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Valutazione della immunogenicità in studi clinici: strategie sperimentali e statistiche
Nuove frontiere nella bioanalitica e laboratorio clinico 3 Febbraio 2015
Claudia Getuli
INTRODUZIONE
• Il numero di farmaci biologici/proteine ricombinanti ad uso terapeutico è in costante aumento.
• Questi prodotti possono indurre una risposta immunitaria non voluta (ADA Anti Drug Antibodies).
• La presenza di ADA può avere effetti rilevanti nello sviluppo di un prodotto biotecnologico per problematiche di sicurezza ed efficacia.
IMMUNOGENICITA’ EFFETTI
L’immunogenicità può influenzare negativamente: • Farmacocinetica • Farmacodinamica • Biodisponibilità • Efficacia ADA possono causare la formazione di immuno-complessi che a loro volta possono causare:
• Reazioni allergiche • Gravi reazioni autoimmunitarie
ADA: POSSIBILI RISPOSTE
Basso
Alto
•Legame, “Binding”
•Alterazione della PK
•Neutralizzazione, “NAb”
•Ipersensibilità
•Cross-reazione
Ris
chio
clin
ico
Bassa
Alta
Freq
uen
za
La severità della risposta clinica è correlata alla frequenza in modo inversamente proporzionale
J A Pedras-Vasconcelos – FDA (2014)
Immunogenicita’ clinica: PRCA con Eprex
• 1998-2001: aumento delle segnalazioni di PRCA (Pure Red Cell Aplasia) • Pazienti trattati con Eprex presentavano autoanticorpi N. Casadevall et al. - Nephr. Dialys. Transplant. (2002)
Valutazione Immunogenicità
EMA (2006), Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-Derived Therapeutic Proteins FDA Final Guidance (2014), Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products FDA Draft Guidance (2009), Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins
Importanza di prevedere il potenziale immunogenico di una sostanza
E’ molto importante preparare una valutazione del rischio prima dell’inizio della fase clinica – “Risk Assessment”: •deve essere deciso caso per caso
•l’estensione della caratterizzazione degli ADA dipende dal rischio potenziale
Fattori che influenzano l’incidenza di ADA
Le variabili che possono incidere sull’insorgenza di ADA sono molteplici: •Caratteristiche della sostanza (e.g. dimensione, struttura, sequenza, modifiche come glicosilazione, ossidazione) •Natura del formulato (e.g. presenza di impurezze/ contaminanti, aggregati) •Popolazione Target (e.g. background genetico, cure concomitanti, immunodeficienza) •Regime di trattamento (e.g. via di somministrazione, frequenza , dose)
Fattori che influenzano la valutazione del rischio di ADA
Le variabili che possono aumentare il rischio di conseguenze: •Analogie con proteine endogene
•Esiste una proteina endogena identica o simile? •La proteina endogena ha attività unica o una funzione ridondante?
•Caratteristiche del paziente e della patologia •Pazienti immuno-compromessi? •Il paziente ha la proteina endogena?
•Trattamento •Prodotto per terapia sostitutiva? •Il prodotto è la sola terapia disponibile?
STRATEGIA GENERALE
Test di “Screening”
_ +
Report Test di
conferma
Caratterizzazione della risposta
(Titolo, NAb, isotipo, etc.)
_
+
Studi clinici
Campioni di
siero
METODO Determinazione degli ADA
I metodi normalmente utilizzati sono:
• Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
• Radioimmunoassay (RIA)
• Radioimmunoprecipitation assay (RIPA)
• Surface Plasmon Resonance (SPR)
• Electrochemiluminescence (ECL)
Selezione del formato
ELISA DIRETTO ELISA “BRIDGING”
FARMACO
AGGIUNTA ANTICORPI
FARMACO coniugato
Secondario anti-IgG coniugato
AGGIUNTA SUBSTRATO
Selezione del formato
VANTAGGI SVANTAGGI
ELISA DIRETTO
• Maggiore capacità di
legare anticorpi a bassa
affinità
• L’isotipo rivelato dipende dal
secondario coniugato
• Specie – specifico
• Reagenti per la rivelazione
possono essere diversi tra
controlli e campioni
ELISA
“BRIDGING”
• Determinazione di tutte le
classi di Ig comprese IgM
• Non specie-specifico
• Capacità ridotta di determinare
Ab a bassa affinità
• La coniugazione della sostanza
può mascherare gli epitopi o
modificare la struttura
• Maggiori problemi di interferenza
da prodotto circolante
Saggi quasi-quantitativi
I saggi immunologici per la determinazione degli ADA sono generalmente definiti come quantitativi relativi o quasi-quantitativi. Motivo: il Controllo Positivo (Reference Standard) normalmente non riflette le affinità/proporzioni degli Anticorpi presenti nei campioni dei pazienti. Finalità: determinare un cut point per definire un campione come negativo o reattivo (potenzialmente positivo).
Pre-study assay validation
- Pre-study validation consisting in determination of:
* Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls * Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)
6 e
xpe
rim
ents
at
leas
t 4
exp
eri
men
ts
Primo step – Immunogenicity Screening Assay Cut-point
Fattore cruciale: determinazione dello Screening cut point che permette la definizione dei campioni come negativi o reattivi (potenzialmente Positivi) I campioni reattivi dovranno essere ulteriormente analizzati con un Saggio di Conferma
La sensibilità del metodo è più importante della specificità Attesi 5% di falsi positivi
Immunogenicity Screening Assay Cut-point
ISAC –Immunogenicity Screening Assay Cut Point
ISAC, programma generato con il software “R” v.3.0.2 del 25 Settembre 2013 Il tool è stato confrontato importando le formule in SAS versione 9.3
Immunogenicity Screening Assay Cut-point
Un disegno sperimentale bilanciato è raccomandato per la determinazione dello screening cut point e della precisione del test.
Lo schema consigliato è: 2 analisti x 3 esperimenti x 3 piastre Normalmente utilizzati 60 campioni che vengono
suddivisi in tre sottogruppi da 20 Ogni sottogruppo viene analizzato da entrambi gli
analisti una volta per esperimento e una volta per piastra.
Immunogenicity Screening Assay Cut-point Analysis of Variance (ANOVA)
Analyst A
La media delle letture risulta diversa in modo statisticamente significativo
Immunogenicity Screening Assay Cut-point Analysis of Variance (ANOVA)
Analyst B
La media delle letture risulta diversa in modo statisticamente significativo
Immunogenicity Screening Assay Cut-point Levene test per omogeneità della Varianza
Analyst A
Analyst B
Test a p-value
Levene classical 0.05 4.3E-06
Brown-Forsythe Levene 0.05 2.7E-05
Test a p-value
Levene classical 0.05 0.0396
Brown-Forsythe Levene 0.05 0.0382
… anche le varianze risultano diverse in modo statisticamente significativo
Immunogenicity Screening Assay Cut-point Fixed Cut Point
Il Fixed Cut Point può essere applicato soltanto se: • Medie e Varianze non sono diverse in modo statisticamente significativo. Se entrambe le condizioni non sono soddisfatte sarà applicato un Floating Cut Point.
Immunogenicity Screening Assay Cut-point
Primo passaggio è comunque il calcolo del FIXED CUT POINT:
Mean OD values + 1.645 * SD
NORMALIZATION FACTOR
NF = Cut Point - Negative Control (NQC)
FLOATING CUT POINT è calcolato indipendentemente per ogni piastra:
NQC (plate specific) + NF (analyst specific)
Pre-study assay validation
- Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point
* Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls * Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)
Cut point
Level of Assay Sensitivity
Ass
ay s
ign
al
Ab Concentration (ng/mL)
Assay Sensitivity
Si utilizzano anche in questo caso i dati dei primi sei esperimenti.
Assay Sensitivity
Calcolo effettuato sulla base dei dati di 6 esperimenti
Il livello di sensibilità del sistema raccomandato per trial clinici è 250-500 ng/mL (FDA Guidance for Industry - Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins”- Draft, December 2009).
Pre-study assay validation - Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity
* System suitability controls: QCH, QCL and negative controls * Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)
System Suitability Controls
QCH: concentrazione che produce un segnale subito prima del plateau della curva QCL: concentrazione che produce un segnale riproducibilmente superiore al Cut Point Mean of OD values + t0.01,df * SD
NQC: matrice pool di sieri di controllo negativo per monitorare il background non specifico
0.5 5 50
Ris
po
sta
Conc
QCH
System Suitability Controls
I controlli qualità sono utilizzati per: Valutazione della Precisione; su sei esperimenti condotti con un disegno bilanciato (2 operatori * 3 esperimenti* 3 piastre) Determinazione dei Criteri di Accettabilità su tutti gli esperimenti disponibili poiché determinati statisticamente. Tali criteri garantiscono che il saggio rimanga valido anche nella fase “in study” ovvero durante lo studio clinico.
Pre-study assay validation
- Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls
* Precision * Definition of test acceptance criteria
* Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)
Selectivity Matrix interference QCL level
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
QCH level
Subject No.
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Subject No.
OD
val
ue
OD
val
ue
* 10 campioni di siero di diversi individui * Aggiunta di controllo positivo: QCH e QCL.
Si calcola la concentrazione rispetto alla curva di riferimento (siero pool)
Selectivity Drug interference
* 10 campioni di siero di diversi individui * Aggiunta di: livello basso di controllo positivo. + concentrazioni crescenti di sostanza (drug).
Competizione
Inibizione del segnale
Drug
ADA
Biotin- Drug Falsi negativi
Selectivity Drug interference
Cut point
Drug Concentration (ng/mL)
Ass
ay s
ign
al
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 50 100 150 200 250
Level of Drug Tolerance
Dalla curva che interpola i dati si calcola la DRUG TOLERANCE
Selectivity
Drug interference
Calcolo effettuato sulla base dei dati di 10 curve (= 10 diversi individui)
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 50 100 150 200 250
Pre-study assay validation
- Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls
* Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference
* Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)
Robustness La “Robustness” è una indicazione dell’affidabilità di un saggio ed è determinata dalla capacità dello stesso di funzionare adeguatamente in seguito a variazioni come: cambio della strumentazione, della temperatura di incubazione, del numero delle piastre etc...
Pre-study assay validation
- Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls
* Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness
* Stability * Ruggedness (if applicable)
Stability
La stabilità a lungo termine a temperature ≤ -20°C per 2 o più anni non è normalmente richiesta ed è supportata da dati di letteratura. L’analita negli studi di validazione immunogenicità è un ADA: Anti-drug X Oppure Anti-drug Y … comunque un anticorpo policlonale ed è ragionevole pensare che la sua stabilità sia la stessa se specifico per Drug X o Drug Y. L’approccio più corretto è quello di valutare la stabilità su campioni di studio risultati positivi andando a confrontare il titolo del conservato rispetto al fresco.
Ruggdness
Riproducibilità del saggio in laboratori diversi. Valutazione non necessaria quando è un solo laboratorio ad effettuare le analisi.
STRATEGIA GENERALE
Test di “Screening”
_ +
Report Test di
conferma
Caratterizzazione della risposta
(Titolo, NAb, isotipo, etc.
_
+
Studi clinici
Campioni di
siero
Confirmatory Assay
I campioni risultati positivi al Saggio di Screening devono poi essere analizzati con un Saggio di Conferma (Confirmatory Assay). Lo scopo è verificare se la reattività è dovuta ad ADA (anticorpi specifici per la sostanza). Anche in questo caso si stabilisce un Cut Point (valore percentuale).
Confirmatory Assay
Screening Assay Confirmatory Assay: Competition with unlabeled Drug
Avidin
Biotin
Plate
Drug
Drug
ADA
Avidin
Biotin
ADA
Confirmatory Assay
Lo schema sperimentale comprende: * 10- 20 campioni di siero di diversi individui * QCH e QCL * NQC Tutti i campioni sono testati in due forme con aggiunta di buffer o aggiunta di sostanza (drug)
Per ogni campione si calcola: % Signal inhibition = 100 * [1 – (Study drug inhibited sample / Uninhibited sample)] Specificity Cut Point = Mean % Signal inhibition + 3.09* Standard Deviation
Quantitation of Positive Samples - Titer Se un campione è confermato positivo si procede con la determinazione del titolo. Vengono preparate diluizioni seriali del campione.
Diluizione 1:2 1:4 1:8
Titolo 2 4 8
Il titolo del campione è il fattore di diluizione al quale la risposta interseca lo screening cut point. TITOLO = Fattore di diluizione Esempio:
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 50 100 150 200 250
Cut point
Diluizione
Anticorpi neutralizzanti (NAbs)
Gli Anticorpi Neutralizzanti sono generalmente determinati con due tipi di saggi: •Saggi biologici che utilizzano linee cellulari (saggi funzionali) •Saggi immunologici competitivi
La scelta del formato per determinare i Nabs dipende da: •Natura del prodotto •Rischio potenziale I saggi biologici sono preferiti per le terapie sostitutive (es. proteine), i saggi immunologici competitivi sono preferiti nel caso di proteine con funzione antagonista (es. mAb).
Strategia bioanalitica
Basso Medio Alto *
Rischio clinico
Saggio di screening
Saggio di conferma
Titolo
NAb anche con
saggi immunologici
NAb con saggi “cell
based” preferito
Test NAb contro
proteina endogena
Test NAb contro proteina
endogena
Determinazione Isotipi
* Analisi in tempo reale
Conclusioni
• Importanza di individuare/sviluppare precocemente i reagenti e il saggio
• Necessità di sviluppare saggi validati in una fase precoce (preclinica).
• Necessità di sviluppare una strategia per il
monitoraggio della immunogenicità per prevenirne le conseguenze Risk Assessment
• Decisione caso per caso basato sulle caratteristiche del prodotto e della popolazione