Quali sono gli strumenti a Quali sono gli strumenti a disposizione dell’istologo per lo disposizione dell’istologo per lo studio della cellula e dei tessuti?studio della cellula e dei tessuti?

ordine di grandezza delle strutture di ordine di grandezza delle strutture di interesse istologicointeresse istologico

• in questo corso raramente in questo corso raramente ci soffermeremo sulle ci soffermeremo sulle esatteesatte dimensioni delle dimensioni delle strutture oggetto di studiostrutture oggetto di studio

• è però di fondamentale è però di fondamentale importanza conoscere importanza conoscere l’l’ordine di grandezzaordine di grandezza di di tali strutturetali strutture

Cosa significa “ordine di grandezza”?Cosa significa “ordine di grandezza”?

• Semplificando:Semplificando:due oggetti differiscono di un due oggetti differiscono di un ordine di grandezza quando ordine di grandezza quando uno è circa 10 volte più uno è circa 10 volte più grande dell’altrogrande dell’altro

Importanza degli ordini di grandezzaImportanza degli ordini di grandezzaquale sarebbe l’esito di questo incidente?quale sarebbe l’esito di questo incidente?

può una proteina attraversare la membrana tramite un canale ionico?

può una proteina attraversare la membrana tramite un canale ionico?

scale lineari e scale logaritmichescale lineari e scale logaritmiche1 mm1 mm

100 µm100 µm

10 µm10 µm

1 µm1 µm

100 nm100 nm

10 nm10 nm

1 nm1 nm

1 1 ÅÅ

8 8 µmµm

7 7 µmµm

6 6 µmµm

5 5 µmµm

4 4 µmµm

3 3 µmµm

2 2 µmµm

1 µm1 µm

80 m80 mmm

70 m70 mmm

60 m60 mmm

50 m50 mmm

40 m40 mmm

30 m30 mmm

20 m20 mmm

10 mm10 mm

In una scala In una scala logaritimica, il valore logaritimica, il valore di ogni suddivisione si di ogni suddivisione si ottiene moltiplicando ottiene moltiplicando (o dividendo) il valore (o dividendo) il valore della suddivisione della suddivisione precedente.precedente.

In questa scala, il In questa scala, il fattore è 10fattore è 10

Questione di dimensioni…Questione di dimensioni…1 mm1 mm

100 µm100 µm

10 µm10 µm

1 µm1 µm

100 nm100 nm

10 nm10 nm

1 nm1 nm

1 1 ÅÅ

cellule epitelialicellule epiteliali

globuli rossiglobuli rossibatteribatteri

virusvirus

proteineproteine

aminoacidiaminoacidi

atomiatomi

le frecce bianche le frecce bianche indicano lindicano l’ordine di ’ordine di grandezza di alcune grandezza di alcune strutture biologiche strutture biologiche e chimichee chimiche

spessore di un capello umanospessore di un capello umano

immagine istologicaimmagine istologica- l’organismo è composto di cellule- esistono molti tipi diversi di cellule- l’organismo è composto di cellule- esistono molti tipi diversi di cellule

immagine istologicaimmagine istologica

tipicamente, cellule relativamente simili fra loro si aggregano ……formando i cosiddetti tessuti.L’istologia può anche essere definita come lo studio dei tessuti dell’organismo

tipicamente, cellule relativamente simili fra loro si aggregano ……formando i cosiddetti tessuti.L’istologia può anche essere definita come lo studio dei tessuti dell’organismo

immagine istologicaimmagine istologicacosa si osserva?cosa si osserva?

Anatomia del microscopio ottico o “luce”Anatomia del microscopio ottico o “luce”

bx51 interiorbx51 interiorschema di

funzionamento di un moderno

microscopio ottico

immagine istologicaimmagine istologicacome si ottiene, a partire da tessuti come si ottiene, a partire da tessuti biologici, unbiologici, un’immagine come questa?’immagine come questa?come si ottiene, a partire da tessuti come si ottiene, a partire da tessuti

biologici, unbiologici, un’immagine come questa?’immagine come questa?

Problema 1Problema 1

• la luce del microscopio pula luce del microscopio puòò attraversare solo materiale di attraversare solo materiale di spessore molto ridottospessore molto ridotto

La preparazione di materiale istologicoLa preparazione di materiale istologico

• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi

microtomo a slittamicrotomo a slitta

microtomi microtomi elettronicielettronici

Problema 2Problema 2

• i tessuti biologici sono per lo più i tessuti biologici sono per lo più mollimolli

La preparazione di materiale istologicoLa preparazione di materiale istologico

• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito– Fissazione con aldeidi– Inclusione– Congelamento

criostatocriostato

Problema 3Problema 3

• ii tessuti sono normalmente quasi tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrastoincolori e privi di contrasto

La preparazione di materiale istologicoLa preparazione di materiale istologico

• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato

• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

acidofilia e basofiliaacidofilia e basofilia

• le sostanze acide che si trovano le sostanze acide che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i nei tessuti possiedono affinità per i coloranti basici (basofilia)coloranti basici (basofilia)

• le sostanze basiche che si trovano le sostanze basiche che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i nei tessuti possiedono affinità per i coloranti acidi (acidofilia o coloranti acidi (acidofilia o eosinofilia)eosinofilia)

diversi tipi di diversi tipi di granulocitigranulociti

acidofilo (eosinofilo)

basofilo

neutrofilo

sequenza dei passaggi in una sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologicatipica procedura istologica

1.1. fissazione di un campione di tessuto fissazione di un campione di tessuto in formaldeidein formaldeide

2.2. congelamento del pezzocongelamento del pezzo

3.3. taglio al microtomotaglio al microtomo

4.4. montaggio su vetrinomontaggio su vetrino

5.5. ““bagni” in soluzioni di colorantibagni” in soluzioni di coloranti

6.6. disidratazione e disidratazione e coverslippingcoverslipping

lo strisciolo strisciodi sanguedi sangue

Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo “generico” appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo “generico” appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

strisciostrisciostrisciostriscio

Istologia Istologia “funzionale”“funzionale”

• Colture cellulariColture cellulari

• Coloranti vitaliColoranti vitali

• IstochimicaIstochimica

• ImmunoistochimicaImmunoistochimica

• ImmunofluorescenzaImmunofluorescenza

• Tecniche specialiTecniche speciali

– Traccianti assonaliTraccianti assonali

– Tecniche combinateTecniche combinate

L’istologia L’istologia moderna non moderna non si limita si limita alall’osservazione l’osservazione descrittiva dedescrittiva degli aspetti gli aspetti morfologici e strutturali morfologici e strutturali di base di cellule e di base di cellule e tessutitessuti..

Esistono numerose Esistono numerose tecniche che consentono tecniche che consentono di risponderedi rispondere a quesiti su a quesiti su specifici correlati specifici correlati funzionali della funzionali della composizione di un composizione di un tessutotessuto

Citochimica e IstochimicaCitochimica e Istochimica

• L’identificazione eL’identificazione e/o/o la misura la misura quantitativa mediante reazioni di quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessutidelle cellule e dei tessuti

Mentre nella biochimica tradizionale il materiale biologico viene studiato tipicamente “in provetta”,la citochimica e l’istochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su sezioni di tessuto, consentendo di identificare i costituenti in situ.

Immunofluorescenza e Immunofluorescenza e immunoistochimicaimmunoistochimica

• Metodi altamente sensibili per la Metodi altamente sensibili per la localizzazione di proteine o polisaccaridi localizzazione di proteine o polisaccaridi nei tessutinei tessuti

• IF: anticorpi coniugati con sostanze IF: anticorpi coniugati con sostanze fluorescentifluorescenti

• IIC: anticorpi coniugati con enzima IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica)istochimica)

immagine istologicaimmagine istologica

che livello di dettaglio si che livello di dettaglio si apprezza in questa immagine?apprezza in questa immagine?che livello di dettaglio si che livello di dettaglio si apprezza in questa immagine?apprezza in questa immagine?

stesso tessuto a stesso tessuto a maggiore ingrandimentomaggiore ingrandimentostesso tessuto a stesso tessuto a maggiore ingrandimentomaggiore ingrandimento

ulteriore ulteriore ingrandimento...ingrandimento...ulteriore ulteriore ingrandimento...ingrandimento...

è sufficiente ilè sufficiente il microscopio microscopio

otticoottico a a “saziare” “saziare” ogniogni curiositcuriosità sulle à sulle

strutture strutture viventi?viventi?

Questione di dimensioni…Questione di dimensioni…1 mm1 mm

100 µm100 µm

10 µm10 µm

1 µm1 µm

100 nm100 nm

10 nm10 nm

1 nm1 nm

1 1 ÅÅ

Occhio umanoOcchio umano

Microscopio otticoMicroscopio ottico

cell. epiteliali

globuli rossibatteri

virus

proteine

aminoacidi

atomi

le frecce indicano il le frecce indicano il massimo massimo potere risolutivopotere risolutivo di alcuni strumenti di di alcuni strumenti di osservazioneosservazione

le frecce indicano il le frecce indicano il massimo massimo potere risolutivopotere risolutivo di alcuni strumenti di di alcuni strumenti di osservazioneosservazione

Che differenza c’è fraChe differenza c’è fra::

ingrandimentoingrandimentoee

potere di risoluzione? potere di risoluzione?

Questo è quello che Questo è quello che succede quando si succede quando si ingrandisce ingrandisce indefinitamente indefinitamente un’immagine.un’immagine.

Aumentare a piacimento la Aumentare a piacimento la risoluzione di un’immagine risoluzione di un’immagine già acquisita è possibile già acquisita è possibile solo nei film americani...solo nei film americani...

il potere risolutivoil potere risolutivo

dello strumento di osservazionedello strumento di osservazione

determina il livello di dettaglio determina il livello di dettaglio contenuto nell’immagine.contenuto nell’immagine.

L’ingrandimento non determina L’ingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle un aumento di risoluzione delle

immaginiimmagini

di conseguenza, l’ulteriore ingrandimento di questa di conseguenza, l’ulteriore ingrandimento di questa immagine non rivela maggiori dettagliimmagine non rivela maggiori dettagli

il microscopio il microscopio elettronico a elettronico a trasmissionetrasmissione

per fortu

na esis

te...

per fortu

na esis

te...

m. ottico em. ottico em. elettronico m. elettronico a confrontoa confronto

filamento(catodo)

anodo

condensatore

preparato

obiettivo

proiettore

schermofluorescente

B

condensatore

lam pada

preparato

obiettivo

oculare

Microscopia elettronicaMicroscopia elettronica• Preparazione del tessutoPreparazione del tessuto

– FFissazione in glutaraldeideissazione in glutaraldeide– Postfissazione in tetrossido di osmioPostfissazione in tetrossido di osmio– Disidratazione con alcolDisidratazione con alcol– Inclusione in plastiche acriliche o resine Inclusione in plastiche acriliche o resine

epossidicheepossidiche

• Taglio all’ultramicrotomoTaglio all’ultramicrotomo– Sezioni ultrafini di 20-40 nmSezioni ultrafini di 20-40 nm

• Aumento del contrastoAumento del contrasto– Coloranti elettronici come acetato di Coloranti elettronici come acetato di

uranile o citrato di piombouranile o citrato di piombo

ultramicrotomoultramicrotomo

l’ultramicrotomo produce tipicamente sezioni di 50-70 nml’ultramicrotomo produce tipicamente sezioni di 50-70 nm

Esempio di Esempio di microscopia microscopia elettronica a elettronica a trasmissionetrasmissione

linfocitolinfocito

Le immagini di Le immagini di microscopia elettronica microscopia elettronica sono “in bianco e nero”.sono “in bianco e nero”.

Le parti Le parti “scure” si “scure” si dicono dicono elettrondenseelettrondense..

L’altissimoL’altissimo potere potere risolutivo del ME risolutivo del ME consente di distinguere consente di distinguere numerose componenti numerose componenti subcellularisubcellulari..

stereomicroscopiostereomicroscopio

• la luce incide la luce incide sull’oggetto e sull’oggetto e viene riflessa viene riflessa da essoda esso

• si osservano si osservano oggetti in oggetti in rilievorilievo

poi c’è anche...

poi c’è anche...

MicroscopiMicroscopioo elettronic elettronicoo a scansione a scansione

MicroscopiMicroscopioo elettronicelettronicoo a a scansionescansione • Risoluzione inferiore Risoluzione inferiore

rispetto alla ME a rispetto alla ME a trasmissionetrasmissione

• Consente di Consente di valutare il rilievo valutare il rilievo degli oggettidegli oggetti

• Usata per lo studio Usata per lo studio delle superfici delle superfici cellularicellulari

Questione di dimensioni…Questione di dimensioni…1 mm1 mm

100 µm100 µm

10 µm10 µm

1 µm1 µm

100 nm100 nm

10 nm10 nm

1 nm1 nm

1 1 ÅÅ

Occhio umano

Microscopio ottico

Microscopio elettronico a trasmissione

cell. epiteliali

globuli rossibatteri

virus

proteine

aminoacidi

atomi

Microscopio elettronico a scansione

ll’’osservazione di diversi livelli di osservazione di diversi livelli di organizzazione della materia vivente organizzazione della materia vivente richiede l’uso di diversi strumentirichiede l’uso di diversi strumenti

capello

capello

alcuni esempi di microscopia elettronica a scansione…

form

ica

form

ica

““ bug”

bug”

ragno

ragno

tipi di tipi di microscopiomicroscopio

Tipo di osservazioneTipo di osservazione

Sezioni di Sezioni di tessutotessuto

Morfologia Morfologia esternaesterna

Fonte di Fonte di energiaenergia

Luce Luce visibilevisibile

Microscopio Microscopio otticoottico

Stereo-Stereo-microscopiomicroscopio

ElettroniElettroniMicroscopio Microscopio elettronico a elettronico a trasmissionetrasmissione

Microscopio Microscopio elettronico a elettronico a scansionescansione