Ricerca di sostanze stupefacenti in matrici pilifere e urinarie

Introduzione

Durante il periodo di tirocinio (27 Febbraio 2013 – 15 Aprile 2013) che ho svolto presso il laboratorio di

Tossicologia Forense dell’Istituto di Medicina Legale dell’Università di Macerata, mi sono occupata

soprattutto della determinazione di alcune sostanze stupefacenti in matrici pilifere e urinarie. Questo tipo

di analisi viene solitamente eseguita su richiesta delle Commissioni Mediche Locali Patenti delle province di

Ancona e Ascoli Piceno. Tra gli altri accertamenti (ad esempio tests psicoattitudinali), le Commissioni

Mediche delle province di Ancona e di Ascoli Piceno dispongono anche l’analisi del capello. Dal momento

che consente un’indagine retrospettiva sull’uso di droghe, l’analisi di campioni di capelli fornisce alla

Commissione Medica Patenti un’informazione utile con cui valutare se nel periodo di sospensione della

patente di guida il conducente abbia ancora consumato sostanze stupefacenti. Avvalendosi del risultato

ottenuto da questo esame insieme agli altri predisposti, la Commissione Medica esprime da ultimo un

giudizio circa l’idoneità e la conformità alla guida.

Meccanismi di accumulo delle sostanze nel capello

Il meccanismo attraverso il quale le sostanze si accumulano nella matrice cheratinica è da lungo tempo

oggetto di studio, ma attualmente non è ancora ben definito. Quello generalmente proposto presuppone

che avvenga una diffusione passiva delle molecole direttamente dal sangue alle cellule in fase di

formazione nel follicolo pilifero: a seguito della morte, le cellule, fondendosi a formare il fusto del pelo,

intrappolano le sostanze eventualmente presenti, che restano inglobate senza subire ulteriori processi

metabolici. Si ritiene invece che nella fase successiva di accrescimento del pelo incidano sull’accumulo le

secrezioni sebacee e sudoripare. Un ultimo fattore di accumulo è rappresentato dalla deposizione

(deposizione passiva) e dalla successiva penetrazione nella struttura pilifera della sostanza presente

nell’ambiente sottoforma di fumo, polvere, aerosol ecc. Di recente è stato proposto che la melanina possa

giocare un ruolo attivo in qualità di carrier nel provocare l’accumulo delle sostanze. Una tale considerazione

scaturisce dal fatto che sono state evidenziate differenze di accumulo delle droghe tra capelli neri, castani e

biondi: l’accumulo infatti sembra che avvenga in misura notevolmente maggiore nei capelli che possiedono

una pigmentazione più scura. Con la crescita del capello la sostanza in origine inglobata nella parte

prossimale vicino al bulbo si sposta alla velocità con cui il capello cresce (approssimativamente 1,3 cm al

mese): ne consegue che per capelli lunghi, potendo rinvenire la presenza della sostanza anche nella

porzione distale del capello, è possibile definire un comportamento di uso anche a notevole distanza

cronologica rispetto all’assunzione. Una volta accumulatasi nel capello, la sostanza permane stabile

indefinitamente, tanto che la sua presenza può essere rinvenuta anche a distanza di anni. E’ stato anche

dimostrato attraverso numerosi studi che l’analita che si accumula nei capelli in quantità maggiori è la

sostanza come tale, ossia la molecola parente (ad esempio la cocaina), e non il suo principale metabolita

(nel caso della cocaina la benzoilecgonina), diversamente da quanto accade nei fluidi biologici. Infine si

ritiene che l’accumulo di droghe basiche sarebbe facilitato rispetto a quello di farmaci a comportamento

acido: ciò può essere spiegato ipotizzando che avvenga un meccanismo di scambio ionico, il quale

favorirebbe le molecole neutre o leggermente basiche rispetto a quelle acide.

Finalità dell’analisi dei capelli

L’analisi dei capelli fornisce un’indagine retrospettiva sull’uso, anche saltuario, di sostanze d’abuso. Essa

permette anche di stimare con buona approssimazione il periodo dell’uso, considerando da un lato che le

sostanze si depositano e non diffondono lungo il capello in crescita, e dall’altro che il capello si allunga di

media 1,3 cm al mese: ne consegue che è possibile ottenere informazioni cronologiche sull’uso di droga e/o

definire l’evoluzione nel tempo del consumo analizzando porzioni seriate di capelli. Dal momento che la

loro analisi permette di valutare un uso pregresso nel tempo di farmaci, i capelli attualmente vengono

ampiamente adoperati nel campo delle analisi tossicologiche, per risolvere problematiche attinenti alla

sicurezza stradale o alla sicurezza in ambito lavorativo, per verificare l’uso cronico di sostanze stupefacenti,

per valutare l’adesione ad un contratto terapeutico.

Punti di forza dell’analisi

1. La finestra temporale di rilevabilità dall’ultima assunzione del farmaco è ampia, permettendo così

di evidenziare un numero di casi positivi maggiore rispetto a quello riscontrabile nei campioni di

urine. Nel caso delle urine infatti, per rinvenire il farmaco, occorre prelevare il campione prima che

avvenga la sua completa eliminazione, ossia entro pochi giorni dall’ultima assunzione del farmaco

stesso, valutabili sulla base della sua farmacocinetica.

2. Il prelievo non è invasivo.

3. Il prelievo dei capelli può essere ripetuto senza che varino significativamente le concentrazioni

delle sostanze presenti, raccogliendo un nuovo identico campione.

4. Il prelievo non pone i problemi tipici della raccolta controllata (rilevanti invece per l’analisi delle

urine).

5. I capelli possono essere conservati per lungo tempo senza dover ricorrere a particolari

accorgimenti, dato che non sono soggetti a deterioramento.

6. L’analisi dei capelli permette di identificare falsi-negativi ottenuti da altre analisi (ad esempio

derivanti dalla diluizione operata sulle urine) perché difficilmente la concentrazione del farmaco nei

capelli può essere alterata.

Sostanze stupefacenti ricercate

Premessa

L’uso di diversi tipi di droghe d’abuso può essere rivelato dall’analisi dei capelli; tra queste l’eroina, la

cocaina, le amfetamine, la marijuana o l’hashish, la nicotina, le benzodiazepine, i barbiturici ecc.. Tuttavia le

Commissioni Mediche Locali Patenti più frequentemente richiedono che venga accertata nella matrice in

questione la presenza della cocaina, degli oppiacei e del Δ9 tetraidrocannabinolo. Nello specifico in questo

lavoro mi occuperò di descrivere le analisi effettuate per verificare la presenza di cocaina e oppiacei su

matrici pilifere e urinarie.

Per droga o sostanza stupefacente si intende una sostanza psicoattiva che provoca un effetto sul sistema

nervoso centrale e autonomo e altera l’equilibrio psicofisico dell’organismo. L’uso compulsivo di droga è

causa di dipendenza fisica, o di dipendenza psichica o di entrambe, a seconda della classe a cui la sostanza

appartiene.

Cocaina

La cocaina, l’alcaloide attivo estratto dalle foglie della pianta Erithroxilon Coca, è una sostanza definita

“psicoanalettica”, poiché possiede un effetto stimolante del sistema nervoso. L’assunzione della cocaina è

caratterizzata da un profonda dipendenza psichica. Il suo principale metabolita è la benzoilecgonina (BE) e i

metaboliti minoritari sono l’ecgonina metil estere (EME) e l’ecgonina. La benzoilecognina è un metabolita

inattivo, si ritrova nelle urine umane e costituisce il 32-49% del metabolismo della cocaina. La conversione

di cocaina a norcocaina, attraverso la metilazione dell’azoto della cocaina, costituisce solo una piccola

frazione del metabolismo (2.6% -6.2%).

Oppiacei

Per oppio si intende “il lattice disseccato ottenuto per incisione delle capsule ancora verdi del Papaverum

Sonniferum L.”. Esso è costituito da una miscela complessa contenente zuccheri, proteine, lipidi, acqua ed

alcaloidi (10-20% del peso totale) che vengono distinti in fenantrenici, quelli dotati di attività stupefacente,

ed isochinolonici. Il più abbondante alcaloide a nucleo fenantrenico estratto dall’oppio è la morfina;

seguono, in ordine decrescente di concentrazione, la narcotina, la codeina e la tebaina. L’eroina, o

diacetilmorfina, è un prodotto semisintetico ottenuto attraverso un’energica reazione di acetilazione della

morfina. Il metadone, invece, usato nei trattamenti di disassuefazione degli stati di dipendenza da oppiacei,

è una sostanza ottenuta completamente per sintesi in laboratorio.

Fasi dell’analisi chimico tossicologica

L’analisi tossicologica delle produzioni pilifere prevede quattro fasi principali:

1. taglio e la raccolta del campione biologico;

2. decontaminazione;

3. separazione dell’analita ed eventualmente dei suoi metaboliti dalla matrice cheratinica,

4. identificazione attraverso la gascromatografia di massa.

I campioni piliferi, provenienti dai diversi laboratori competenti, arrivano in laboratorio accompagnati da

un’ opportuna scheda in cui sono inseriti i dati anagrafici del soggetto richiedente e le tipologie di analisi da

effettuare su di esso. Il campione pilifero viene quindi registrato con un codice numerico e tagliato con

forbici adatte in segmenti di lunghezza il più possibile ridotta.

Un’aliquota del campione viene posta in una provetta conica di plastica (il quantitativo minimo richiesto

per l’esecuzione dell’analisi si aggira intorno ai 50 mg).

Taglio del campione di capelli

Per la ricerca della cocaina e degli oppiacei nelle produzioni pilifere si segue la seguente metodica analitica.

Poiché la cocaina e gli oppiacei risultano instabili a pH fortemente alcalini, piuttosto che un’idrolisi basica

del campione si esegue un’idrolisi acida blanda, aggiungendo ad esso 2 ml di acido cloridrico (HCl) 0,1M

all’1% ed incubando la soluzione in stufa per almeno 18 ore alla temperatura di 45°C: in questo mezzo

estraente risultano sufficientemente stabili la cocaina, la benzoilecgonina e la morfina. Oltre all’acido si

addizionano alla soluzione 100 μl di nalorfina (da una soluzione di 10 ng di nalorfina/μl di metanolo) o 100

μl di proadifen (SKF) (da una soluzione di 10 ng di proadifen/μl di metanolo): essi rappresentano gli

standard interni rispettivamente della morfina e della cocaina.

Una volta raffreddatasi dopo il periodo d’incubazione, alla soluzione vengono addizionati 2 ml di tampone

fosfato 0,1M a pH 6 e all’incirca 100 μl di soda 2M all’8% fino a raggiungere un pH compreso tra 6 e 7; si

controlla quindi il pH immergendo nella soluzione la cartina al tornasole, ed eventualmente lo si aggiusta

attraverso piccole aggiunte di acido o di base.

A questo punto la soluzione viene centrifugata per alcuni minuti e lasciata nuovamente raffreddare.

Nel frattempo, si posiziona sull’estrattore da vuoto (vacuum manifold) una colonnina SPE (solid phase

extraction) per ciascun campione che deve essere esaminato. Le colonnine SPE vengono utilizzate per

estrarre le sostanze da identificare e, di conseguenza, per purificare il campione, riducendo la

concentrazione dei composti interferenti e concentrando nel contempo gli analiti di interesse: perché

questo processo avvenga, è necessario che i gruppi funzionali della fase assorbente di cui le colonnine sono

costituite presentino affinità dal punto di vista chimico-fisico con le sostanze che devono essere

identificate. Facendo una scelta accurata della fase assorbente in rapporto al materiale da separare, è

possibile quindi ottenere estrazioni molto selettive, con elevati recuperi di molecole altamente purificate:

infatti, interagendo tramite legami più o meno forti con la fase stazionaria, gli analiti d’interesse vengono

trattenuti, mentre gli interferenti vengono lasciati passare.

Il processo di estrazione e purificazione del campione per mezzo delle colonnine SPE consta di cinque fasi

fondamentali:

1. il condizionamento della colonnina;

2. l’aggiunta del campione;

3. il lavaggio della colonnina;

Colonnine SPE

4. la disidratazione della colonnina;

5. l’eluizione dei composti trattenuti dalla fase assorbente.

Il condizionamento consiste nel far passare attraverso la fase assorbente 2 ml di metanolo: l’obiettivo è

quello di attivare i gruppi funzionali di legame distendendoli dalla fase solida ed esponendoli così al

successivo flusso del campione. La solvatazione della colonnina perciò fa sì che i gruppi funzionali

reagiscano in maniera costante con le molecole ad essi affini. Un’ulteriore funzione del condizionamento è

quella di rimuovere eventuali polveri ed impurità derivanti dall’abrasione della silice, avvenuta nel corso del

processo di produzione o durante il trasporto della colonnina. Di seguito al metanolo, si aggiungono 2 ml di

tampone fosfato 0,1M a pH 6 in modo da rimuovere l’eccesso del solvente usato per il condizionamento.

Per l’importanza che riveste la fase di condizionamento è bene che il flusso del metanolo e del tampone

fosfato non superi i 3 ml/min; inoltre, in questa prima fase così come in quelle dell’aggiunta del campione e

del lavaggio, è necessario prestare attenzione affinché le colonnine non vadano mai a secco.

Nell’aggiungere il campione è indispensabile assicurarsi che il suo flusso attraverso la colonnina non sia

eccessivamente elevato (1-2 ml/min), in modo tale da garantire tutto il tempo necessario affinché si

instaurino legami tra la silice attivata e le molecole da identificare.

Il lavaggio della colonnina si attua lasciando scorrere attraverso la fase stazionaria in sequenza 2 ml di

acqua distillata, 3 ml di acido cloridrico 0,1M all’1% e 5 ml di metanolo: lo scopo è quello di ripulire la

colonnina dalle sostanze interferenti polari, acide e leggermente apolari, che si legano ad essa debolmente

o che non interagiscono affatto.

La disidratazione delle colonnine si ottiene facendo il vuoto per 5 minuti all’interno del vacuum manifold sul

quale sono inserite: si rende necessario infatti rimuovere i residui dei solventi precedentemente utilizzati,

con i quali la soluzione di eluizione risulta immiscibile.

Il processo dell’eluizione degli analiti prevede che venga fatta scorrere attraverso la colonnina una

soluzione apolare, avente un’affinità per le molecole da identificare superiore a quella esistente tra le

molecole stesse e i gruppi funzionali della colonnina con cui interagiscono. L’eluente è una soluzione

costituita da diclorometano/alcol isopropilico (8:2) con il 2% di ammoniaca. L’alcalinizzazione con

ammoniaca (pH > pKa delle molecole) rende neutre le molecole di cocaina e morfina. L’eluato viene quindi

raccolto in vials e lasciato evaporare fino a secchezza.

Colonnine SPE durante l’eluizione

Sia gli estratti di cocaina e morfina che quelli del Δ9 tetraidrocannabinolo, cannabinolo e cannabidiolo vengono analizzati per mezzo della gascromatografia di massa (GC/MS). Nel caso in cui l’estratto sia cocaina e morfina, viene ricostituito con 50 μl di un derivatizzante, l’N-metil-N-(trimetilsilil)acetamide (MSTFA) e scaldato in stufa a 75°C per 20 minuti, curando che la vial sia chiusa ermeticamente; 1 μl di questa soluzione vengono poi iniettati in colonna. La derivatizzazione consiste nella conversione delle sostanze presenti nel campione a molecole meno polari e più volatili, in grado di affrontare la separazione gascromatografica. Nel caso in questione, le molecole che vengono convertite in trimetilsililderivati sono la benzoilecgonina (un gruppo trimetilsilil si lega all’ossidrile acido), la morfina (due gruppi trimetilsilil si legano agli ossidrili in posizione 3 e 6) e la nalorfina (due gruppi trimetilsilil si legano ciascuno ad un ossidrile); la cocaina e l’SKF, invece, non subiscono il processo di derivatizzazione.

Il sistema utilizzato é costituito da un “TraceGC ultra” associato al rivelatore di massa “Polaris Q”. La colonna capillare impiegata è una “Rtx-5MS”, presentante una lunghezza pari a 30 m ed un diametro interno di 0,25 mm. L’iniettore è utilizzato nella modalità splitless (50 sec) e la sua temperatura è pari a 250°C. Lo spettrometro di massa lavora in full scan ed il range di masse da esso esaminato va da 70 a 500. Il limite di sensibilità dello strumento è di 0,1 ng/mg. La concentrazione di cut-off utilizzata per l’analisi quantitativa in GC/MS è di 0,5 ng/mg per tutte le sostanze. Il cut-off, espresso in nanogrammi di droga per milligrammo di capelli, è un valore prestabilito, al di sotto del quale il risultato dell’analisi deve essere considerato negativo.

L’analisi in GC/MS fornisce oltre allo spettro di massa, anche un gascromatogramma che rappresenta

l’andamento della corrente ionica totale. Nella tabella qui di seguito, si riportano i tempi di ritenzione ed i

valori del rapporto massa/carica più importanti, relativi a ciascuna sostanza esaminata e ai due standard

interni addizionati.

Gascromatografo di massa

Sono evidenziati con il colore blu i valori corrispondenti ai picchi base; sono invece colorati in viola i valori

corrispondenti ai picchi molecolari; infine i valori in verde stanno ad indicare che il picco base coincide con

il picco molecolare. Tutti i dati inseriti in tabella sono stati estrapolati dai cromatogrammi e dagli spettri di

massa ottenuti dall’analisi di alcuni campioni piliferi risultati positivi alle sostanze stupefacenti ricercate.

Conoscendo i tempi di ritenzione e i valori m/z caratterizzanti ciascuna sostanza stupefacente, è immediato

determinare la positività o la negatività del campione analizzato alle molecole ricercate. Infatti, il

programma “Xcalibur”, ossia il software associato al gascromatografo di massa, oltre a permettere di

settare i parametri relativi al funzionamento del gascromatografo (per esempio le temperature

dell’iniettore e della camera termostatica) e dello spettrometro di massa, consente anche, una volta

terminata la corsa cromatografica, di focalizzare l’attenzione su un particolare ione, avente un valore di

massa/carica definito. In questo modo vengono evidenziati soltanto quei picchi cromatografici

corrispondenti alle sostanze che dalla ionizzazione per impatto elettronico abbiano generato lo ione in

questione: tale tecnica viene definita SIM, Selected Ion Monitoring. Di seguito vengono riportati alcuni

esempi di cromatogramma (SIM) e gli spettri di massa relativi alle sostanze stupefacenti ricercate: morfina

e cocaina.

SOSTANZE TEMPI DI

RITENZIONE VALORI m/z

COCAINA 10,30 ~ 82 – 182 - 303 - 272

BENZOILECGONINA-TMS 10,80 ~ 82 – 240 – 361 – 346 - 361

MORFINA-TMS 12,70 ~ 429 – 414 – 401 - 324

NALORFINA-TMS 13,70 ~ 455 – 414 – 440 - 324

SKF 11,20 ~ 86 – 165 – 209 - 281

Cocaina: cromatogramma e spettro di massa

Morfina-TMS: cromatogramma e spettro di massa

Ricerca cocaina e morfina in matrici urinarie

L’urina è un’altra matrice biologica della quale mi sono occupata per analizzare le sostanze d’abuso.

I vantaggi che essa presenta sono i seguenti:

prelievo non invasivo del campione;

possibilità di campionare grandi volumi;

possibilità di analizzare sia le sostanze che i loro metabolici dopo diversi giorni. Tuttavia essa presenta degli svantaggi; le concentrazioni degli analiti in essa presenti variano infatti con:

dose;

via di somministrazione;

tempo di latenza tra assunzione e analisi;

stato fisiologico dell’individuo;

relativamente facile l’eventuale aggiunta di sostanze adulteranti.

Per la ricerca della cocaina e degli oppiacei nelle matrici urinarie si segue la seguente metodica analitica.

Il processo di estrazione e purificazione del campione avviene per mezzo delle colonnine SPE ed è molto

simile a quello effettuato su matrici pilifere. In questo caso 5 ml di urina vengono addizionati di standard

interno e portati a pH tra 4 e 6 per aggiunta di 2 ml di tampone fosfato (pH=6).

Per solvatare la colonna vengono fatti passare 2 ml di MEOH, successivamente 2 ml di H20 e quindi 2 ml di

tampone fosfato 0,1 M (pH=6).

Nella fase successiva viene aggiunto il campione. Questo viene applicato alla colonna per gravità con un

flusso non superiore a 2 mL/min.

Si procede poi con il lavaggio della colonna mediante aggiunta di acqua deionizzata, acido cloridrico ed

infine metanolo. In questo caso il flusso non è determinante. Infine si lascia asciugare la colonna per 5

minuti sotto vuoto spinto.

Per l’eluizione dell’analita si fa passare e si raccoglie 2 ml di una miscela di diclorometano/alcol isopropilico

(8:2) con il 2% di ammoniaca. L’eluato portato completamente a secco viene ricostituito con 0,5 mL di

cloruro di metilene. Si procede quindi iniettando 1 µl in GC.

Test ELISA per la rilevazione di cocaina e morfina su matrici pilifere

I test ELISA consentono la rilevazione qualitativa e semi-quantitativa delle droghe e dei loro metaboliti.

Le analisi effettuate con i test ELISA sono estremamente flessibili ed hanno un’elevata sensibilità anche per

la rilevazione della più piccola quantità di droga.

Dopo la procedura di estrazione, a 100 µl di estratto si aggiungono 400 µl di BSA.

Si carica 10 µl della diluizione nei pozzetti. Si aggiunge 100 µl di enzima.

Si lascia incubare per un’ ora a temperatura ambiente e al buio.

Si procede poi con sei lavaggi utilizzando 350 µl di H20 distillata.

Si asciugano bene i pozzetti e si aggiungono 100 µl di TMB substrato.

Si lascia incubare al buio per trenta minuti a temperatura ambiente.

Si aggiunge la stop solution e si esegue la lettura allo spettrofotometro a 450 nm.

Risultati negativi si hanno quando l’assorbanza risulta superiore al cut-off di riferimento.

Risultati positivi si hanno quando l’assorbanza misurata è minore o uguale al cut-off di riferimento; questi

vengono confermati eseguendo l’analisi in gas-massa.

Conclusioni

Terminata l’analisi delle produzioni pilifere per la determinazione delle sostanze stupefacenti, il laboratorio

di Tossicologia Forense stila un referto nel quale vengono indicati, oltre ai dati relativi al soggetto

esaminato, anche la metodica analitica impiegata, le molecole ricercate, i risultati dell’analisi (positivo o

negativo), ed infine i valori di cut-off stabiliti. Il referto così compilato viene successivamente inviato alla

Commissione Medica Locale Patenti che ha richiesto l’analisi al laboratorio di Tossicologia Forense.