Date post: | 04-Jun-2015 |
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Le nuove acquisizioni della diagnosi biochimica e
genetica: quanto manca per caratterizzare i pazienti
mitocondriali?
Valeria Tiranti
2° Convegno Nazionale sulle Malattie Mitocondriali
Firenze26-27 maggio 2012
Le malattie mitocondriali sono difetti multisistemici causati da alterazioni della
OXPHOS
Analisi biochimica della catena respiratoria, PDH, ciclo di Krebs
PCR quantitativa per delezione o deplezione del mtDNA
Ricerca di mutazioni frequenti del mtDNA
Sequenza dell'intero mtDNA
Analisi HRM e sequenza di geni nucleariEXOME SEQUENCING
Diagnostica avanzata=Diagnostica integrata
biopsia muscolare
Valutazione clinica, MRI
Cells Permeabilization by Digitonin
Digitonin
Mitochondrial Enriched Fraction•store at -80°C until use•just before assay 3 rounds freeze/thaw
CytosolCytosol
Cytosol
Cytosol
Fibroblasts>106 cells
Cholesterol
Cyto
solic f
racti
on
Mit
och
on
dri
al fr
acti
on
Cells h
om
og
en
ate
LDH activity
CS activity
Respiratory Chain Complexes
H H ++
1/2 O1/2 O22 HH22OO
H H ++
SuccinateSuccinateFumarateFumarateNADHNADH
H H ++
CoQ
Cyt c
Complex IComplex I Complex IIComplex II Complex IIIComplex III Complex IVComplex IV Complex VComplex V
NADNAD++
Intermembrane spaceIntermembrane space
MatrixMatrix
ATPATP
H H ++
ADP + PiADP + Pi
H H ++
I dosaggi spettrofotometrici misurano l’attività biochimica dei singoli complessi respiratori
Il materiale biologico è a volte insufficiente
Sensibilità del metodo non elevata Specificità tissutale: attenuazione o scomparsa del difetto biochimico presente nel muscolo o nel fegato, nei fibroblasti in coltura dello stesso paziente
Cosa fare con le determinazioni molecolari successive????
Limiti
Misurazioni in tempo reale su cellule adese e vitali in piastre da 96 pozzetti di: consumo ossigeno (OCR)
acidificazione del terreno (ECAR)
SEAHORSE XF96
Consumo O2 (OCR) e acidificazione terreno (ECAR)
Obiettivi specifici
Definire i protocolli sperimentali in fibroblasti con difetti OXPHOS geneticamente determinati
Verificare se l’ossigrafia su microscala potesse svelare la presenza di difetti in fibroblasti con normale attività biochimica spettrofotometrica, ma derivati da soggetti con difetto biochimico presente nel muscolo
Ridurre il numero di cellule necessarie per la definizione biochimica e l’inquadramento diagnostito del paziente.
6 pazienti con difetto Complesso I :Difetto biochimico muscolo 5/6Difetto biochimico fibroblasti 3/6
3 pazienti con difetto Complesso III :Difetto biochimico muscolo 2/3Difetto biochimico fibroblasti 1/3
6 pazienti con difetto Complesso IV :Difetto biochimico muscolo 4/6Difetto biochimico fibroblasti 5/6
19 linee di fibroblasti geneticamente determinati
4 pazienti con difetto Complesso V :Difetto biochimico muscolo 2/4Difetto biochimico fibroblasti 2/4
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
OC
R (
pM
ole
sO2/
min
/cel
ls)
control P1 P2
**
*
control
P1
P2
OC
R (
pM
ole
sO2/m
in)
Time (min)
4
5
9
FCCPOligo
Profilo OCR dopo aggiunta oligomicina e FCCP
1) Maximum respiration rate (MRR) viene calcolata come respirazione massima dopo aggiunta di FCCP (OCR-F)
2) Respiratory control ratio (RCR) viene calcolato come il rapporto tra OCR-F/OCR-O
3) Il metabolismo glicolitico rispetto a quello ossidativo viene calcolato come rapporto tra OCR/ECAR, in condizioni basali
4) Spare respiratory capacity viene misurata come differenza tra OCR-F and OCR in condizioni basali
Parametri di disfunzione mitocondriale
MRR in difetti di Complesso I
P1ND3 P2ND3 P3ND5 P4NDUFV1 P5NDUFA10 P6NDUFS1
mtDNA mutations Nuclear DNA mutations
0
20
40
60
80
100
120
140
160
% M
RR
*
**
*
**
****
C
P1-P3-P4 avevano attività spettrofotometriche normali
%C
I A
cti
vit
y
MRR in difetti di Complesso III
0
20
40
60
80
100
120
140
160
C P7 P8 P9
% M
RR
BCS1 mutations
** * **
0
20
40
60
80
100
120
140
160
P8-P9 avevano attività spettrofotometriche normali%
CII
I A
cti
vit
y
MRR in difetti di Complesso IV
0
20
40
60
80
100
120
140
160
C P10 P11 P14P13P12 P15
% M
RR
SURF1 SCO2COX15 COX6B1
**
** *** **
**
0
20
40
60
80
100
120
140
160
P14 aveva attività spettrofotometriche normale
%C
IV A
cti
vit
y
MRR in difetti di Complesso V da mutazioni in mtATP6
0
20
40
60
80
100
120
140
160
C P16 (8993T>G)
P17(8993T>C)
% M
RR
*
**
0
20
40
60
80
100
120
140
160
P18(TMEM70)
*
P19(TMEM70)
*
%C
V A
cti
vit
y
P16 e P17 avevano attività spettrofotometriche normali
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
SRC MRR RCR
controlsCICIIICIVCV
esti
mate
d m
arg
inal m
ean
s
esti
mate
d m
arg
inal m
ean
s
-1,0
OCR-B OCR-O OCR-F
controlsCICIIICIVCV
2,0
1,5
1,0
0,5
0
-0,5
controls
95
%C
on
f.In
t.
Normal Enzyme
Activities
0
1
2
3
4 Defective Enzyme
Activities
Vantaggi Limiti
SeaHorse XF96
Aumento sensibilitàRidotto numero di celluleRapidità e semplicitàMisurazioni in condizioni fisiologiche Le cellule rimangono vitali dopo le misure
Molti reagenti e substrati non entrano nelle cellule se non permeabilizzate: non si può stabilire quale complesso respiratorio è difettivo I risultati non sono di semplice interpretazione
Un nuovo agente permeabilizzante in difetti di Complesso I Glutamate (10mM)/Malate (5mM)
ADP (4mM)
Rotenone (2M)
Ct
Pt1Pt2
Un nuovo agente permeabilizzante in difetti di Complesso I Succinate (10mM)
ADP (4mM)
Antimycin (2M)
Ct
Pt1Pt2
Analisi di linkage e mappaggio per omozigosi
Identificazione geni candidati
Identificazione di geni-malattia: il vecchio metodo
Famiglie con malattie mitocondriali autosomiche recessive
Screening mutazionale
La ricerca di geni malattia: il nuovo approccio
EXOME SEQUENCING
Filtraggio e selezione dei geni candidati+ validazione patogenicità delle mutazioni
Pazienti singoli e piccole famiglie
EXOME SEQUENCING
Strategia per sequenziare selettivamente le regioni codificanti del genoma:ESOMA
L’esoma rappresenta l’insieme di tutte le sequenze esoniche del genoma umano
L’esoma costituisce circa 1% del genoma (30 MB) e dovrebbe contenere circa l’85% delle mutazioni associate a patologia
Consente di identificare le variazioni di sequenza a carico di potenziali geni-malattia
Exome sequencing: come funziona
E’ necessario sequenziare specifici frammenti di DNA costruendo una library arricchita per le regioni di interesse
Il DNA genomico viene frammentato
Vengono attaccati dei linker per il sequenziamento successivo
Filtraggio varianti identificate
Pannelli di riferimento1000 Genomes Project
Conservazione e patogenicità del cambio aa
Geni codificanti per proteine mitocondriali
Validazione patogenicità delle varianti
L’exome sequencing di un singolo campione di DNA produce circa 25000 varianti
Come fare per identificare la specifica mutazione responsabile della patologia??
EXOME SEQUENCING
Vantaggi
Applicazioni su casi singoli o su piccole famiglie
Mantiene una buona copertura delle sequenze di interesse
Costi più contenuti rispetto all’analisi dell’intero genoma
Tecnica di screening molto efficiente che consente di identificare geni responsabili di malattia
Limiti
Rileva solo le varianti presenti nella regione codificante dei geni
Non rileva le varianti strutturali e non codificanti associate a patologia (99% del genoma non è analizzato)
Delezioni/duplicazioni di interi esoni non vengono identificate
L’analisi statistica di un’ampia mole di dati può essere difficoltosa
Ci sono criticità legate alla presenza di falsi positivi e falsi negativi
EXOME SEQUENCING
2008 2009 2010 2011 2012
EXOME SEQUENCING n. pubblicazioni
EXOME SEQUENCING & MITO n. pubblicazioni
2010 2011 2012
4 pazienti diagnosticati
3 pazienti diagnosticati
EXOME SEQUENCING: 8 pazienti analizzati 5 casi risolti1 in corso di validazione2 negativi
11 pazienti diagnosticati
2 pazienti diagnosticati
Ricerca medica=Ricerca per il paziente
KOKO
WTWT
Funzione proteina?
modelli in vitro & in vivo
bioinformatica
Dal paziente
Al bancone
Identificazione di nuovi geni-malattiaEXOME SEQUENCING
Inquadramento clinico e biochimico