Perché è importante determinare la struttura primaria delle proteine? 1. La conoscenza della sequenza amminoacidica delle proteine è essenziale per comprendere i loro meccanismi di azione 2 Il f t f l di ti l h h 2. Il confronto fra le sequenze di proteine analoghe ha permesso di comprendere il funzionamento delle proteine e ha indicato collegamenti evoluzionistici fra le proteine e gli organismi che le producono organismi che le producono 3. L’analisi della sequenza amminoacidica ha portato ad importanti applicazioni cliniche poiché molte malattie sono causate da mutazioni legate ad un cambiamento amminoacidico nella sequenza proteica
Transcript
Perché è importante determinare la struttura primaria delle proteine?
1. La conoscenza della sequenza amminoacidica delle proteine è essenziale per comprendere i loro meccanismi di azione
2 Il f t f l di t i l h h2. Il confronto fra le sequenze di proteine analoghe ha permesso di comprendere il funzionamento delle proteine e ha indicato collegamenti evoluzionistici fra le proteine e gli organismi che le produconoorganismi che le producono
3. L’analisi della sequenza amminoacidica ha portato ad q pimportanti applicazioni cliniche poiché molte malattie sono causate da mutazioni legate ad un cambiamento amminoacidico nella sequenza proteica
1. Preliminari a.Denaturazionedelle proteine
b. Riduzione e alchilazione
dei ponti disolfuro
cc.Determinazione delle subunità
2. Analisi dei segmenti a.Frammentare le subunità
in peptidi
b. Degradazione di
Edman
3. Ricostruzione dellasequenza
a.Allineamento di sequenze
b. Assegnazione
disolfuri
a.Denaturazionedelle proteine
1. Preliminari
Le proteine vengono denaturate in condizioni acide o basiche, a bassa concentrazione salina, a elevate temperature oppure usando agenti denaturanti come l’UREA e lo ione guanidinio o detergenti come l’ SDScome l’UREA e lo ione guanidinio o detergenti come l’ SDS.
b. Riduzione e alchilazione
dei ponti disolfuro
Serve per prevenire la conformazione nativa della proteina che può ostruire l’azione degli agenti proteolitici usati nella determinazione della struttura primaria
Reazione di riduzione dei ponti disolfuro con 2-mercaptoetanolo
NH
CHH2CSCH
C
H2C
O
O
S S
H2C
COH+
2CH
C
C
O
O
S
NH
CH C S HS CH2
2
O
NH
CH
C
H2C
O
SH
NH
CH
C
H2C
O
HS HO
H2C
CH2
SS
H2C
CH2
OH+ +
O
Agente alchilante:-acido iodioacetico
O O
Reazione di alchilazione delle cisteine
CH
C
H2C
O
SH I
H2C
CO-
CH
C
H2C
O
S
H2C
CO-
++ HI
NH O NH O
c.Determinazione delle subunità
L’identificazione dei residui N- e C- terminali permette di stabilire il numero di subunità (catene polipeptidiche) da cui è costituita una proteina.
Identificazione del residuo N-terminale:- dansil cloruro
Separazione, purificazione e caratterizzazione delle subunità
Se una proteina risulta costituita da più subunità, queste devono essere separate usando i metodi di purificazione quali IEC, GFC, ecc. e caratterizzate mediante SDS-PAGE o spettrometria di massa per stabilirne il peso molecolare
Identificazione del residuo C-terminale:
Non esistono procedure paragonabili a quelle della determinazione del residuo N terminaledeterminazione del residuo N-terminale.
Esistono enzimi che tagliano al C-terminale, come le carbossipeptidasi.
Le carbossipeptidasi tagliano al C-terminale con una velocità che dipende dal tipo di amminoacido e che è indipendente dalla posizione dell’amminoacido nella sequenzaposizione dell amminoacido nella sequenza.
Esistono metodi chimici per identificare i residui C-terminali, quali l’idrazinolisi, mediante l’uso di idrazina. Tale processo è però soggetto a molte reazioni secondarie.
a.Frammentare le subunità
in peptidi
2. Analisi dei segmenti
Ciascuna subunità può essere frammentata in peptidi sia enzimaticamente sia chimicamente. In entrambe i casi il processo di cleavage deve essere completo e altamente specifico in modo tale che la sequenza dei frammenti peptidici, quando correttamente riordinati, è quella della subunità intatta.
Cleavage con Tripsina
L’ RPC HPLC è diventata la procedura di routine per la separazione di peptidi.
Reazione di cleavage con Tripsina
CH2
CH2
NH2Lys(or Arg)
CH2
CH2
NH2
H
CH2
CH2
CH2
O
H2O
Tripsina
H
CH2
H
CH2
CH2
O
HN CH C O-
O
+H3N CH C
R
+HN CH C
HN
O
CH C
R
Frammentazione con CNBr
CH3 CH3Met
H
H2C
O
CH2
S C NBr Br-
H2CCH2
+S C N
HN CH
C
HN
O
CH C
O
HN CH
C
HN
O
CH C
O
R R
H2C
S
CH3
C N+
HN CH
H2CO
H2C
H O
Peptidilomoserinalattone
Metiltiocianato
HN CH
C
H2CO
C
O
CC
O
CH C
O
+H3N+
H2O
N CH C
RR
3
b. Degradazione di
EdmanUna volta ottenuti frammenti peptidici “manegevoli”, la sequenza amminoacidica può essereUna volta ottenuti frammenti peptidici manegevoli , la sequenza amminoacidica può essere determinata mediante cicli ripetuti della degradazione di Edman
RPC HPLCUV detector
Possono essere identificati residui N-terminali di peptidi lunghi fino a 40-60 amminoacidi prima che gli effetti di reazioni incomplete, di reazioni non specifiche e di perdita di peptidi facciano si che l’identificazione amminoacidica non possa essere completabile.
1.1. Il reagente di Edman, Il reagente di Edman, fenilisotiocianato fenilisotiocianato (PITC), reagisce con il gruppo amminico (PITC), reagisce con il gruppo amminico NN--terminale di un polipeptide in condizioni blandamente alcaline, per formare il terminale di un polipeptide in condizioni blandamente alcaline, per formare il feniltiocarbamilefeniltiocarbamile (PTC)(PTC)
2.2. Tale addotto è trattato con acido trifluoroacetico (FTale addotto è trattato con acido trifluoroacetico (F33CCOOH) anidro, che CCOOH) anidro, che libera il residuo Nlibera il residuo N terminale sotto forma di derivato tiazolinonico senzaterminale sotto forma di derivato tiazolinonico senzalibera il residuo Nlibera il residuo N--terminale sotto forma di derivato tiazolinonico, senza terminale sotto forma di derivato tiazolinonico, senza idrolizzare gli altri legami peptidiciidrolizzare gli altri legami peptidici
3.3. Il derivato tiazolinoneIl derivato tiazolinone--amminoacido è estratto selettivamente con un solvente amminoacido è estratto selettivamente con un solvente organico ed è convertito nel più stabile derivato organico ed è convertito nel più stabile derivato feniltioidantoina feniltioidantoina (PTH) mediante (PTH) mediante trattamento con un acido in soluzione acquosatrattamento con un acido in soluzione acquosa
Identificazione del Identificazione del PTHPTH--aa Naa N--terminaleterminalemediante cromatografiamediante cromatografiagg
Il tipo di amminoacido è identificato con una cromatografia per Il tipo di amminoacido è identificato con una cromatografia per mezzo di amminoacidi standard di riferimento mezzo di amminoacidi standard di riferimento
a.Allineamento di sequenze
3. Ricostruzione dellasequenza
L’allineamento di sequenza viene fatto mettendo a confronto le sequenze amminoacidiche di un set di frammenti peptidici con quelli di un secondo set i cui siti di cleavage si sovrappongono con quelli del primo set. La proteina viene ridotta prima del cleavage!
Ad es. Primo set di peptidi ottenuti con Tripsina (che taglia Lys/Arg al C terminale)Secondo set di peptidi ottenuto con CNBr (che taglia Met al C terminale)
Determinazione del segmento C-terminale
Ricostruzione della sequenza
M
Sequenza finale
b. Assegnazione
disolfuri
Lo step finale nell’analisi della sequenza amminoacidica è quello di determinare la posizione dei ponti disolfuro.
Si taglia la proteina (ad es. con Tripsina) in forma nativa non ridotta per mantenere intatti i ponti disolfuro
A
B
Separiamo i peptidi ( A e B) mediante HPLC
Determiniamo le sequenze N-terminali di ciascun peptide
?
Si determina, mediante la conoscenza della sequenza amminoacidica, in quale peptide ci sono due Cisteine e si sceglie una seconda proteasi (o CNBr) che taglia inpeptide ci sono due Cisteine e si sceglie una seconda proteasi (o CNBr) che taglia in due il peptide contenente le due cisteine
Struttura finale della proteina con i ponti disolfurop p
SequencingMaster.swf
DEGRADAZIONE DI EDMANDEGRADAZIONE DI EDMAN
1.1. Il reagente di Il reagente di EdmanEdman, , fenilisotiocianatofenilisotiocianato (PITC), reagisce con il gruppo amminico (PITC), reagisce con il gruppo amminico
NN--terminaleterminale di un polipeptide in condizioni blandamente alcaline, per formdi un polipeptide in condizioni blandamente alcaline, per formare il are il
feniltiocarbamilefeniltiocarbamile (PTC)(PTC)
2.2. Tale addotto Tale addotto èè trattato con acido trattato con acido trifluoroaceticotrifluoroacetico (F(F33CCOOH) anidro, che CCOOH) anidro, che
libera il residuo libera il residuo NN--terminaleterminale sotto forma di derivato sotto forma di derivato tiazolinonicotiazolinonico, senza , senza
idrolizzare gli altri legami peptidiciidrolizzare gli altri legami peptidici
3.3. Il derivato Il derivato tiazolinonetiazolinone--amminoacidoamminoacido èè estratto selettivamente con un solvente estratto selettivamente con un solvente
organico ed organico ed èè convertito nel piconvertito nel piùù stabile derivato stabile derivato feniltioidantoinafeniltioidantoina (PTH) mediante (PTH) mediante
trattamento con un acido in soluzione acquosatrattamento con un acido in soluzione acquosa
Derivato feniltioidantoina (PTH)
(più stabile)
Derivato tiazolinonico
N
H
NH3R
R'
O
S
N
O
+NNH
O
S
R
Analisi tramite HPLC
Condizioni blande acide
in acqua
N C S + NH23N
O
R H
R'
O Condizioni basicheN C NH
H
N
O
R H
R'
O
S H
TFA 100% anidro
conversione
Identificazione del Identificazione del PTHPTH--aaaa NN--terminaleterminale
mediante cromatografiamediante cromatografia
Separazione dei 20 Separazione dei 20 PTHPTH--aaaa
Il tipo di amminoacido Il tipo di amminoacido èè identificato con una cromatografia per identificato con una cromatografia per
mezzo di amminoacidi standard di riferimento mezzo di amminoacidi standard di riferimento
Dopo circa 30 cicli diventa difficile Dopo circa 30 cicli diventa difficile
determinare la sequenza determinare la sequenza
amminoacidicaamminoacidica. Ciò accade perch. Ciò accade perchéé, ,
dopo un numero elevato di cicli, gli dopo un numero elevato di cicli, gli
effetti cumulativi di reazioni effetti cumulativi di reazioni
incomplete e di reazioni secondarie incomplete e di reazioni secondarie
del processo di degradazione di del processo di degradazione di
EdmanEdman rendono impossibile una rendono impossibile una
identificazione certa identificazione certa
delldell’’amminoacido rilasciato e quindi amminoacido rilasciato e quindi
della sequenza della sequenza amminoacidicaamminoacidica..
Per tale motivo la proteina da Per tale motivo la proteina da
sequenziaresequenziare èè scissa in piccoli scissa in piccoli
frammenti frammenti polipeptidicipolipeptidici..
Una volta determinata la sequenza di Una volta determinata la sequenza di
ognuno di essi, si procede con la ognuno di essi, si procede con la
determinazione della sequenza della determinazione della sequenza della
proteina completa mediante il proteina completa mediante il
principio della principio della
sovrapposizione dei peptidisovrapposizione dei peptidi. .
Determinazione della sequenza N-terminale di ciascun peptide
Nter-----------Kcter 1° peptide
Nter------Kcter 2° peptide
Nter------Rcter 3° peptide
Nter------------Rcter 4° peptide
Nter---------Kcter 5° peptide
Nter----------Cter 6° peptide
3 6 5 2 4 1
••EE’’ necessario adoperare un metodo diverso per generare una necessario adoperare un metodo diverso per generare una
serie di frammenti peptidici differentiserie di frammenti peptidici differenti
•• Anche in questo caso si procederAnche in questo caso si procederàà alla determinazione della alla determinazione della
sequenza sequenza NN--terminaleterminale di ciascun peptide ottenutodi ciascun peptide ottenuto
•• Le due serie di sequenze peptidiche sovrapposte consentono Le due serie di sequenze peptidiche sovrapposte consentono
di ricostruire la sequenza di ciascun polipeptide di ricostruire la sequenza di ciascun polipeptide
I risultanti gruppi I risultanti gruppi sulfidrilicisulfidrilici liberi sono alchilati, liberi sono alchilati,
di norma mediante trattamento con di norma mediante trattamento con iodoacetatoiodoacetato, ,
per prevenire la riformazione dei ponti per prevenire la riformazione dei ponti disolfuricidisolfurici
attraverso ossidazione da parte di Oattraverso ossidazione da parte di O22
ii. Identificazione del residuo amino terminale
� marcatura con cloruro di dansile
� idrolisi(a)
(b) degradazione di Edman: rimozione di un amminoacido
alla volta dall’estremità NH2-terminale
Il composto fluorescente Il composto fluorescente dansildansil clorurocloruro reagisce con le ammine primarie formando polipeptidi reagisce con le ammine primarie formando polipeptidi
dansilatidansilati. Il trattamento di un polipeptide . Il trattamento di un polipeptide dansilatodansilato con un acido in soluzione acquosa ad alta con un acido in soluzione acquosa ad alta
temperatura idrolizza i suoi legami peptidici ed il residuo temperatura idrolizza i suoi legami peptidici ed il residuo NN--terminaleterminale risulta cosrisulta cosìì libero. libero.
Questo derivato può poi essere separato dagli altri amminoQuesto derivato può poi essere separato dagli altri amminoacidi per via cromatografica ed acidi per via cromatografica ed
identificato grazie alla sua intensa fluorescenza gialla.identificato grazie alla sua intensa fluorescenza gialla.
a-c ⇒ Ala
c-e ⇒ Gly
Degradazione di Edman ⇒ Lunghezza massima ≈ 50 residui
perdita di attendibilità
Tagli specifici con metodi chimici o enzimatici
Reagente Sito di taglio
Taglio chimico
Bromuro di cianogeno Lato carbossilico di residui Met
O-iodobenzoato Lato carbossilico di residui Trp
Idrossilammina Legami Asp-Gly
2-Nitro-5-tiocianobenzoato Lato aminico di residui di Cys
Taglio enzimatico
Tripsina Lato carbossilico di residui Lys e Arg
Clostripaina Lato carbossilico di residui Arg
Proteasi dello Stafilococco Lato carbossilico di residui Asn e Gln
Prima proteina sequenziata
Sanger F., Tuppy H. (1951) “The amino-acid sequence in the
phenylalanyl chain of insulin 2. The investigation of peptides
from enzymic hydrolysates.” Biochem. J. 49:481-490
Si dimostró che la sequenza era costituita solo da L-aminoacidi
uniti tra loro da legami peptidici fra i gruppi αααα-amminici e i gruppi αααα-carbossilici
La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP
Denaturare e separare su gel di poliacrilammide
ddTTP ddCTP ddGTP ddATP
GEL SANGER
G A T G G A T G G A T G G A T G G A T G
Metodo di Maxam e GilbertDNA singolo filamento
marcato ad una estremità
4 o 5 reazioni di modificazione
base-specifiche
Rottura del filamento in
corrispondenza della base
modificata mediante piperidina
Es. metilazione delle G con
dimetilsolfato
Separare i frammenti marcati su gel
di acrilammide
Reazioni base-specifiche
Gel di poliacrilammide di sequenza
SEQUENZIATORE AUTOMATICO
SEQUENZIAMENTO AUTOMATIZZATO
Si utilizza una variante del metodo di Sanger, che prevede l’utilizzo di marcatori fluorescenti.
Il marcatore fluorescente viene attaccato ai ddNTP(o dei primers) , utilizzando un fluoroforo differente per ciascun ddNTP.
Le catene che terminano con A sono quindi marcate con un fluoroforo, quelle che terminano con C con un secondo fluoroforo, etc etc, pertanto le quattro famiglie di catene terminate presenteranno 4 colori diversi.
Non c’è bisogno di allestire 4 provette, ognuna per ogni dideossi.
Tutti e 4 i dideossi marcati col fluoroforo sono aggiunti nella stessa provetta, e i frammenti di DNA colorati vengono separati in una singola corsa elettroforetica mediante un gel contenuto in un tubo capillare (elettroforesi capillare: un metodo che consente separazioni ottimali e molto rapide.)
I frammenti migrano attraverso il gel, che è collegato ad un sistema laser per la
rivelazione delle fluorescenza.
In tempo reale (non appena la bande passano davanti al rivelatore) viene identificato
