Perché Real-Time?

Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati e quantitativi

Real time PCR

impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo

segue la stessa cinetica della reazione

PCR. La misurazione della fluorescenza dà in tempo

reale la quantità dello specifico prodotto di PCR

impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo

segue la stessa cinetica della reazione

PCR. La misurazione della fluorescenza dà in tempo

reale la quantità dello specifico prodotto di PCR Termociclator

e con detector per fluorocromi e software per analisi dati

Linea di base (baseline): valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificatoLinea soglia (Threshold): scelta dall’operatore in modo da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenzialeCiclo soglia: E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold

Real time PCR

Linea soglia scelta dall’operatoreIn maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale

Indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato

E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnaledi fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold

Real time PCR

Sistemi di rilevamento1. Coloranti che si

intercalano nella doppia elica

SYBR Green 1

Tm

La molecola fluorescente si lega randomrandom a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primersÈ necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici

All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la

molecola fluorescente

Durante l’allungamento si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di

copie dell’amplicone

SYBR Green 1

metodica semplice, non costosa

MA aspecifica

Analisi della curva di melting

Tm

82.688.1

melting peak

2. Sonde specifiche marcate con molecole fluorescenti

Primer

Primer3’3’

3’3’

3’3’3’3’

5’5’

5’5’5’5’

5’5’R QQ

5’5’ 3’3’

Sonde TaqMan

RREPORTER: fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza

fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter

Q

3’ 3’ 5’5’

3’ 5’5’

Si libera 1 molecola di reporter per ogni copia di DNA duplicata

La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere

complementare alla sequenza bersaglio da amplificare: è è disegnata in modo da ibridarsi all’interno disegnata in modo da ibridarsi all’interno

del frammento amplificato nella reazione di PCRdel frammento amplificato nella reazione di PCR

Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

R Q3’

3’ 5’5’

3’ 5’5’

Forward primer

Probe

Reverse primer

Quantificazione

ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione

assoluta (utilizzo di una standard curve)Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di

campioni

RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT

Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard

curve)Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro CT con

quello del controllo endogeno

VOGLIO QUANTIFICARE IN TEMPO REALE LA PRESENZA DI UN MICRORGANISMO ALL’INTERNO

DI UNA MATRICE

1. Devo avere a disposizione una sonda specie-specifica in grado di amplificare una regione specifica del genoma del microrganismo in esame, di dimensioni comprese tra 100-700 bp verifica in PCR (specificità e curva di melting)

2. Devo preparare concentrazioni cellulari a titolo noto da cui estrarre e dosare il DNA totale 108 cellule 125 ng 106 cellule 10 ng 104 cellule 0.9 pg

3. Devo sottoporre ciascun campione ottenuto a q-PCR per ottenere delle curve di calibrazione, per trovare il range di linearità e la corrispondenza tra:

CT : quantità di DNA : quantità di cellule

A QUESTO PUNTO POSSO ANALIZZARE LA MATRICE IN ESAME

Estraggo il DNA totale dalla matrice ed eseguo una real-time PCR utilizzando tutti i dati ottenuti in fase di messa a punto del metodo:

primers specifici curva di calibrazione

Quantitativa relativaQuantitativa relativa

Plot di amplificazione

Numero di cicli

CT

SampleControl

Studio dell’espressione genicaStudio dell’espressione genica

1. Primers specifici per amplificare il gene di interesse

2. Estrazione dell’RNA e Real-time PCR per valutare se il gene viene trascritto

L’ RNA estratto deve venire retrotrascritto in DNA

L’ RNA estratto deve venire retrotrascritto in DNA

Quantitativa relativa: analisi dei dati

Normalizzare il gene target con un controllo endogeno (ref) espresso costitutivamente (CT) in una condizione di controllo

Variare le condizioni di crescita del ceppo in esame ed eseguire l’analisi. Il controllo endogeno non dovrebbe variare. La variazione di espressione del gene in studio va valutata in riferimento all’espressione dello stesso gene nelle condizioni di controllo

Comparare ciascun CT così ottenuto con il CT del controllo

ratio = ( Etarget)ΔCt target (control-treated)

(Eref)ΔCt ref (control-treated)

E = efficienza della reazione: in teoria ad ogni ciclo di amplificazione si ha raddoppio delle copie di DNA

Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target