concurso (Graduação em Farmácia) – Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2015. WIĄCEK, A.; CHIBOWSKI, E. eta potential, effective diameter and multimodal size distribution in oil/water emulsion. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering, v.159, p. 253–261, 1999. XAVIER, B.B. Desenvolvimento tecnológico e avaliação biológica de sistemas nanodispersos contendo extrato dos frutos da Rapanea ferruginea. 2014. 117f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, SC, 2014. XAVIER, B.B.; COUTO, A.G.; ZERMIANI, T.; BRESOLIN, T.M.B.; MALHEIROS, A.; DE SOUZA, M.M. Enhancement of antinociceptive effect of Rapanea ferruginea fruits extract in mice when administered as nanoemulsions. In: Simpósio
121
Internacional de Sistemas de Liberação de Fármacos, 1, 2015 Maringá: Anais 1st international symposium on drug delivery sytems: proceedings. Maringá, 2015. p.77. ZERMIANI, T.; DAL MAS, J.; XAVIER, B. B.; MALHEIROS, A.; SILVA, DA, R. M. L.; COUTO, G. A.; BRESOLIM, B. M. T. Stability indicating hplc method for determination of myrsinoic acids a and b in rapanea ferruginea extracts and nanoemulsions. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, v. 6, n. 11, p. 4639-4649, 2015. ZHONGCHENG, K.; XUEFENG, H,; XIAO-BIN, J. Design and optimization of self-nanoemulsifying drug delivery systems for improved bioavailability of cyclovirobuxine D. Drug Design, Development and Therapy, v. 10, p. 2049–2060, 2016. ZORZI, G.K.; CAREGNATO, F.; MOREIRA, J.C.F.; TEIXEIRA, H.F.T.; CARVALHO, E.L.S. Antioxidant Effect of Nanoemulsions Containing Extract of Achyrocline satureioides (Lam) D.C.—Asteraceae. PharmSciTech, v. 17, n. 4, 2016.
122
123
APÊNDICES
Tabela 1: Características das formulações no tempo de 24 horas e após 30 dias de seu desenvolvimento.
CARACTERIZAÇÃO QUANTO A MORFOLOGIA DAS FORMULAÇÕES
FORMULAÇÕES
TAMANHO DE GOTÍCULA Médias (s)
(24 HORAS)
TAMANHO DE GOTÍCULA Médias (s) (30 DIAS)
PDI Média (s)
(24 HORAS)
PDI Média (s) (30 DIAS)
POTENCIAL ZETA
Médias (s) (24 HORAS)
POTENCIAL ZETA
Médias (s) (30 DIAS)
GR
UP
O 1
NE 1.1 130,15 (1,06) 141,40 (1,41) 0,118 (0,01) 0,111 (0,00) -16,15 (0,64) -17,70 (0,14)
NE 1.2 113,85 (0,21) 129,30 (3,11) 0,175 (0,02) 0,141 (0,02) -38,30 (5,09) -38,00 (4,10)
NE 1.3 124,35 (7,14) 132,10 (12,3) 0,200 (0,01) 0,165 (0,01) -40,95 (1,20) -48,35 (6,15)
NE 1.4 120,45 (2,05) 137,25 (21,4) 0,167 (0,14) 0,200 (0,10) -42,10 (0,42) -46,80 (7,92)
GR
UP
O 2
NE 2.1 148,10 (0,28) 161,40 (3,54) 0,128 (0,01) 0,122 (0,01) -17,20 (0,71) -15,85 (0,92)
NE 2.2 158,55 (6,43) 168,30 (7,92) 0,158 (0,02) 0,123 (0,01) -38,80 (2,83) -37,45 (1,63)
NE 2.3 167,40 (5,80) 182,4 (10,32) 0,149 (0,02) 0,128 (0,03) -42,05 (1,91) -44,95 (1,63)
NE 2.4 158,10 (6,51) 172,55 (7,99) 0,152 (0,02) 0,119 (0,02) -45,05 (2,05) -45,20 (0,85)
GR
UP
O 3
NE 3.1 191,25 (7,14) 207,00 (5,23) 0,144 (0,03) 0,129 (0,04) -15,05 (0,69) -13,15 (1,63)
NE 3.2 189,90 (7,64) 209,20 (7,78) 0,157 (0,03) 0,142 (0,01) -39,40 (0,42) -32,60 (1,56)
NE 3.3 191,40 (0,42) 209,15 (4,17) 0,123 (0,01) 0,145 (0,02) -42,25 (0,92) -40,50 (2,12)
NE 3.4 180,70 (4,10) 199,25 (0,78) 0,127 (0,03) 0,156 (0,02) -46,70 (4,24) -41,40 (6,36)
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente.
124
Tabela 2: Características das formulações durante o estudo de estabilidade preliminar (ciclo 28 dias).
Condições (tempo e
temperatura)
Tempo zero Ciclo gelo-degelo (5°C/40°C)
A cada 24 horas Controles
24 Horas 14 Dias 28 Dias 28 Dias (±5°C)
28 Dias (±25°C)
Tamanho médio de gotícula (nm) – médias (s)
NE 1.1 140,95 (4,45) 151,20 (2,12) 150,35 (1,48) 145,50 (3,82) 149,20 (3,82)
NE 1.4 139,80 (0,71) 146,10 (2,26) 145,45 (1,06) 145,10 (2,26) 147,20 (0,71)
NE 2.1 175,45 (9,12) 182,60 (14,14) 185,25 (5,30) 181,50 (7,35) 185,40 (5,23)
NE 2.4 176,20 (6,79) 181,30 (5,37) 179,30 (4,53) 178,25 (8,70) 178,50 (7,64)
NE 3.1 184,60 (8,63) 182,20 (3,39) 193,35 (1,48) 187,55 (5,06) 183,40 (5,09)
NE 3.4 192,60 (6,08) 197,60 (4,53) 195,55 (11,53) 197,90 (5,52) 197,45 (7,85)
Indice de polidispersão (PDI) – médias (s)
NE 1.1 0,131 (0,03) 0,104 (0,00) 0,129 (0,00) 0,149 (0,00) 0,125 (0,03)
NE 1.4 0,133 (0,00) 0,123 (0,01) 0,140 (0,00) 0,144 (0,01) 0,150 (0,01)
NE 2.1 0,181 (0,02) 0,142 (0,02) 0,163 (0,02) 0,161 (0,03) 0,170 (0,05)
NE 2.4 0,141 (0,01) 0,145 (0,01) 0,139 (0,01) 0,137 (0,01) 0,145 (0,00)
NE 3.1 0,194 (0,04) 0,169 (0,02) 0,171 (0,01) 0,189 (0,03) 0,169 (0,00)
NE 3.4 0,173 (0,01) 0,154 (0,00) 0,133 (0,00) 0,155 (0,00) 0,161 (0,00)
Potencial zeta – médias (s)
NE 1.1 -17,40 (0,14) -17,75 (0,21) -16,35 (0,21) -15,50 (0,85) -15,20 (1,98)
NE 1.4 -40,90 (0,85) -45,00 (9,62) -41,20 (5,09) -41,40 (2,12) -40,35 (0,92)
NE 2.1 -18,10 (2,55) -20,35 (2,90) -19,45 (2,05) -19,40 (1,70) -17,65 (3,32)
NE 2.4 -47,45 (1,91) -46,00 (0,85) -43,60 (3,25) -43,25 (0,49) -43,00 (1,70)
NE 3.1 -17,70 (0,28) -19,10 (0,99) -19,40 (0,14) -17,90 (1,41) -16,50 (0,85)
NE 3.4 -44,45 (0,78) -44,75 (3,32) -44,30 (4,38) -44,40 (0,14) -46,70 (1,13)
Valor de pH – medias (s)
NE 1.1 6,59 (0,04) 6,39 (0,02) 6,11 (0,04) 6,18 (0,07) 6,29 (0,11)
NE 1.4 5,27 (0,04) 5,24 (0,07) 5,08 (0,04) 5,22 (0,07) 5,15 (0,01)
NE 2.1 6,54 (0,09) 6,23 (0,06) 6,09 (0,01) 6,15 (0,04) 6,16 (0,10)
NE 2.4 5,38 (0,01) 5,24 (0,01) 5,13 (0,04) 5,22 (0,03) 5,18 (0,04)
NE 3.1 6,61 (0,05) 6,34 (0,04) 6,75 (0,16) 6,18 (0,05) 6,51 (0,54)
NE 3.4 5,35 (0,08) 5,22 (0,06) 5,07 (0,02) 5,25 (0,07) 5,16 (0,07)
*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole.
125
Tabela 3: Características das formulações durante o estudo de estabilidade preliminar (ciclo 14 dias).
Condições (tempo e
temperatura)
Tempo zero Ciclo gelo-degelo (5°C/40°C)
A cada 24 horas Controles
24 Horas 7 Dias 14 Dias 14 Dias (±5°C)
14 Dias (±25°C)
Tamanho médio de gotícula (nm) – médias (s)
NE 3.1 – T 15
164,05(10,96) 164,25(25,67) 186,05(20,29) 170,60 (9,62) 176,50 (5,23)
NE 3.4 – T 15
135,05 (0,21) 156,0(14,85) 145,15 (3,89) 137,00 (1,56) 140,55 (0,07)
NE 3.1 – T 20
105,00 (2,12) 119,30 (2,83) 130,00 (3,54) 107,95 (3,61) 123,00 (0,57)
N2 3.4 – T 20 98,26 (1,27) 108,50 (0,57) 114,05 (0,07) 102,50 (0,00) 110,70 (1,70)
Indice de polidispersão (PDI) – médias (s)
NE 3.1 – T 15
0,141 (0,04) 0,121 (0,04) 0,107 (0,03) 0,133 (0,06) 0,112 (0,02)
NE 3.4 – T 15
0,186 (0,01) 0,168 (0,02) 0,175 (0,01) 0,174 (0,02) 0,178 (0,02)
NE 3.1 – T 20
0,187 (0,02) 0,146 (0,03) 0,141 (0,01) 0,171 (0,00) 0,163 (0,01)
N2 3.4 – T 20 0,200 (0,01) 0,205 (0,00) 0,185 (0,01) 0,189 (0,01) 0,182 (0,01)
Potencial zeta – médias (s)
NE 3.1 – T 15
-14,95 (0,92) -17,95 (0,21) -16,40 (1,98) -18,10 (0,85) -16,25 (0,21)
NE 3.4 – T 15
-38,15 (4,03) -44,05 (1,77) -42,40 (1,70) -37,30 (1,27) -42,40 (2,83)
NE 3.1 – T 20
-11,85 (0,21) -17,70 (4,38) -17,15 (0,64) -14,65 (0,21) -17,00 (0,85)
N2 3.4 – T 20 -42,40 (2,26) -41,70 (6,08) -43,10 (1,41) -36,35 (0,35) -49,35 (0,49)
Valor de pH – medias (s)
NE 3.1 – T 15
6,94 (0,11) 6,65 (0,15) 6,56 (0,04) 6,90 (0,01) 6,98 (0,25)
NE 3.4 – T 15
5,58 (0,01) 5,61 (0,01) 5,46 (0,20) 5,35 (0,04) 5,17 (0,01)
NE 3.1 – T 20
7,05 (0,06) 6,79 (0,31) 6,39 (0,16) 6,85 (0,06) 6,41 (0,10)
N2 3.4 – T 20 5,68 (0,04) 5,33 (0,04) 5,27 (0,05) 5,47 (0,01) 5,54 (0,04)
*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.
126
Tabela 4: Características das formulações durante o estudo de estabilidade acelerada (90 dias).
Formulações
Tempos de análises
24 h 30 Dias 60 Dias 90 Dias 24 h 30 Dias 60 Dias 90 Dias 24 h 30 Dias 60 Dias 90 Dias
condiçoes Tamanho médio de gotículas (nm) –
médias (s) Índice de polidispersão – pdi
médias (s) Potencial zeta
médias (s)
Am
bie
nte
(±30 °
C) NE 3.1 – T15
(C1) 246,0 (34,3)
262,6 (3,00)
294,0 (5,55)
305,3 (7,11)
0,274 (0,04)
0,239 (0,00)
0,178 (0,01)
0,226 (0,01)
-17,8 (0,55)
-19,0 (0,41)
-16,8 (0,57)
-20,7 (0,36)
NE 3.4 – T15 (C1)
183,9 (2,05)
200,5 (176)
176,8 (0,95)
167,1 (1,30)
0,270 (0,01)
0,260 (0,02)
0,260 (0,01)
0,257 (0,01)
-38,6 (0,32)
-39,7 (0,56)
-42,5 (1,44)
-36,8 (0,64)
NE 3.1 – T15
(C2) 189,4 (0,82)
183,2 (1,35)
277,3 (3,95)
207,2 (1,96)
0,142 (0,02)
0,140 (0,02)
0,237 (0,01)
0,102 (0,02)
-17,1 (0,38)
-15,6 (0,26)
-21,1 (0,29)
-17,5 (0,40)
NE 3.4 – T15 (C2)
203,5 (1,57)
164,3 (1,27)
172,8 (1,18)
176,5 (0,95)
0,329 (0,04)
0,287 (0,00)
0,305 (0,01)
0,310 (0,01)
-40,4 (0,87)
-39,0 (0,75)
-40,7 (0,35)
-39,9 (0,36)
Estu
fa (
±40°
C)
NE 3.1 – T15 (C1)
--------- 285,1 (4,31)
309,3 (0,61)
304,3 (3,29)
---------- 0,235 (0,02)
0,204 (0,01)
0,194 (0,04)
--------- -19,3 (0,40)
-17,8 (0,20)
-14, 5 (0,61)
NE 3.4 – T15 (C1)
--------- 269,5 (2,27)
166,3 (1,25)
173,7 (0,32)
---------- 0,250 (0,01)
0,244 (0,02)
0,261 (0,01)
--------- -41,1 (0,20)
-39,7 (0,50)
-37,1 (0,68)
NE 3.1 – T15
(C2) ---------
222,1 (3,78)
263,2 (6,44)
225,0 (2,94)
---------- 0,069 (0,01)
0,171 (0,01)
0,023 (0,01)
--------- -18,1 (0,41)
-16,8 (0,95)
-18,1 (0,76)
NE 3.4 – T15 (C2)
--------- 176,4 (1,87)
164,0 (0,95)
152,1 (0,95)
---------- 0,302 (0,01)
0,289 (0,01)
0,244 (0,02)
--------- -38,0 (0,60)
-39,1 (0,52)
-37,0 (0,17)
Gela
deir
a (
±5°C
)
NE 3.1 – T15 (C1)
--------- 237,7 (5,29)
234,9 (5,60)
246,7 (1,80)
---------- 0,289 (0,01)
0,282 (0,04)
0,259 (0,01)
--------- -18,3 (0,23)
-19,6 (0,38)
-18,3 (0,15)
NE 3.4 – T15 (C1)
--------- 201,2 (0,51)
218,6 (1,22)
215,7 (1,55)
--------- 0,263 (0,01)
0,242 (0,01)
0,257 (0,01)
--------- -39,6 (0,76)
-40,6 (0,78)
-41,2 (0,26)
NE 3.1 – T15 (C2)
--------- 193,1 (1,23)
196,2 (3,40)
203,4 (1,55)
--------- 0,145 (0,01)
0,109 (0,01)
0,196 (0,03)
--------- -18,3 (0,55)
-19,2 (0,35)
-16,7 (0,70)
NE 3.4 – T15 (C2)
--------- 183,7 (1,36)
189,7 (4,40)
182,3 (0,90)
---------- 0,293 (0,02)
0,328 (0,04)
0,300 (0,01)
--------- -40,4 (0,46)
-43,8 (0,35)
-40,7 (0,10)
* O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante. *s (desvio padrão).
127
Tabela 5: Valores de pH das nanoemulsões durante o estudo de estabilidade acelerada (90
dias). *O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.
Condições Temperatura
Formulações 24 Horas 90Dias
Ambiente (±25 °C)
NE 3.1 – T15 (C1) 6,12 (0,02) 5,06 (0,04)
NE 3.4 – T15 (C1) 4,96 (0,07) 4,81 (0,02)
NE 3.1 – T15 (C2) 6,15 (0,03) 6,08 (0,02)
NE 3.4 – T15 (C2) 5,16 (0,04) 5,06 (0,01)
Estufa
(±40° C)
NE 3.1 – T15 (C1) --------- 4,94 (0,01)
NE 3.4 – T15 (C1) --------- 4,93 (0,01)
NE 3.1 – T15 (C2) --------- 5,24 (0,06)
NE 3.4 – T15 (C2) --------- 5,73 (0,03)
Geladeira
(±5° C)
NE 3.1 – T15 (C1) --------- 6,93 (0,04)
NE 3.4 – T15 (C1) --------- 5,50 (0,04)
NE 3.1 – T15 (C2) -------- 6,33 (0,04)
NE 3.4 – T15 (C2) --------- 5,23 (0,04)
128
129
ANEXOS
Anexo A - Parecer Comissão de Ética no uso de animais – CEUA/UNIVALI.
130