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Spettroscopia UV-visibile (parte 2) Bande di assorbimento Assorbimento UV-vis da parte di proteine ed acidi nucleici
Spettroscopia UV-visibile (parte 2)
Bande di assorbimento
Assorbimento UV-vis da parte di proteine ed acidi nucleici
wavelength (nm)
Absorbance
450400350
1.0
0.5
0.0
Bande d’assorbimento
A(l)=elcb A(l)=elcb
legge di Lambert-Beer
Spettroscopia UV-visibile
Perché si misura l’assorbanza al picco di assorbimento?
Spettroscopia UV-visibile
Bande d’assorbimento
Perché si misura l’assorbanza al picco di assorbimento?
Spettroscopia UV-visibile
Bande d’assorbimento
perche’ si osserva una banda larga?
Spettroscopia UV-visibile
Bande d’assorbimento
perche’ si osserva una banda larga?
Spettroscopia UV-visibile
Bande d’assorbimento
perche’ si osserva una banda larga?
Bande d’assorbimento Spettroscopia UV-visibile
In molte molecole organiche l’assorbimento della luce cade nel campo dell’ultravioletto (UV 150-380 nm) e tali sostanze sono quindi incolori (nei liquidi e nelle soluzioni) o bianche (allo stato solido). Molte altre assorbono nel visibile (c.a. 400-800 nm) e danno luogo a colorazioni intense.
E’ il caso delle molecole
riportate in Figura come il
carotene (colore della carota
e delle foglie d’autunno), la
clorofilla (colore delle foglie
verdi), il licopene (colore
rosso dei pomodori) e di
moltissime altre molecole.
Spettroscopia UV-visibile Spettroscopia UV-visibile
Spettroscopia UV-visibile Spettroscopia UV-visibile
Spettroscopia UV-visibile
Spettro di assorbimento della clorofilla
Sono visibili due transizioni principali a 670 nm
(rosso) e 430 nm (blu).
Spettroscopia UV-visibile
Quando in una molecola sono presenti due o più cromofori in
coniugazione diretta tra loro si assiste ad un marcato effetto
batocromico quasi sempre accompagnato da un effetto da un effetto
ipercromico attribuibile alla maggiore facilità della transizione
elettronica.
Effetto della coniugazione Spettroscopia UV-visibile
Effetto della coniugazione Spettroscopia UV-visibile
Effetto della coniugazione Spettroscopia UV-visibile
Effetto della coniugazione
Ciò spiega l’esistenza di composti organici colorati, come il metilarancio, la
fenolftaleina, la clorofilla, la caffeina o il b-carotene che presentano un massimo di
assorbimento nel visibile. Tutti i composti citati presentano doppi legami coniugati ed
è proprio l’estesa coniugazione che è responsabile dell’assorbimento nel visibile.
Spettroscopia UV-visibile
Ciò spiega l’esistenza di composti organici colorati, come il metilarancio, la
fenolftaleina, la clorofilla, la caffeina o il b-carotene che presentano un massimo di
assorbimento nel visibile. Tutti i composti citati presentano doppi legami coniugati ed
è proprio l’estesa coniugazione che è responsabile dell’assorbimento nel visibile.
Spettroscopia UV-visibile
Variazioni spettrali
Emoglobina
L’emoglobina è una proteina:
1. globulare presente nei globuli rossi ed ha
la funzione di trasportare l’ossigeno nel
sangue.
2.tetramerica costituita da quattro catene
polipetidiche (subunità).
Nella molecola di emoglobina ciascuna
subunità lega un gruppo eme
Eme: gr. cromoforo
Spettroscopia UV-visibile
Gruppo Eme Spettroscopia UV-visibile
Gruppo Eme Spettroscopia UV-visibile
Gruppo Eme Spettroscopia UV-visibile
Gruppo Eme Spettroscopia UV-visibile
Perché????
Spettroscopia UV-visibile
Emoglobina
Gli orbitali esterni conivolti nei legami dei metalli di
transizione sono quelli d
Nel compesso ottaedrico del Fe (II) nella emoglobina
i 5 orbitali d si scompongono in due set:
•2 obitali dx2-y2 and dz2 puntano lungo gli assi verso i
leganti
•gli altri 3 dxy, dxz, dxz puntano tra gli assi x,y,z e non
sono influenzati dalla repulsione con i leganti
Spettroscopia UV-visibile
Emoglobina
Differenza di energia
che corrisponde ad un
assorbimento di luce
Spettroscopia UV-visibile
Emoglobina
Deossiemoglobina (alto spin)
Ossiemoglobina (basso spin)
Spettroscopia UV-visibile
Cromofori importanti in
molecole biologiche
Usi più frequenti della spettroscopia UV-vis
•Misura della concentrazione di acidi nucleici mediante A260
•Misura della concentrazione di proteine mediante A280
•Studio di variazioni strutturali
Spettroscopia UV-visibile
Cromofori nelle proteine
Il legame peptidico (214 nm, lontano UV)
Ponte disolfuro (250 nm)
Anello aromatico (280 nm, vicino UV)
Spettroscopia UV-visibile
Spettro Ultravioletto delle proteine
La banda della fenilalanina è la
meno intensa e si osserva a
minori lunghezze d’onda. Il suo
contributo è completamente
oscurato da quello di tirosina e
triptofano, quando sono presenti
questi residui.
Spettroscopia UV-visibile
Spettro Ultravioletto delle proteine
Spettro di assorbimento di quattro
proteine:
•La tripsina ha un alto contenuto
in tirosina,
•l’ albumina ha un alto contenuto
in fenilalanina,
•il chimotripsinogeno ha un alto
contenuto in triptofano
• la gelatina (collagene) ha un
basso contenuto in tutti e tre
questi aminoacidi.
Spettroscopia UV-visibile
Tipicamente per poter quantificare la concentrazione di una proteina
viene usata la regione del vicino UV piuttosto che il lontano UV in
quanto molti solventi assorbono o diffondono in questa ultima regione
spettrale, pertanto interferendo con l’assorbimento del cromoforo
amidico
Gli amino acidi aromatici hanno un coefficiente di estinzione molare ben
caratterizzato nell’intervallo 250-300 nm. Pertanto, se si conosce il
numero di tirosine o triptofano nella proteina, si può calcolare un
coefficiente di estinzione per la proteina ad una determinata lunghezza
d’onda ed usare questo per misurare la concentrazione della proteina in
soluzione
e280 nm (tirosina) = 1280 cm-1 M-1
e280 nm (triptofano)= 5690 cm-1 M-1
Spettro Ultravioletto delle proteine Spettroscopia UV-visibile
Il reale vantaggio di questo metodo per determinare la
concentrazione delle proteina è che
il campione non viene distrutto ed il metodo è molto rapido
Una accurata misura della concentrazione della proteina
prevede l’impiego di :
una curva di assorbimento standard prodotta con campioni di
proteina pura a concentrazione nota
un bianco che contenga la stessa concentrazione di tampone
e di sale del campione
una cuvetta di quarzo, in quanto contrariamente al vetro, non
assorbe luce UV
Spettro Ultravioletto delle proteine Spettroscopia UV-visibile
Nella figura è mostrato come lo
spettro del polipeptide poli-L-lisina
possa modificarsi per:
• l’effetto di un aumento di pH che
induce la formazione dell’ a-elica
da una struttura a matassa
•l’effetto di un aumento di
temperatura che converte il
polipeptide in b-foglietto.
L’assorbimento del gruppo peptidico a 190-200 nm è molto sensibile alla struttura secondaria di
polipeptidi e proteine.
Spettroscopia UV-visibile
Questo è un esempio di
ipocromismo, particolarmente
rilevante negli acidi nucleici,
assieme al suo opposto di
ipercromismo.
Il fenomeno può essere usato nello
studio dei processi di denaturazione
e rinaturazione, sfruttando i diversi
coefficienti di
assorbimento, per determinare
quantitativamente le frazioni di
forma nativa e denaturata.
L’assorbimento del gruppo peptidico a 190-200 nm è molto sensibile alla struttura secondaria di
polipeptidi e proteine.
Spettroscopia UV-visibile
Reazioni cromogene usate per le analisi
Numerose sostanze non hanno un coefficiente d'estinzione significativo
nel visibile, ma possono reagire quantitativamente con un'altra sostanza a
formare un prodotto colorato.
Questa proprietà viene sfruttata per la determinazione
quantitativa di tali sostanze.
Le reazioni cromogene si usano per convertire un composto chimico
privo di colore in uno che ha un colore per poterlo misurare mediante
spettrofotometria.
Spettroscopia UV-visibile
Reazioni cromogene usate per le analisi
Una reazione cromogena utile dovrebbe avere le seguenti
proprietà:
1. Il colore prodotto deve essere proporzionale alla concentrazione del composto da
misurare nel campione in un ambito ragionevolmente ampio.
2. Il colore prodotto deve essere elevato in modo che piccole quantità di composto
possano essere determinate (misurate). In altre parole ciò significa che
l'assorbimento molare del prodotto deve essere alto. Molti reagenti cromogeni utili
hanno assorbimenti molari fra 10000 e 20000 M-l cm-l.
Spettroscopia UV-visibile
Reazioni cromogene usate per le analisi
Una reazione cromogena utile dovrebbe avere le seguenti
proprietà:
3. Il prodotto colorato deve essere ragionevolmente stabile, così che non sia
necessario un momento preciso di misurazione. Ciò è importante quando si usano
strumenti semplici come i colorimetri. Ci sono però strumenti come gli
spettrofotometri stopped-flow che sono disegnati per eseguire misurazioni molto
rapidamente e possono quindi rivelare in modo attendibile composti che sono
instabili, ad esempio prodotti intermedi di una sequenza di reazioni. Questi
strumenti possono eseguire osservazioni in tempi dell'ordine di 1-2 ms dopo il
mescolamento.
Spettroscopia UV-visibile
Reazioni cromogene usate per le analisi
Una reazione cromogena utile dovrebbe avere le seguenti
proprietà:
4. Non devono essere presenti altre sostanze nel campione da analizzare che possano
interferire con la reazione. In molti casi è necessario eseguire uno o più passaggi di
separazione per rimuovere sostanze interferenti prima di poter e- seguire la
reazione cromogena.
5. È desiderabile che le condizioni richieste per la reazione cromogena non siano
troppo stringenti in modo che piccole variazioni di temperatura o di volume di
reagenti o di tempo di reazione non producano un cambiamento significativo di
assorbanza.
Spettroscopia UV-visibile
Reazioni cromogene usate per le analisi
Una reazione cromogena utile dovrebbe avere le seguenti
proprietà:
6. I reagenti necessari per la reazione devono essere stabili in modo che non sia
necessario preparare reagenti freschi per ogni analisi.
7. L'assorbanza del bianco deve essere bassa. Se il bianco ha un'alta assorbanza,
l'assorbanza ottenuta con una bassa concentrazione di composto da misurare sarà
soltanto poco più alta e l'inerente errore strumentale sarà significativo. Questo tipo
di errore è un problema in tutti i metodi quantitativi quando si sottrae un numero
relativamente grande da un numero appena più grande.
Spettroscopia UV-visibile
Reazioni cromogene usate per le analisi
Metodo di legame con coloranti (metodo di Bradford)
per la determinazione delle proteine
Il metodo di determinazione della concentrazione proteica è il metodo di Bradford.
Questo metodo è molto popolare perchè semplice, rapido, economico e sensibile. Il
reattivo di Bradford contiene il Coomassie Brillant Blue R-250 come cromogeno.
Questo colorante forma forti complessi
non covalenti con le proteine tramite
interazioni elettrostatiche con gruppi
aminici e carbossilici e tramite forze di van
der Waals.
Spettroscopia UV-visibile
Reazioni cromogene usate per le analisi
Metodo di legame con coloranti (metodo di Bradford) per la determinazione delle proteine
Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G- 250 alle proteine provoca uno spostamento del
massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide
Reagente + proteina
Solo reagente
Spettroscopia UV-visibile
Spettroscopia UV-visibile
Spettroscopia UV-visibile
Spettroscopia UV-visibile
Spettroscopia UV-visibile
Spettroscopia UV-visibile
Le basi presentano sistemi
delocalizzati in anelli eterociclici,
e le transizioni sono di tipo p-p *.
Spettro Ultravioletto di Acidi Nucleici
Il forte assorbimento nel vicino
UV degli acidi nucleici è
determinato quasi
esclusivamente dalle basi
pirimidiniche e puriniche.
Infatti gli zuccheri e i gruppi
fosfato hanno assorbimenti a
< 150 nm.
Spettroscopia UV-visibile
Tutti gli spettri delle basi mostrano
un forte assorbimento intorno a 260 nm.
Spettro Ultravioletto di Acidi Nucleici Spettroscopia UV-visibile
Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham
Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company
Spettro Ultravioletto di Acidi Nucleici Spettroscopia UV-visibile
A(260)
DNA doppio filamento 1.00
DNA singolo filamento 1.37
Basi libere 1.67
Ipocromicità/Ipercromicità
Spettroscopia UV-visibile
In generale, gli acidi nucleici
hanno un assorbimento
inferiore alla somma delle
assorbanze dei nucleotidi
individuali
Questo fenomeno è chiamato
ipocromicità.
Un aumento in assorbimento è detto
ipercromicità
Ipocromicità/Ipercromicità
Spettroscopia UV-visibile
Questo effetto è molto utile per
vedere se gli acidi nucleici sono
strutturati
A(260)
DNA doppio filamento 1.00
DNA singolo filamento 1.37
Basi libere 1.67
100*)DNA(A
)DNA(A)DNA(Aitàipercromic(%)
nativoss
nativossfusoss
Ipocromicità/Ipercromicità
Spettroscopia UV-visibile
L’effetto ipercromico può essere spiegato in base alla
configurazione elicoidale dei polimeri del nucleotide.
In una struttura così regolarmente impacchettata i cromofori non possono essere
considerati residui “isolati”, indipendenti gli uni dagli altri.
Lo spostamento elettronico che ha luogo quando una base assorbe un quanto di
energia è sentito anche dalle basi vicine in conseguenza alla modificazione del
campo elettrico. Se l'interazione è forte, diventa impossibile parlare di un
assorbimento "localizzato" in un residuo particolare.
L’effetto ipercromico è causato anche dalla
presenza di interazioni intermolecolari.
Ipocromicità/Ipercromicità
Spettroscopia UV-visibile
Una regola generale prevede che
MODIFICAZIONI CONFIGURAZIONALI CHE
NON CAMBIANO
LA STRUTTURA ELETTRONICA
NON MODIFICANO
L’ASSORBIMENTO TOTALE
Ipocromicità/Ipercromicità
Spettroscopia UV-visibile
Denaturazione del DNA
Sotto l’azione di vari agenti esterni come valori estremi di pH, aumento
della temperatura, aggiunta al mezzo acquoso di particolari reagenti, il DNA
in soluzione può andare incontro a significative modificazioni strutturali che
ne cambiano l’aspetto, la funzionalità e le caratteristiche, passando dalla
doppia elica regolare a uno stato disordinato in cui i filamenti
complementari si separano e la struttura secondaria viene persa.
Questo fenomeno viene comunemente chiamato denaturazione.
Durante un processo di denaturazione non si rompe alcun legame
covalente, ma si assiste alla sola separazione dei due filamenti della
doppia elica: in altre parole, i ponti idrogeno tra le coppie di basi
complementari vengono spezzati e diminuiscono le interazioni tra basi
adiacenti.
Spettroscopia UV-visibile
Denaturazione del DNA
Spettroscopia UV-visibile
Denaturazione termica del DNA
La denaturazione termica degli acidi nucleici avviene in un intervallo di
temperatura piuttosto ristretto e provoca cambiamenti significativi delle
proprietà fisiche della macromolecola.
Questa particolare transizione ordine-disordine può essere facilmente
osservata seguendo l’aumento dell’assorbimento ottico a 260 nm in
funzione dell’aumento della temperatura .
La curva sperimentale dell’assorbanza in funzione della temperatura
può essere analizzata per ottenere informazioni termodinamiche relative al
processo in esame.
Spettroscopia UV-visibile
Denaturazione termica del DNA
La temperatura corrispondente a metà
dell’aumento osservato nell’A260 è definita
come “temperatura di melting”, Tm o
temperatura di fusione del DNA.
0.50
Spettroscopia UV-visibile
Denaturazione termica del DNA
Molti sono i fattori che influenzano il punto di melting del DNA:
Lunghezza della molecola: DNA più lunghi Tm più elevate;
Contenuto delle basi: maggiore % GC Tm pi`u elevate;
Sequenza delle basi: non solo il contenuto, ma anche l’ordine con cui le basi si presentano nella sequenza polinucleotidica condiziona la stabilità del DNA;
Forza ionica: a più elevata forza ionica, è presente un maggior numero di ioni positivi che schermano la carica negativa lungo lo scheletro del DNA. In questo modo, le forze repulsive tra catene diminuiscono e, di contro, aumenta la Tm;
Spettroscopia UV-visibile
Denaturazione termica del DNA
Concentrazione del DNA: per molecole di DNA molto lunghe l’effetto
della concentrazione sulla Tm è quasi trascurabile, mentre per molecole più
corte (oligonucleotidi) l’equilibrio è fortemente condizionato;
Valori di pH: valori estremi di pH possono ionizzare le basi azotate e
rompere ilegami idrogeno. Al di fuori del range 5 < pH < 9 la Tm decresce
bruscamente;
Solvente: solventi organici tendono ad abbassare la Tm
Spettroscopia UV-visibile
Denaturazione del DNA
Spettroscopia UV-visibile
Denaturazione delle proteine
Si può studiare la denaturazione di una proteina
attraverso il suo spettro UV?
Modificazioni nella struttura secondaria di una proteina sono comunemente
osservate attraverso il suo spettro UV , in quanto l’assorbimento degli
aminoacidi aromatici e dei legami peptidici è significativamente influenzato
dall’ambiente locale.
Pertanto, lo spettro UV di una proteina denaturata differisce da quello della
stessa proteina nella forma nativa. Tuttavia, le modificazioni spettrali sono
generalmente di piccola entità tanto che questo metodo non è quasi mai usato
per questo tipo di studio. Al contrario, la denaturazione di una proteina può
essere più sensibilmente monitorata attraverso il dicroismo circolare (tale
argomento verrà trattato più approfonditamente nelle lezioni successive)
Spettroscopia UV-visibile
