Roma, 27 settembre 2018
Club del Globulo Rosso
Rosario NotaroCancer Genetics and Gene Transfer
Core Research Laboratory - ISPRO
Florence
PNH – EPNEmoglobinuria Parossistica Notturna
Emolisi cronica intravascolare: con crisi
Trombosi:venose, addominali, spesso multiple
Emoglobinuria Parossistica Notturna
L’EPN è una rara malattia clonale acquisita del sangue
caratterizzata dalla triade clinica:
Citopenie (Insufficienza midollare):comune, a volte grave
WBC /µl Plts /µl
Test di Ham nell’EPN
Globuli Rossi
di un Paziente EPNControllo
Siero Siero In. Siero
+ acido + acido + acido
Proteine assenti sulle cellule ematiche EPN
CD59, CD90, CD109
CD55
CD58*
CD59
CD48
CDw52
PrPc
CD16*
CD24 CD55
CD58* CD59
CD48 PrPC
CD73 CDw108
CD55
CD58*
CD59
CD109
PrPC
GP500
Gova/b
CD55
CD58*
CD59
PrPC
AChE
JMH Ag
Dombroch
HG Ag
CD55 CD58*
CD59 CD14
CD16 CD24
CD48 CD66b
CD66c CD87
CD109 CD157
LAPNB1 PrPC
p50-80 GPI-80
ADP-RT
NA1/N
A2
CD14 CD55
CD58* CD59
CD48 CDw52
CD87 CD109
CD157 Group 8
PrPC GPI-80
CD16*
CD55 CD58*
CD59 CD48
CDw52 CD87
CDw108 PrPc
ADP-RT CD73
CD90 CD109
CD16*
Hematopoietic
Stem Cell
Platelets
RBC
PMN
B cells
Monocytes
T cells
NK cells
Tutte queste Proteine
sono legate con l’ancora GPI
51%91%
93%
Neutrofili Monociti Globuli rossi
Diagnosi di EPNCitofluorimetria per marcatori GPI-linked sulle cellule del sangue
CD66b FITC CD14 FITC
Pazie
nte
EP
NN
orm
ale
CD59 FITC
Patogenesi Molecolare dell’EPN- mutazioni somatiche nel gene X-legato PIGA -
Staminale normaleStaminale EPN
ER
nucleo
X chr.
PIGA
protein
Inositol-P
PIG-A
Ancora GPI
+
GPI
PIG-A
Cellula normale
Etn-P
glycan
GlcN
Cellula mutata in PIGA
• Emolisi Intravascolare
• Trombosi
• Insufficienza midollare
Emoglobinuria Parossistica Notturna
Patogenesi
• Emolisi Intravascolare
• Trombosi
• Insufficienza midollare
Emoglobinuria Parossistica Notturna
Patogenesi
C5
C3
CD55
CD59
Factor H
CD46
CR1
Factor I
C5
C3
C4bp
Inibitori del Complemento
Membrana Solubili
Il Sistema Complementare MicroorganismsAntigen-Antibody
Constitutive/
Microorganisms
Via
Classica
Via
Lecitin
e
Via
Alternativa
Modificato da Brown et al, Nat Clin Pract Nephrol 2007
Clusterin
Protein S
C1 Inh
Factor I
CD55
CD59
in EPN
Complesso di
Attacco alla Membrana
Loop di
amplificazion
e
C5b-C9
CD55
C5C3 C5C3
Eritrocita normaleClassical
pathway
Lectin
pathway
Alternative
pathway
Il Controllo del Complemento nei soggetti sani
C5C3 C5C3
Classical
pathway
Lectin
pathway
Alternative
pathway
C5b-C9
Il Controllo del Complemento nei Pazienti EPN
Eritrocita EPN
Conseguenze dell’emolisi intravascolare
Emosiderinuria
Perdita di Ferro
ANEMIA(bassa Hgb)
Deplezione
Ossido nitrico
distonia
muscolatura liscia
• Dolori addominali
• Astenia
• Disfagia
• Disfunzione erettile
• (Insufficienza renale)
• (Ipertensione polmonare)
Emolisi Intravascolare
Emoglobinemia
Emoglobinuria
Elevato LDH
Elevati
Reticolociti
• Emolisi Intravascolare
• Trombosi
• Insufficienza midollare
Emoglobinuria Parossistica Notturna
Patogenesi
Hall et al, Blood, 2003
La Trombosi è Frequente nell’EPN
Distretto cerebrale, addominale e polmonare
in > 50% dei pazienti
ricorrente, grave, spesso mortale
Coagulazione Complemento
Modified from Markiewski et al, Trends Immunol 2007
Coagulazione, Complemento ed EPN
Associazione a Delinquere?
• Emolisi Intravascolare
• Trombosi
• Insufficienza midollare
Emoglobinuria Parossistica Notturna
Patogenesi
Rotoli & Luzzatto, 1989
Tempo
Cellule
PIGA-
Cellule PIGA+
danneggiate
Agente NocivoCellule
PIGA+
Espansione Paradossa del Clone EPN(Teoria della Fuga)
Staminale normale (GPI+) Staminale EPN (GPI-)
Modello per la Patogenesi dell’EPN e dell’AA:L’ancora GPI è il bersaglio dei linfociti autoreattivi T
anti-GPI TCR
CD1d
Karadimitris et al, Blood 2000; Gargiulo et al, Blood 2007; Gargiulo et al, Blood 2013; Gargiulo et al, Blood 2017;
Espansione Paradossa del Clone EPNIl caso di Alessia, dalla Teoria alla Pratica…
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
0 2 4 6 8 10 12
Plts *104/µl
LDH *UNL
Hb (g/dl)
Retics *105/µl N *103/µl
N GPI-neg
2 years months
95%
Eculizumab
pRBC units
59%
76%
Emoglobinuria Notturna ParossisticaOpzioni Terapeutiche nel XX secolo
Trattamenti di Supporto• Acido Folico
• Ferro
• Transfusioni di eritrociti
• Profilassi anti-coagulante• (Trombolisi)
Trattamenti Patogenetici• Trapianto Allogenico di CSE
• Immuno-soppressione (ALG/CSA)• (androgeno)•
Sopravvivenza dei Pazienti EPN
100
80
60
40
20
0
0 10 20
Anni dalla diagnosi
So
pra
vviv
en
za
(%) Popolazione di controllo
EPN (n 80; Hillmen 1995: 1950-1980)
30 40
EPN (n 424; De Latour 2008: 1970-2000)
Mortalità a causa di:
Trombosi
Insufficienza Midollare(SMD/leucemia?)
Emoglobinuria Notturna ParossisticaOpzioni Terapeutiche nel XXI secolo
Trattamenti di Supporto• Acido Folico
• Ferro
• Transfusioni di eritrociti
• Profilassi anti-coagulante• (Trombolisi)
Trattamenti Patogenetici• Trapianto Allogenico di CSE
• Immuno-soppressione (ALG/CSA)• (androgeno)•• Inibizione del complemento
CH
3C
H2
Rother et al, Nature Biotech 2007
Eculizumab
Anticorpo monoclonale umanizzato anti-C5
Variable
heavy chain
Variable light
chain
Human constant
light chain Ck
Human constant
heavy chain
IgG4 CH2 and CH3
Human constant
heavy chain
IgG2 CH1 and hinge
Human framework
regions
Murine
complementarity
determining regions
nel Paziente EPN Trattato con Eculizumab
C5C3
CD
55
CD
59
CD
46
CR
1C5C3
Regolazione della Cascata del Complemento
CD
55
CD
59
Classical
pathway
Lectin
pathway
Alternative
pathway
C5b-C9
EculizumabFa
cto
r H
Fa
cto
r I
C4b
p
Inibitori del Complemento
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
pre-ecu
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hb (g/dl)
LDH (*UNL)
13Trasfusioni RBC
2 U/mese
anni dall’inizio dell’eculizumab
Eculizumab (900 mg/14 days)
Paziente EPN pesantemente trasfuso e con trombosi ricorrenti
Non più trasfusioni, non più trombosi
(nonostante lo stop della terapia anticoaugulante)
-2 -1
Hb (g/dl)
LDH (*UNL)
inizia l’eculizumab e la storia cambia ……………
Trombosi
ricorrenti
(Budd Chiari)
Trasfusioni
blocca l’emolisi intravascolare e i sintomi correlati
abroga o riduce il fabbisogno trasfusionale
riduce il rischio trombotico
Anemia
Emoglobinemia
• Spossatezza
• Disfagia
• Disfunzione Erettile
•Dolore Addominale
è sicuro, nonostante il rischio di infezioni da batteri capsulati
Però, non guarisce, e non è disponibile in tutto il mondo
Trombosi
Il trattamento con eculizumab in EPN
è sicuro anche in gravidanza
≤50%10,1%
>50%5,6%
Gestione Clinica del Paziente con EPN
Risposta ematologica all’eculizumab
• Normalizzazione del LDH in quasi tutti i pazienti
• 20-30% dei pazienti cintinua a trasfondere
• 50% dei pazienti non raggiunge 11 g/dl di emoglobina
• La reticolocitosi persiste in quasi tutti i pazienti
n= 51
Risitano, Notaro et al, Blood 2009
Hgb ≥1135.3%
8 ≤ Hgb < 1149.0%
Ridotta produzione di globuli rossi
1) Insufficienza midollare
2) Carenza di ferro o di vitamine
3) Inadeguata produzione di eritropoietina
Persistente emolisi intravascolare
1) Mancata inibizione del complemento (varianti genetiche del C5)
2) Aberrante “distruzione” del farmaco (‘breakthrough’)
3) Aumentata attivazione acuta e/o cronica del complemento
Emolisi extravascolare de novo
1) Opsonizzazione dei globuli rossi EPN a causa della “deposizione” di C3
Gestione Clinica del Paziente con EPN
cause di ridotta risposta ematologica all’eculizumab
Ridotta produzione di globuli rossi
1) Insufficienza midollare
2) Carenza di ferro o di vitamine
3) Inadeguata produzione di eritropoietina
Persistente emolisi intravascolare
1) Mancata inibizione del complemento (varianti genetiche del C5)
2) Aberrante “distruzione” del farmaco (‘breakthrough’)
3) Aumentata attivazione acuta e/o cronica del complemento
Emolisi extravascolare de novo
1) Opsonizzazione dei globuli rossi EPN a causa della “deposizione” di C3
Gestione Clinica del Paziente con EPN
cause di ridotta risposta ematologica all’eculizumab
0
400
800
1200
1600
LD
H U
/L
Eculizumab Eculizumab
14 giorni
Eculizumab Eculizumab
11 giorni 11 giorni14 giorni
‘Fuga’ dal Blocco del ComplementoIl caso del Signor Mario: Riduzione dell’intervallo
Ridotta produzione di globuli rossi
1) Insufficienza midollare
2) Carenza di ferro o di vitamine
3) Inadeguata produzione di eritropoietina
Persistente emolisi intravascolare
1) Mancata inibizione del complemento (varianti genetiche del C5)
2) Aberrante “distruzione” del farmaco (‘breakthrough’)
3) Aumentata attivazione acuta e/o cronica del complemento
Emolisi extravascolare de novo
1) Opsonizzazione dei globuli rossi EPN a causa della deposizione del C3
Gestione Clinica del Paziente con EPN
cause di ridotta risposta ematologica all’eculizumab
Il blocco del C5 si associa al legame di C3 agli eritrociti EPN
CD
59-P
E
CD
59-P
E
C3-FITC
CD
59-P
E
CD
59
-PE
Paziente EPN non trattato
Paziente EPN durante il trattamento con eculizumab
Hgb≥12 8.5≤ Hgb <10 Transfused
C3-FITCC3-FITC
2% of
PNH RBC
45% of
PNH RBC 67% of
PNH RBC
C3-FITC
Risitano, Notaro et al, Blood 2009
C5C3 C5C3
C3
C3-FITC
CD
59-P
E
Paziente EPN trattato con eculizumab
45% of
PNH RBC
Alternative
pathway
Eculizumab
C5C3C3
C3
Risitano, Notaro et al, Blood 2009
Il Trattamento con l’Eculizumab è associato
alla Deposizione di C3 sui Globuli Rossi EPN
CD
59-P
E
Paziente EPN non trattato
C3-FITC
Alternative
pathway
Alta/Alta≈1000 molecole per cellula
Alta/Bassa100< molecuole per cellula <600
Bassa/Bassa≈100 molecole per cellula
L’espressione del Recettore 1 del Complemento (CR1)
è associato ad una variante genetica
detta polimorfismo HindIII
Pazienti EPN in terapia con Eculizumab
che non necessitano più di trasfusioni
- genotipo CR1 -
P= 0.016
A/A A/B B/B
Rondelli et al, Haematologica 2013
“Bisogni insoddisfatti” nel trattamento attuale dell’EPN
Persistente emolisi intra-vascolare
Crisi emolitiche intercorrenti (“breakthrough” farmacocinetico)
Saltuarie crisi emolitiche da infezioni/infiammazioni
Clinici
Sociali/individuali
Emolisi extra-vascolare
Pazienti ancora dipendenti dalle trasfusioni
Pazienti con livelli di emoglobina non ottimali (<10 g/dl)
Persistente reticolocitosi
“Dipendenza” dall’infusione ogni due settimane
Costo del farmaco: >300.000 € per anno
C5
C3
CD55
CD59
Factor H
CD46
CR1
Factor I
C5
C3
C4bp
Complement Inhibitors
Membrane Soluble
MicroorganismsAntigen-AntibodyConstitutive/
Microorganisms
Classicalpathway
Lectinpathway
Alternativepathway
Clusterin
Protein S
C1 Inh
Factor I
CD55
CD59Membrane
Attack Complex
Amplification
Loop
Eculizumab
Coversina
MoAb AntiC5 long lasting
MoAb AntiC5 sotto cute
Peptidi ciclici
siRNA
Compstatine
TT30simil CR1
MoAb AntiC3
simil Fattore H
Inibitori CFD
Inibitori CFBsiRNA anti CFB
MoAb AntiCFD
MoAb AntiCFB
Aptameri
Nuovi inibitori del Complemento
Complementopatie
Condizioni patologiche in cui l’attivazione del Complemento è il principale fattore patogenetico
IL processo patologico può essere bloccato o rallentato dall’inibizione del complemento
L’inibizione (o la regolazione) del complemento deve avvenire al livello appropriato per il meccanismo patogenetico proprio di ogni condizione
Eculizumab nel falcemico conreazione emolitica ritardata post-trasfusionale
Boonyasampant et al, Transfusion, 2015
CRL, FlorenceGenetics and Gene Transfer
Rosario Notaro
Michela Sica, Irene Cosi, Caterina Nannelli,
Maria De Angioletti
Federico II University - NaplesAntonio Risitano, Giuseppina Ruggiero,
Fiorella Alfinito, Patrizia Ricci
Imperial College - LondonAnastassios Karadimitris
New York University - New YorkDavid Araten
Kanazawa University - KanazawaShinji Nakao
Sapienza University - RomeAnna Paola Iori
Ospedale Policlinico – MilanoAlberto Zanella, Wilma Barcellini
AOU Careggi - FlorenceRoberto Caporale, Renato Alterini, Valentina Carrai,
Barbara Scappini, Federica Barone
University of FlorenceAlberto Bosi, Cristina Nativi
Nursing Staff Careggi Hematology
Lucio LuzzattoMuhimbili University
Dar es Salaam (Tanzania)
IST, GenoaHuman Genetics
Sonia Lastraioli, Martina Serra,
Fabrizio Loiacono, Patrizia Piccioli
Former lab members
Luciana Gargiulo, Tommaso Rondelli, Margherita Berardi, Giulia Talini, Annamaria
Pellecchia, Emanuele Di Lorenzo, Manuela Gencarelli, Irene Sineo
Benedetta Peruzzi, Chiara Pescucci,
William Shakespeare, King Henry V, IV, i
There is a soul of goodness in things evil,
would men observingly distil it out.
William Shakespeare, Hamlet, I, 5
There are more things in heaven and earth, Horatio,
than are dreamt of in your philosophy.
Hematopoietic stem cellsGPI-targeted
noxious agent
Healthy
Hematopoietic System
Damaged
Hematopoietic stem cellsPNH clone(s)
(GPI-
deficient)
No clinical
consequences
PIG-A
mutation
Selective
expansion
of PNH clone(s)
PNHIntravascular
haemolysis Thrombosis
CD59(-)
red cells
Abnormal
platelets
Pancytopenia
Aplastic
Anaemia
A Unified Pathogenetic Model for PNH and AA