BIOLOGIA DELLO SVILUPPO

Ontogenesi e filogenesi

Tutti gli organismi multicellulari iniziano la propria vita come una singola cellula: un uovo

fecondato.

Questa cellula va poi incontro a ripetute divisioni cellulari, per cui dal semplice e singolo zigote

iniziale si arriva a un organismo con un livello di complessità e pluricellularità altissimo.

Animali e vegetali sono totalmente diversi tra loro, e all’interno di questi regni è riconoscibile

un’altissima varietà di sottoregni, phyla, classi, ecc. Tanto che un regno come quello degli animali

comprende allo stesso tempo il C. Elegans e l’uomo.

Nonostante questa enorme varietà morfologica, che riflette una enorme varietà genetica, molti dei

meccanismi dello sviluppo dell’embrione (ontogenesi) di una specie sono simili, se non identici, a

quelli di tutte le altre specie.

Lo sviluppo dell’embrione, inoltre, sembra ricapitolare la filogenesi, ossia il particolare percorso

evoluzionistico che ha portato quella specie ad evolversi dall’eucariote ancestrale (lo zigote)

all’organismo attuale, passando per una miriade di stati intermedi via via più complessi.

Sono esemplificativi in tale senso i disegni di Haeckel, per quanto controversi (e falsi), volevano

provare e rendono bene un concetto, comunque accettato dalla comunità scientifica: l’ontogenesi

ricapitola la filogenesi.

Come si può vedere la tabella deve essere letta in verticale, e infatti sulle colonne è rappresentata

l’ontogenesi di 8 organismi ritenuti progressivamente più complessi.

Eppure i disegni, ovvero la morfologia degli stadi embrionali, è così simile tra i vari organismi, che

è possibile leggere la tabella anche in orizzontale, quasi come fosse descritta l’ontogenesi di 1 solo

organismo.

Ma in orizzontale non se ne legge la ontogenesi, bensì una ipotetica filogenesi. Per cui da un

organismo inizialmente acquatico (il pesce) si è poi passati a uno anfibio (la salamandra e poi la

tartaruga), poi pian piano a organismi completamente terrestri sempre più complessi (il pollo fino al

coniglio e all’uomo).

Dalla morfologia alla genetica

I disegni di Haeckel rappresentano uno dei primi tentativi di comprendere il processo attraverso cui

si sviluppa un organismo, eppure furono capaci di cogliere uno dei fondamenti di questa branca

della biologia come vedremo alla fine di questo capitolo.

Questi disegni sono, inoltre, esemplificativi dei primi studi di embriologia, che consistevano

appunto nell’osservazione e nella descrizione, ossia in embriologia descrittiva, in quanto non si

possedevano strumenti necessari alla manipolazione delle cellule.

Non appena ciò fu possibile si procedette ai primi esperimenti, dando inizio alla embriologia

sperimentale.

Non a caso i primi tentativi furono effettuati su organismi modello come il pollo e la rana che hanno

uova molto grandi.

Lo step successivo fu il passaggio alla genetica, grazie all’isolamento di mutanti dello sviluppo

negli organismi modello più utilizzati tutt’ora: Drosophila M., C. Elegans, Mus Musculus, Danio

Rerio.

Infine quando furono disponibili le tecniche di biologia molecolare e in particolare il

sequenziamento, l’analisi di genomi e quindi la genomica comparativa si confermarono i sospetti

iniziali:

I geni regolanti lo sviluppo presentano un altissimo livello di conservazione e omologia tra specie. I

meccanismi con cui si sono evoluti organismi a complessità maggiore sono essenzialmente basati

sulla duplicazione genica.

Infatti i set di geni regolanti lo sviluppo sono gli stessi, ma via via che si procede in organismi più

complessi aumentano le copie di ogni singolo gene del set, sebbene queste copie svolgano una

funziona identica in tutti gli organismi.

Spesso è possibile sostituire tali geni omologhi tra specie diverse senza ottenere anomalie nello

sviluppo, indicando quindi che questi geni svolgono funzioni identiche (e quindi sono

interscambiabili) in specie anche molto diverse tra loro (per es engrailed in drosophila e topo).

Questi geni regolano soprattutto l’adesione e il signaling, cioè la comunicazione cellulare, e oppure

codificano per proteine leganti il dna.

Mentre questi geni sono altamente conservati, si nota una gran variabilità a livello delle sequenze di

regolazione dell’espressione genica.

Quindi in questo senso l’ipotesi per cui l’ontogenesi ricapitola la filogenesi è corretta.

Sviluppo

Lo sviluppo è un aumento regolato del numero di cellule, associato ad un aumento della diversità

cellulare, coordinato nello spazio e nel tempo.

L’aumento del numero di cellule è intrinseco dalla divisione cellulare.

La diversità cellulare consiste in cellule diverse che svolgono funzioni diverse. Poiché il materiale

genetico è identico in tutte le cellule di uno stesso organismo, le differenti funzioni sono ottenute

attraverso differenti set di espressione genica.

Tuttavia deve esistere un meccanismo per cui una cellula dividendosi genera 2 figlie, che prendono

ognuna una strada diversa. Esistono, infatti, centinaia di tipi di versi di cellule in un organismo,

eppure sono tutte originate dallo stesso zigote.

Differenziazione

La diversità può essere dovuta a influenze interne alla cellula o esterne.

Con influenza interna, si intende soprattutto il concetto di divisione asimmetrica, per cui le 2 cellule

risultanti dalla divisione hanno una qualche serie significativa di molecole suddivisa in modo

ineguale. Queste molecole faranno da determinante del destino, per cui la cellula che le possiede

differenzierà in un modo, quella che non le possiede in un altro.

Un diverso modo di determinare il destino di una cellula può essere dovuto a influenze esterne

come nel caso del signaling cellulare. Per cui altre cellule, anche materne, secernono molecole

captate dall’embrione, oppure attraverso adesione cellulare, o altri meccanismi di comunicazione

cellulare, attivano determinati pathway nelle cellule target, che attivano geni determinanti il destino.

In pratica si tratta di una segnalazione di tipo induttivo per cui cellule inizialmente identiche,

vengono esposte ad ambienti diversi, e in conseguenza di questi diversi stimoli ambientali si

adattano in modi differenti.

Un esempio di metodo di differenziazione ce lo offre il sistema di determinazione dell’oocita in

Drosophila Melanogaster.

Come nello sviluppo si devono indirizzare le cellule ognuna verso il proprio destino, così in un

organismo adulto ci sono tessuti in continua proliferazione e differenziazione. Ad esempio nel

midollo osseo umano ci sono progenitori tutti identici dai quali originano tutti i tipi di cellule del

sangue, che hanno funzioni ben differenti tra loro.

Lo stesso vale per la linea germinale: ci sono dei progenitori dai quali originano tutti gli oociti.

Ovviamente deve esistere un sistema per cui un progenitore non è più un progenitore, ma una

cellula committed, cioè indirizzata e quindi destinata a diventare un oocita.

In Drosophila questa decisione è effettuata in seguito a 4 divisioni cellulari.

Il progenitore iniziale di divide, e le 2 cellule figlie subiscono un’altra divisione, e le 4 figlie

un’altra divisione, le 8 figlie un’ultima divisione, per cui si avrà un totale di 16 cellule.

Tuttavia tali divisioni sono tutte incomplete, cioè il processo di citodieresi (divisione vera e propria

delle 2 cellule) è incompleto, così che resta un ponte citoplasmatico di comunicazione tra le cellule

figlie.

Ne segue che dopo 4 cicli di divisioni, le 2 cellule della prima generazione avranno 4 ponti, la

seconda generazione 3, la terza 2 e l’ultima generazione solo un ponte.

In questa figura sono schematizzate le divisioni successive del progenitore, e in arancione sono

segnati i probabili oociti, che sono, infatti, le uniche cellule a possedere 4 ponti.

Di questi 2 oociti candidato, in ogni caso, solamente 1 diverrà l’oocita vero e proprio fecondabile.

Morfogenicità

Nell’oocita di Drosophila abbiamo analizzato un caso relativamente semplice, in cui il sistema non

subisce influenze esterne.

Invece, nello sviluppo di un organismo, sono molto più frequenti i casi in cui le cellule vengono

differenziate in base a interazioni induttive, cioè in base all’ambiente diverso, alle influenze esterne

cui sono esposte.

Un primo esempio è quello dell’inibizione laterale, per cui cellule adiacenti cominciano una gara

verso la differenziazione, per cui alcune cellule cominciano a specializzarsi e contemporaneamente

inviano segnali inibitori a quelle adiacenti, per evitare che prendano il loro stesso cammino. Per cui

alla fine la cellula che avrà specializzato più in fretta o avrà resistito all’inibizione sarà quella che

avrà differenziato.

La strategia più usata, però, è quella dell’interazione induttiva in cui cellule esterne mandano

segnali induttivi a cellule di un gruppo, per cui queste poi differenziano. Il segnale è solitamente

limitato sia nello spazio che nel tempo, così che solo le cellule più vicine alla sorgente del segnale

manifesteranno il carattere indotto e consiste ovviamente in un qualsiasi metodo di comunicazione

tra cellule, per cui può essere a corto o lungo raggio, mediato da molecole o dovuto a contatto

diretto.

In linea di principio qualsiasi molecole potrebbe essere utilizzata come induttore morfogenico, ma

nella pratica, nello sviluppo di tutti gli organismi sono utilizzate sempre le stesse, poche famiglie e

sistemi di induzione.

Le vie di segnalazione utilizzate sono: recettori tirosina chinasi, la superfamiglia TGF-beta, Wnt,

Hedgehog e Notch.

Le cellule competenti a rispondere al segnale costituiscono il gruppo di equivalenza o campo

morfogenetico.

Bisogna tener conto che queste cellule target sono caratterizzate solo dalla capacità di rispondere,

questo non esclude che possano essere già differenziate diversamente tra loro e quindi rispondere in

maniera diversa a uno stesso stimolo.

Questo perché mentre le proteine della cascata di segnalazione sono le stesse, gli effettori delle vie

di segnalazione, che sono per lo più le proteine regolanti la trascrizione, cambiano e sono diverse in

memoria di stimoli precedentemente avuti o in base a segnali che la cellula sta ricevendo in quel

momento.

Inoltre bisogna immaginare che intrinsecamente al fatto che le cellule sorgente diffondono il

segnale intorno la concentrazione di segnali induttivi sarà più alta alla fonte e più debole man mano

che ci si allontana.

Quindi la risposta potrebbe essere radicalmente diversa in base alla diversa concentrazione di

induttore cui la cellula è esposta.

In effetti la creazione di gradienti di morgogenicità è una strategia di induzione largamente

utilizzata nello sviluppo di un organismo, perché grazie l’organizzazione di risposte differenti in

funzione di concentrazioni differenti è possibile ottenere una larga varietà di effetti grazie a un solo

segnale.

A questo quadro bisogna affiancare all’esistenza di induttori anche quella di inibitori che modulano

la risposta. Per cui ad esempio si potrebbe ottenere un gradiente morfogenico con un morfogeno

distribuito uniformemente e un induttore distribuito a gradiente.

Fin’ora abbiamo parlato di induzioni a livello spaziale, ma ad essere precisi esistono metodi di

induzione basati anche sul tempo di stimolazione. Ad esempio i progenitori dei neuroni di corteccia

e di midollo di topo si dividono per 23 o 11 cicli cellulari a seconda che debbano diventare del

primo o del secondo tipo. Questo avviene sia in vivo (cioè in presenza di un ambiente che muta) sia

in vitro (quindi a condizioni costanti). Questo riflette l’esistenza di un programma interno alla

cellula che ne definisce il corso temporale del suo sviluppo.

Nel concetto di gradiente di morfogenicità è intrinseca un’idea di gradualità, di una miriade di

elementi intermedi compresi tra 2 estremi. In realtà nello sviluppo di un organismo si osservano

campi morfogenici molto netti, risposte tutto-o-niente. Il solo concetto di gradiente morfogenico

sembra non poter spiegare queste evidenze.

In realtà l’organismo utilizza un sistema di induzione sequenziale, in cui su uno stesso luogo

cellulare si trovano sovrapposti più gradienti sia spazialmente che temporalmente, come se a un

disegno inizialmente semplice, abbozzato, sono via via aggiunti sempre più particolari, livelli su

livelli, per cui alla fine si vede solo il quadro finale dettagliato.

Teoria dei segnali

In risposta a un segnale una cellula può avere una sola o una serie di risposte, e la varietà di queste

risposte è altissima, tuttavia è possibile classificarle in:

Cambiamento dell’espressione genica

Mitosi

Cambiamento nella morfologia e nelle proprietà adesive

Cambiamento dello stato fisiologico

Apoptosi

Tuttavia prima di raggiungere l’effetto ci sono parecchi passi da fare, rappresentati nello schema

seguente:

Nei capitoli precendenti abbiamo detto che le vie di segnalazione intracellulare, cioè le cascate di

segnalazione, fanno parte per lo più di queste famiglie:

Recettori tirosina chinasi

Superfamiglia TGF-beta

Wnt

Hedgehog

Notch

Le proteine bersaglio abbiamo già detto che variano in base allo stato differenziativo della cellula.

La maggiore varietà, quindi, si trova a livello del sistema recettore/ligando.

Quindi vale la pena soffermarci sui sistemi di segnalazione tra cellule.

Una prima classificazione può essere fatta sulla distanza d’azione:

Già sulla base di questa classificazione è possibile fare alcune riflessioni.

Considerando segnali di tipo autocrino, quella in cui una cellula secerne segnali per sé, se si riflette

a livello di una singola cellula, questa emana un segnale debole per sé stessa, ma se si riflette a

livello di più cellule, queste si stimolano a vicenda in un circuito che si autoalimenta.

Prendiamo ora in considerazione i 2 tipi di segnalazione a maggior distanza: endocrina e sinaptica.

Quella endocrina è più lenta, inoltre dato che il ligando diffonde per il torrente circolatorio, questo

passa a contatto con molte altre cellule, per cui per evitare stimolazioni illegittime il ligando deve

essere molto specifico per il target, così quest’ultime esprimono recettori ad alta affinità, così che il

ligando può circolare per questioni di sicurezza (riguardo le stimolazioni illegittime) anche a

bassissima concentrazione.

Quella sinaptica è molto più veloce, la specificità di segnalazione è data dall’assone, che contatta un

numero ristretto e molto ben definito di cellule, a differenza di quella endocrina che segnala a tutte

le cellule competenti dell’organismo. Grazie al sistema assone che rilascia il segnale in uno spazio

chiuso è possibile utilizzare ligandi e recettori a specificità più bassa, tuttavia a causa di questa

specificità minore bisogna utilizzare molecole di ligando in eccesso, che vengono poi ricaptate.

Per quanto riguarda le stimolazioni dipendenti da contatto intendiamo serie interazioni tra proteine

transmembrana di cellule diverse, i cui domini intracellulari vengono attivati in seguito a tale

interazione avviando la cascata di segnalazione.

Talvolta però l’interazione può essere ancora più intima, è questo il caso delle Gap Junctions in cui i

citoplasmi di cellule differenti sono in comunicazione diretta tra loro mediante proteine canale,

attraverso le quali si possono scambiare piccole molecole come cAMP e Ca2+, che sappiamo essere

essenziali nella trasduzione. Questo tipo di scambio è un’efficiente modo per “omogeneizzare” le

risposte metaboliche.

Le cellule follicolari, ad esempio, sono in contatto diretto tra loro e hanno protrusioni di membrana

che attraversano la zona pellucida e formano gap-junction con l’oocita, scambiando con esso

metaboliti.

Dopo questa panoramica sui vari sistemi di segnalazione, allarghiamo il nostro modello includendo

la possibilità di combinazioni di segnali.

Differenti ligandi stimolano differenti recettori, e la particolare combinazione di vie attivate può

dare origine a risposte differenti.

Alcuni segnali possono fungere da stimolatori, altri da inibitori di una stessa via.

Segnali diversi possono competere per stimolare lo stesso recettore.

La sequenza di stimolazione può influenzare risposte differenti.

Ricordiamo inoltre che a questa varietà “a monte” si aggiunge la varietà “a valle” di proteine

effettrici, mentre invece sono quasi identiche le proteine intermedie che si occupano della

trasduzione del segnale.

Phage display biopanning

Il Phage display biopanning è una tecnica mediante la quale è possibile identificare ligandi per

recettori e sapere per quale tipo cellulare sono specifici.

In questa metodica si utilizzano fagi ricombinanti, in cui le proteine strutturali del fago sono fuse

con proteine endogene cellulari, i ligandi di cui si vuole conoscere la specificità.

Ogni fago è rappresentativo di un ligando, in quanto strutturalmente è parte di esso, e perché al suo

interno porta la sequenza di cDNA da cui le proteine di fusione sono state espresse.

La miscela con tutti i fagi candidato viene fatta adsorbire su cellule (1), tutti i fagi non specifici non

avranno aderito alla membrana e quindi saranno eliminati decantando il sovranatante (2).

A questo punto i fagi adsorbiti vengono recuperati e fatti nuovamente adsorbire sul tipo cellulare

interessato (3). Con lo stesso principio di prima vengono eliminati i fagi non specifici per quel tipo

cellulare (4) e recuperati, invece, quelli che si sono adsorbiti (5).

Questo passaggio è effettuato varie volte (6) per ottenere una miscela di fagi molto ristretta, in cui

sono compresi solamente quelli veramente specifici per quel tipo cellulare.

Ottenuti i fagi, si procede al recupero e al sequenziamento dei cDNA in essi contenuti, così si potrà

risalire alle proteine di fusione che esprimevano e di conseguenza ai ligandi.

I ligandi trovati saranno, ovviamente, quelli specifici per il tipo cellulare su cui il test è stato

eseguito.

Cromatografia

Una volta identificati i ligandi e le cellule con le quali interagiscono, è ora necessario risalire alle

proteine che effettivamente captano il ligando.

In una colonna cromatografia vengono caricate delle sferette coatate col ligando di cui si vuole

individuare il recettore.

A questo punto viene fatto eluire l’estratto cellulare, in cui tra tutte le proteine presenti ci sarà anche

il recettore per il ligando sulle sferette.

Mentre tutto l’estratto eluirà via, i recettori specifici verranno trattenuti nella colonna perché

adsorbiranno sulle sferette.

A questo punto facendo fluire nella colonna un eccesso di ligando libero (cioè non coatato sulle

sferette) il recettore coatato interagirà preferibilmente con esso e quindi verrà recuperato nel volume

di eluizione.

Clonaggio di espressione

Si può sfruttare il clonaggio di espressione per identificare il gene codificante i recettori di un

particolare ligando.

Si può, infatti, far esprimere a cellule un pool di possibili recettori per il ligando interessato.

Queste cellule vengono stimolate con il ligando, se all’interno del pool con cui sono state trasfettate

è presente il gene per il recettore specifico, esse reagiranno allo stimolo.

A questo punto tale pool costituisce un insieme di geni candidato molto più ristretto, e su questo

base di questo si allestisce un altro test, e così via fino ad ottenere 1 solo gene, che sarà quello

codificante per il recettore specifico per il ligando studiato.

Organismi modello e interazione ligando-recettore

In Drosophila è possibile forzare una ricombinazione mitotica a livello di uno specifico locus, per

cui in seguito a una mitosi una cellula inizialmente eterozigote in quel punto produrrà una progenie

di cellule omozigoti. Spesso l’allele mutante è fatto in maniera da essere fuso con la GFP e quindi

risultare fluorescente e quindi facilmente rintracciabile.

Se tale procedimento è attivato a livello embrionale, si otterrà un embrione con isole di cellule

omozigoti per uno o l’altro allele.

L’epitelio dell’ala di Drosophila presenta una polarità planare, infatti i peli dell’ala sono tutti

orientati nello stesso senso.

Mutanti per il gene Frizzled presentano mancanza di tale orientamento, tale mutazione è recessiva,

per cui è un caso perfetto per applicare questa tecnica.

L’ala di questa Drosophila modello conterrà isole mutanti e isole normali. Se le isole mutanti

saranno caratterizzate in ogni caso dalla fluorescenza, se poi esprimeranno il fenotipo, ossia

l’assenza di polarità, vorrà dire che in tale caratteristica sono indipendenti dalle cellule circostanti,

autonome. Si dice appunto che l’effetto cellulare è autonomo, o non-autonomo.

In caso di un effetto cellulare autonomo è probabile che l’espressione del fenotipo mutante dipende

dalla singola cellula, e dato che l’unica differenza sta in quel gene ricombinante, vorrà dire che il

gene Frizzled è responsabile del fenotipo mutante.

Se il gene in questione, come si è scoperto poi essere Frizzled, codifica per un recettore, il

verificarsi di un effetto cellulare del tipo autonomo vuol dire che questo in seguito a mutazione non

capta più il ligando.

Classificazione dei ligandi

Classificazione sulla distanza d’azione:

autocrino

paracrino

endocrino

Classificazione sulle dimensioni

Molecole a basso PM

Peptidi

Proteine

Identificazione di ligandi e recettori

Classificazione dei recettori

Recettori ad attività enzimatica o legati ad enzimi (tirosina chinasi, serina/treonina chinasi,

fosfatasi)

Recettori a sette domini transmembrana (associati a proteine G, frizzled)

Recettori legati a canali ionici

Recettori a domini transmembrana multipli (ptc)

Recettori Notch

Proteine segnale come recettori (efrine)

Recettori serina/treonina chinasi della superfamiglia TGF-beta

Recettori Frizzled e Wnt

Wnt è il ligando di Frizzled.

Frizzled è strutturalmente simile ai recettori 7-TM, e talvolta è capace di operare come essi in

presenza di proteine G, ma in realtà trasduce il segnale a una proteina chiamata Dishevelled.

In assenza di Wnt, Frizzled è inattivo e di conseguenza anche Dishevelled.

Esiste poi il complesso assina-apc-GSK3beta che in questa condizione è attivo, e in particolare la

GSK-3 fosforila la beta-catenina.

La beta-catenina fosforilata è instabile viene ubiquitinata a e degradata. E comunque la stragrande

maggioranza si trova impegnata a fare da ponte tra le caderine e i filamenti di actina.

La beta-catenina in eccesso, se non fosse degradata, e se avesse saturato tutti i posti a livello dei

filamenti di actina, si legherebbe a un fattore trascrizionale, LEF-1 / TCF, che data la sua assenza è

complessato con la proteina Groucho inibendo la trascrizione.

I domini Frizzled extracitololici in collaborazione con LRP legano Wnt. I legame attiva i loro

domini citosolici che attivana Dishevelled. Questa proteina inibisce la GSK-3beta, che non fosforila

la beta-catenina. La beta-catenina, ora stabile, si accumula nel citosol, si trasferisce nel nucleo e

scalza Groucho. Viene reclutata la trascrittasi e si esprimono i geni rispondenti a Wnt (tra cui c-

myc).

La proteina APC nominata prima è proprio quella dell’adenomatosi poliposa del colon, che se

mutata altera proprio questo meccanismo inibendo costitutivamente la GSK-3. La beta-catenina si

accumula e viene trascritto c-myc che è l’oncogene più famoso di tutti.

Recettori Patched Smoothened e Hedgehog

Hedgehog è un ligando coinvolto in numerosi processi di sviluppo, nell’uomo ad esempio tramite

un gradiente morfogeno guida lo sviluppo delle dita della mano.

Tutte le risposte innescate da Hedgehog sono trasdotte all’interno della cellula da un recettore, anzi

una collaborazione tra 2 recettori: Patched e Smoothened.

Patched è un recettore ptc, in quanto attraversa la membrana 12 volte. Smoothened è una 7-TM

simile a Frizzled.

In assenza di Hg (hedgehog) Patched inibisce Smoothened e quindi non c’è cascata di segnale.

All’interno della cellula legati su microtubuli si trovano alcuni complessi di costal-soppressore di

fused-chinasi fused-Ci.

Ci è cubitus interruptus ed è l’unica proteina di cui si conosce il ruolo preciso in questa via di

segnalazione. Ci viene, in questo caso, ubiquitinata e degradata nei proteasomi. La degradazione

non è completa, e uno dei suoi prodotti si accumula e migra nel nucleo dove si complessa a un

corepressore e spegne i geni rispondenti a Hg.

In presenza di Hg, Smoothened inibisce la degradazione e fa rilasciare il complesso dai microtubuli.

Ci non viene processato e così com’è si accumula, migra e invece di complessarsi a un corepressore

si complessa a un coattivatore attivando la trascrizione.

Recettore Notch e Delta

Il sistema Notch/Delta è un esempio di inibizione laterale.

Sappiamo che dall’ectoderma originano cellule epiteliali e neuronali, e Notch è coinvolto nella

decisione della differenziazione nell’uno o nell’altro tipo.

In Drosophila le cellule precursore epiteliali proseguono lungo la loro strada di differenziazione, al

contempo mandano alle cellule circostanti segnali di inibizione della differenziazione. In questa

gara le cellule perdenti, cioè inibite, differenziano in neuroni invece che in epitelio.

Notch è considerato il recettore, e Delta il ligando, ma in realtà entrambe sono proteine

transmembrana. Entrambe queste proteine per funzionare necessitano di attivazione proteolitica.

Mentre il meccanismo di segnalazione di Delta nella futura cellula nervosa è poco conosciuto, si

conosce bene quello di Notch.

Notch subisce un primo taglio proteolitico nell’apparato di Golgi da parte della furina, ma tale

taglio è da considerare necessario solamente alla sua maturazione, che lo converte in un

eterodimero.

Una volta esposto in seguito al legame con Delta, subisce un taglio a livello della porzione

extracitosolica, immediatamente sopra la membrana cellulare. Segue poi rapidamente un altro taglio

nella porzione citosolica della proteina. In questo modo la parte trasmembrana resta nella membrana,

e la coda di Notch migra nel nucleo.

Nel nucleo Notch si complessa con il fattore trascrizionale CSL e questo costituisce il primo passo

per reclutare la trascrittasi e iniziale la trascrizione dei geni chiamati anch’essi CSL.

Efrine

Le efrine fanno parte dei recettori tirosina chinasi, dei quali sono il tipo più numeroso. I recettori

Eph, nella porzione esoplasmica hanno 2 domini simili alla fibronectina III, un dominio ricco di

Cys e un dominio globulinico, nella porzione citoplasmatica hanno dominio a attività tirosino-

chinasica.

Le Eph sono al tempo stesso ligandi e recettori, operano cioè una segnalazione bidirezionale. Tale

tipo di segnalazione può attivare le 2 cellule in sensi completamente diversi.

Questo tipo di recettori sono sfruttati nel cervello dai neuroni per riconoscersi fra loro ed evitare di

confondersi tra zone diverse.

Recettori serina-treonina chinasi della famiglia TGF-beta e Smad

I ligandi della superfamiglia TGF-beta operano come ormoni o mediatori locali per un grandissimo

numero di funzioni biologiche. Nello sviluppo di organismi il TGF è sfruttato per formare schemi e

influenzare comportamenti cellulari di proliferazione, differenziamento, produzione di matrice e

morte.

I recettori per il TGF sono tutte proteine transmembrana ad 1 solo passaggio con attività enzimatica

serino-treonino-chinasi nella parte citosolica. Sono di 2 tipi e agiscono solo in cooperazione, sono

entrambi necessari alla segnalazione.

Il recettore di tipo II è il primo a legare TGF-beta e in seguito a ciò attiva il suo dominio catalitico.

Il recettore di tipo I normalmente è complessato con una proteina inibitrice, quando si lega

anch’esso a TGF, viene fosforilato dal recettore di tipo 2, la proteina di inibizione si dissocia e

inizia la cascata di trasduzione reclutando e fosforilando Smad 2 o 3.

Le proteine Smad quando fosforilate si aprono mostrando una superficie di dimerizzazione. Smad 2

o 3 si associano con Smad 4 e l’oligomero formato recluta proteine regolatrici e fattori di

trascrizione.

Come si vede questa via è molto più immediata e diretta di tutte le altre cascate di trasduzione.

Alcuni membri della famiglia TGF-beta creano gradienti morfogeni. La risposta specifica delle

cellule dipende dalle diverse Smad nel citoplasma e dalla loro concentrazione. Poi data la diversa

affinità dei siti di legame al DNA per le Smad, a differenti concentrazioni di Smad

corrisponderanno diversi geni trascritti.

Esistono poi Smad inibitrici che si legano al recettore di tipo I e ne coprono il sito catalitico

impedendo alle altre Smad di essere fosforilate. Queste sono codificate dai geni bersaglio attivati

per cui il meccanismo funziona a feedback negativo.

Recettori intracellulari

Ne esistono di 2 tipi

Recettori presenti nel nucleo e nel citoplasma che legano il DNA in seguito a interazione con il

ligando.

Recettori nucleari sempre legati al DNA come corepressori, ma quando interagiscono col ligando

diventano attivatori (per esempio nel caso delle vitamine A e D).

I recettori intracellulari sono possibili in quanto captano ligandi diffusibili, come gli ormoni

stereoidei, che attraversano la membrana senza problemi.

I complessi ormone-recettore sono essi stessi capaci di reclutare i fattori e il macchinario di

trascrizione. I geni trascritti sono chiamati geni della risposta primaria.

Tra le proteine codificate da questi geni possono essercene alcune regolatorie che spengono o

accendono altri geni chiamati della risposta secondaria.

Esempi sulla regolazione dell’interazione recettore-ligando

Specificità, intensità, frequenza e durata sono tutti fattori influenzanti il meccanismo di trasduzione.

Differenti intensità di segnalazione possono essere interpretate in maniera diversa dalla cellula.

L’EGF e l’NGF stimolano entrambi la via di segnalazione delle MAPK.

La segnalazione di EGF nel tempo forma uno spike, mentre quella di NGF si alza fino a

raggiungere un plateau e resta stabile. Questa differenza causa 2 risposte diverse: nel caso dell’EGF

la cellula prolifera, nel caso dell’NGF differenzia.

Proprietà intrinseche del ligando come l’emività, l’affinità, la concentrazione, interazione con altre

proteine e formazione di multicomplessi recettoriali, modifiche posttraduzionali di ligandi e

recettori sono altri fattori influenzanti.

La zona spaziale in cui avviene l’interazione può essere delimitata da attivazione o in attivazione

del ligando mediante taglio proteolitico come nell’interazione Toll/Spatole in Drosophila.

Il ligando o il recettore possono essere down o upregolati tramite la conservazione in compartimenti.

E’ questo il caso dell’insulina. Quando una cellula è stimolata con insulina questa deve aumentare

l’introduzione di glucosio, che passa la membrana grazie a un trasportatore del glucosio. Queste

cellule conservano pool di trasportatori in vescicole interne. Quando la cellula è stimolata con

insulina, viene promossa la fusione di tali vescicole con la membrana cellulare. Il risultato è la

upregolazione dei trasportatori e quindi una maggiore quantità di glucosio entrante.

Il recettore può anche essere sequestrato dalla membrana per impedire alla cellula di captare il

ligando, questo può avvenire tramite endocitosi nel caso di recettori trasmembrana o con lo

spostamento del recettore tra nucleo e citoplasma in caso di proteine di segnalazione intracellulari

(beta-catenina e Ci).

L’endocitosi mediata da recettore, quindi, è il processo attraverso il quale la cellula monitora il

numero di recettori presenti sulla membrana plasmatica.

La porzione intracellulare dei recettori può associarsi alla Clatrina che è una proteina capace di

assemblarsi in omopolimeri. In particolare, per la forma tipica di questa proteina, le clatrine

finiscono per formare una sfera. Poiché ogni molecola è associata con una proteina trasmembrana,

provocheranno una invaginazione della membrana, fino a formare una vescicola mediante l’aiuto

della dinamina.

Le varie vescicole si fondono insieme in endosomi precoci di smistamento. Poi questi possono

subire diversi destini: ad esempio convertirsi in endosomi tardivi e poi lisosomi in cui i recettori

compresi nella membrana vengono degradati, oppure convertirsi in endosomi precoci di riciclo in

cui i recettori vengono recuperati e riesposti sulla membrana.

Data questa via di endocitosi, che non è l’unica, si può immaginare che il recettore possa

teoricamente segnalare anche a livello endosomiale oltre che quando si trova sulla membrana

cellulare vera e propria.

Prima abbiamo descritto il pathway di traduzione dei recettori TGF-beta. L’attività del recettore

dipende da una proteina chiamata SARA (Smad anchor for receptor activation), senza la quale non

può esserci signaling.

Questa proteina possiede un dominio FYVE finger, che si è visto essere essenziale nella

localizzazione cellulare della proteina. Tale dominio rende affine SARA solo per gli endosomi

precoci, dimostrando che il signaling di TGF-beta inizia a livello di tali organelli e non sulla

membrana plasmatica.

Infatti se si colorano sezioni istologiche mettendo in evidenza SARA e l’antigene EEA specifico per

gli endosomi precoci, è possibile notare che il pattern di fluorescenza di entrambe le proteine è

identico, completamente sovrapponibile.

Disfunzioni nella regolazione degli endosomi come quelle causate dal dominante negativo rab5,

causano una ridistribuzione di SARA in maniera diffusa in tutto il citoplasma, piuttosto che in foci.

Saggi per il legame ai lipidi dimostrano che il dominio FYVE interagisce con il fosfaditil-inositolo-

3P. Se si somministra un inibitore delle PI3 chinasi, si causa ancora una volta la ridistribuzione di

SARA da foci sugli endosomi a dispersione nel citosol. Inoltre crolla la risposta cellulare al TGF.

Quindi il dominio FYVE è sufficiente e necessario per la localizzazione di SARA a livello degli

endosomi precoci, mediante l’interazione con PI3. Tale localizzazione è probabilmente richiesta per

un’efficiente signaling.

Un altro studio riguardo all’EGF evidenzia, invece, che il recettore è capace di tradurre per 2

pathway differenti a seconda se, al momento della segnalazione, si trovi a livello della membrana o

su un endosoma. Inoltre un corretto traffico endosomiale è necessario per l’upregolazione di molte

proteine del pathway.

Tuttavia l’assenza di endosomi provoca una maggiore risposta più efficiente della cellula stimolata,

questo probabilmente in conseguenza del fatto che il sequestro del recettore per EGF in endosomi è

essenziale per modulare la risposta ed evitare iperstimolazioni.

Oltre all’endocitosi via clatrina esistono altre vie endocitiche come le caveole, piccole invaginazioni

di 50-100 nm che possono fondersi in caveosomi.

I recettori per il TGF-beta possono seguire 2 distinte vie endocitiche, una specifica per il signaling

che abbiamo visto essere quella degli endosomi e una per il turnover che li immagazzina in

caveosomi.

Infatti se si blocca via degli endosomi, l’attivazione cellulare crolla, mentre se si blocca quella dei

caveosomi il recettore non viene down-regolato in seguito a stimolazione.

Esiste un equilibrio tra le 2 vie e se si inibisce una, il TGF-beta-rec entra maggiormente nell’altra e

viceversa.

Network di segnalazione

Abbiamo fin’ora parlato dei singoli casi e solamente accennato all’esistenza di una rete, un network

di segnalazione in cui i ligandi, i recettori, le proteine di segnalazione hanno un ruolo nel proprio

pathway, ma interagiscono anche con altri.

Ecco i concetti da tener presente:

Ogni segnale può attivare uno schieramento complesso di risposte

Ogni cellula riceve più segnali

Le vie di segnalazione sono interconnesse internamente alla cellula

L’inteconnessione può essere a livello della membrana, della cascata o del nucleo

E’ proprio il concetto di interconnessione a essere alla base del network, in gergo esso è chiamato

“crosstalk”.

Si tratta di un vero e proprio sistema, in cui i vari moduli, cioè le varie vie di segnalazione, sono in

realtà così strettamente legate e interdipendenti tra loro, che studiarle “singolarmente” è quasi una

forzatura.

Dobbiamo immaginare le vie di pathway come in una enorme rete, in cui i nodi sono le proteine di

segnalazione e i fili, le connessioni tra queste proteine.

I pathway studiati sono semplicemente una via preferenziale lungo i fili della rete, ma scendere

lungo una strada o un’altra è lo stesso, la scelta di proseguire verso quel particolare “nodo” dipende

solamente dalla concentrazione e dalla disponibilità delle proteine di quel nodo.

Network di membrana

E’ possibile che per innescare una stessa via di segnalazione sia necessaria l’attivazione

contemporanea di più recettori, come EGFR e FGFR i cui recettori attivano entrambi Grb che inizia

la cascata.

Network intracellulare

L’attività catalitica di una proteina può avere ad oggetto più substrati appartenenti a diversi pathway

cellulari.

Le attività di proteine di pathway diversi possono confluire su una singola proteina.

Esistono circuiti di amplificazione in cui una proteina attivata è capace di attivare altre proteine a lei

identiche amplificando, appunto, il segnale.

Network nucleare

I geni per essere trascritti hanno bisogno della presenza di fattori di trascrizione. Questi sono già

presenti nella cellula sotto forma inattiva e la loro attivazione è solo il “penultimo” step del

signlaling.

Un gene può aver bisogno della presenza di fattori di trascrizione attivati da pathway differenti,

come il gene even skipped di drosophila.

Quindi più vie di segnalazione possono confluire sulla regolazione di uno stesso gene, questo

accade per esempio con Groucho che è capace di switchare tar le vie di segnalazione di EGF e

Notch.

Nell’ala di Drosophila sono presenti alcune venature. La formazione delle venature è indotta

dall’EGF, mentre invece Notch fa sviluppare le altre parti dell’ala. Nelle cellule in cui è attivo il

pathway dell’EGF non deve essere attivo quello di Notch e viceversa.

Nel caso di overespressione di Groucho non-fosforilato l’ala si sviluppa con le venature appena

accennate e molto disordinate.

Nel caso di overespressione di Groucho fosforilato l’ala presenta delle venature molto marcate e

spesse.

Infatti lo stato di fosforilazione di Groucho è proprio la “manopola” dell’interruttore, che accende

certi geni e ne spegne altri e viceversa.

Network post-attivazione

Ok, ora siamo arrivati dal segnale extracellulare all’attivazione della trascrizione. Ma tutti gli step

successivi, che portano all’espressione della proteina effettrice, sono altrettanto regolati e integrati

in un network. Questo è uno schema dei principali punti di controllo dell’espressione, tutti

contemporaneamente presenti.

Destino e memoria cellulare

Dopo questa lunga introduzione sui pathway di segnalazione, passiamo all’effettivo utilizzo di

questi. A cosa serve attivare geni in una cellula?

Serve per darle un destino. Cioè per farla specializzare, darle un compito preciso, diventare “tipica”

in quel tessuto, e quei tessuti in quell’organo e quegli organi in un apparato, e quegli apparati in un

organismo.

E una volta affidatole un destino, la cellula committed dovrà creare una progenie specializzata in

quel programma cellulare. Quindi la progenie dovrà ricordare il proprio destino, il proprio ruolo

all’interno dell’organismo.

Affidamento del destino

Abbiamo appena detto che sono i pathway a determinare il destino. I pathway sono attivati dai

ligandi, e la presenza di questo o quel ligando dipende solo dal campo morfogenico, o

microambiente in cui si trova la cellula target.

Il campo di morfogenicità, abbiamo già detto, non cambia nettamente tra una zona e l’altra, tuttavia

con stratagemmi, campi sovrapposti è possibile ottenere campi molto distinti tra loro.

Tuttavia almeno nei primi stadi dello sviluppo embrionale la divisione dei destini non dovrebbe

essere così netta, secondo questa ipotesi, e infatti non è possibile dire con sicurezza se le cellule

della blastula diverranno ecto-meso-endoderma, piuttosto c’è una preferenza per uno dei 3 tipi di

foglietti.

Il committement non sempre è collegato a un fenotipo particolare.

E’ facile immaginare che l’affidamento di un destino sia precedente alla manifestazione di un

fenotipo, per il tempo fisico che deve intercorrere tra l’attivazione del pathway e l’attività delle

proteine effettrici.

Ma possono esistere anche cellule fortemente specializzate, ma senza destino, in tal caso sono dette

“impegnate”.

Il destino una volta affidato può essere o no reversibile. Quando è irreversibile la cellula si dice

determinata e non sarà più capace di rispondere adattivamente al campo morfogenico in cui si trova.

Per riconoscere se una cellula sia determinata o no, basta trapiantare un blocchetto di cellule da un

embrione a un altro, ma in una zona differente.

Se non si avrà nessun fenotipo alterato, probabilmente le cellule avranno risposto al microambiente

in cui sono state trapiantate e avranno acquisito lo stesso destino di quelle del campo morfogenico

in cui sono state trapiantate.

Se si avrà un’alterazione questo sarà dovuto, probabilmente, al fatto che le cellule avevano un

destino già determinato.

Un altro fenomeno importante è l’induzione per cui una cellula o una popolazione di cellule guida il

programma di espressione genica in altre cellule, mediante contatto o ligandi solubili.

Negli embrioni di Xenopus (e non solo) il polo animale differenzia in ectoderma, quello vegetale in

endoderma, le cellule a metà strada in mesoderma. Infatti se si isolano le cellule dei 2 poli questa

ipotesi è confermata. Ma se si isolano e si mettono a contatto, alcune cellule del polo animale a

contatto con quelle del polo vegetale finiscono per differenziarsi in mesoderma.

Una volta ricevuto il destino la cellula deve ricordarlo, non solo, dovrà ricordarlo anche la sua

progenie.

Questo è possibile grazie all’instaurazione di feedback positivi, per cui innescata l’attivazione di

certe proteine la loro espressione resta permanente, poiché queste, magari, attivano esse stesse i

pathway che portano alla propria traduzione.

Altri metodi possono essere modificazioni epigenetiche, come la regolazione del compattamento

della cromatina, la metilazione per silenziare geni, l’imprinting.

In ogni caso la cellula avrà stratagemmi per mantenere attive le proteine effettrici che la

differenziano. Trasmettere questa memoria alla progenie sarà molto semplice poiché se la divisione

è simmetrica le 2 cellule figlie erediteranno un citoplasma simile. In questo saranno presenti in

egual misura proprio quelle proteine che provvederanno a mantenere la specializzazione.

Effetto materno

Le cellule non hanno organi sensoriali, non sono a loro volta organismi, quindi non percepiscono

l’ambiente esterno, l’unico modo di conoscere quello che hanno intorno e attraverso la membrana

cellulare, ma comunque questo metodo è confinato a interazioni cellula-cellula.

Nonostante ciò, c’è bisogno, nello sviluppo, di mantenere la percezione di un quadro generale, di

fare in modo che le cellule anteriori restino anteriori, quelle posteriori posterino, ecc.

Il mantenimento di tale percezione è garantito dai meccanismi di memoria cellulare, ma deve

esserci un momento iniziale in cui, ad esempio, tali assi di simmetria (antero-posteriore e dorso-

ventrale) sono stabiliti.

Poiché, abbiamo detto, le cellule non hanno percezione di sé stesse nello spazio, ne risulta che in un

embrione tutte le cellule sono uguali alle altre. Quindi tutti gli eventi asimmetrici, che sono poi

quelli che determinano il destino differente delle cellule, devono avere un’origine esterna

all’embrione, da un ambiente già differenziato che crei un campo morfogenico all’interno

dell’embrione, almeno per avviare le prime asimmetrie che poi porteranno all’enorme varietà di tipi

cellulari nell’organismo finale.

La causa di questi primi eventi è da ricercare nella madre. Esistono infatti dei cosiddetti geni ad

effetto materno, che sono espressi dalla madre, per esempio dalle cellule nurse per causare effetti

necessari allo sviluppo nell’embrione.

Per esempio la proteina Bicoid in drosophila crea un gradiente morfogenico nell’embrione

instaurando l’asse anteroposteriore.

Le cellule nurse dell’embrione sono già polarizzate in quanto sono materne. Queste a un polo

producono il messaggero di Bicoid, e poiché sono in comunicazione diretta con l’embrione grazie a

ponti cellulari, il messaggero diffonde all’interno dello zigote. Ovviamente si crea un gradiente

perché la sorgente si trova a uno solo dei poli della cellula e in base a questo viene organizzato

l’asse antero-posteriore dell’insetto.

Quindi, bisogna tener presente che una parte fondamentale dello sviluppo dell’embrione è nelle

mani della madre. Infatti Bicoid nell’embrione può anche essere non funzionante, la drosophila non

solo nascerà, ma sarà normalissima. Tuttavia non potrà avere prole, perché in nessuno dei suoi

embrioni si riuscirà ad instaurare un asse anteroposteriore, e tale mancanza è letale nello sviluppo.

CAENORHABDITIS ELEGANS

E’ un piccolo verme nematode, di quasi un migliaio di cellule. Si conosce l’origine di ciascuna di

queste, cioè tutto il loro percorso a ritroso fino allo zigote, cioè se ne conosce la “mappatura del

destino cellulare”. Però data la semplicità del suo organismo non sono possibili studi di

organogenesi.

Il suo sviluppo dura circa 3 giorni suddivisi in embriogenesi, 4 stadi larvali e mute. Vive circa 3

settimane.

Assi di simmetria e gastrulazione

Lo zigote comincia con una divisione asimmetrica dell’uovo che riflette l’asse anteroposteriore

dell’embrione e la creazione della cellula che sarà poi fondatrice della linea germinale.

La maggior parte delle cellule si differenzia in uno stadio tardivo dello sviluppo, fatta eccezione per

intestino e gonadi.

Ci sono 6 geni ad effetto materno, organizzatori del citoscheletro, e quindi degli assi di simmetria

dell’embrione.

Schemi progressivamente più complessi vengono creati da interazioni cellula-cellula.

Per esempio nello stadio a 4 cellule, ci sono 3 tipi cellulari distinti: P2 che è la cellula posteriore, le

cellule ABa e ABp che sono identiche, e la cellula EMS.

P2 segnala alla cellula ABp tramite Delta, facendola

specializzare. E instaurando l’asse dorso-ventrale. ABa in quanto

identica potrebbe rispondere anch’essa, ma di fatto non può

perché non è in contatto diretto con P2. La scelta di un metodo di

segnalazione tramite contatto e non tramite ligando solubile

infatti non è casuale, poiché a questo stadio l’embrione è così

piccolo che una molecola solubile diffonderebbe ovunque,

segnalando a tutte le cellule competenti.

P2 inoltre segnala tramite Wnt, una molecola solubile, alla

cellula EMS, creando un gradiente morfogenico per cui questa

organizza il proprio fuso mitotico e origina 2 cellule che avranno

un destino differente: una genererà l’endoderma e l’altra il

mesoderma.

Più avanti nello sviluppo la progenie di ABa e di ABp si

troveranno di nuovo a essere stimolate, entrambe dal signaling di

Notch, da una cellula della progenie EMS.

Stavolta a rispondere saranno le cellule ABa che differenzieranno

in faringe mentre quelle ABp non seguiranno questo destino

nonostante vengano stimolate.

Si può dedurre quindi che le cellule cambiano nel tempo la loro

capacità di rispondere a uno stesso segnale, non solo, lo stesso

segnale produce risposte differenti a seconda che segnali ai progenitori o alla progenie. Questo

perché le cellule target mantengono una memoria, una impronta di tutti i cambiamenti passati.

Quindi pochi tipi di sistemi di segnalazione (i soliti 6) sono utilizzati ripetutamente in tutte le fasi

dello sviluppo causando effetti sempre diversi.

Schemi di divisione cellulare e differenziazione

E’ possibile riconoscere in C. Elegans, schemi di divisione cellulare, per cui da una cellula di arriva

per divisioni a una progenie. Tali schemi sono tipici di alcuni stadi di sviluppo, larva di 1°, 2° stadio,

adulto, ecc.

Esistono però mutanti in cui cellule larvali si comportano secondo schemi di divisione adulti e

viceversa. Come se esistesse un tipo di comportamento cellulare giovanile e uno adulto.

Mutazioni in questo tipo di comportamento vengono imputate a geni chiamati eterocronici.

Tali geni, si è visto, innescano cascate regolatrici agendo in serie. Quelli in cima alle cascate

regolatorie sono in particolare 2 miRNA: lin-4 e let-7, che tramite il fenomeno della iRNA

modificano l’espressione di altri geni. Livelli crescenti di lin-4 fanno evolvere la larva dal primo al

terzo stadio. Livelli crescenti di let-7 accompagnano lo sviluppo della larva tardiva all’adulto.

Geni simili sono stati riscontrati in tutti gli organismi, compreso l’uomo.

Proprio questo fenomeno, l’interferenza a RNA, è stata scoperta nei C. elegans ed è effettuata

mediante 3 metodi: microiniezione di dsRNA, nutrire i vermi con batteri che producono il dsRNA,

immersione in soluzioni di dsRNA.

Data l’esistenza di questi schemi di divisione e poiché i passaggi di specializzazione devono essere

coordinati con le divisioni, si è suggerito spesse volte che il ciclo cellulare possa servire da

segnatempo per gli stadi di differenziazione, implicando che una certa parte delle informazioni

necessarie a passare da uno stadio all’altro sia contenuta o legata agli eventi del ciclo cellulare.

Tuttavia esistono numerose prove che tale ipotesi è sbagliata.

Infatti la differenziazione cellulare continua anche quando la divisione cellulare è inibita

artificialmente. Man mano che si procede si hanno anomalie, è vero, ma questo è dovuto

probabilmente al fatto che una cellula singola non può differenziare contemporaneamente in 2 tipi

diversi.

Quindi la specializzazione cellulare non è legata ai cicli di divisione cellulare, anzi, una cellula può

differenziare anche in assenza di segnali, ma per le semplici catene di eventi innescate

dall’espressione di certi geni: sono i meccanismi interni alla cellula, insieme ai segnali passati e

presenti ricevuti, che dettano una specifica sequenza di cambiamenti biochimici ma anche i tempi

delle sue divisioni cellulari. Essa è solo parzialmente dipendente dalle stimolazioni esterne e quindi

è capace di operare cambiamenti e differenziarsi in autonomia da tali segnali.

Apoptosi e sviluppo

L’apoptosi è parte integrante del progetto di un organismo. Dei 1030 nuclei somatici generati dalle

divisioni dell’embrione di C. Elegans, 131 di questi muoiono. E la loro morte è essenziale per

sviluppare un individuo wild-type.

In questo organismo modello è facile rintracciare le cellule morte per apoptosi, poiché se ne

conosce la mappa del destino, negli altri organismi tali morti passano inosservate, perché i corpi

apoptotici sono velocemente assorbiti dalle cellule circostanti.

Mutanti per l’apoptosi hanno permesso di identificare dei geni chiamati ced (cell death abnormal)

che sono necessari per la morte delle 131 cellule normali.

In casi di inattivazione di questi geni, le 131 cellule differenziano in neuroni, che in C Elegans però

danno solo iperplasia e non sono letali. Fenomeni del genere sono riconoscibili nello sviluppo di

tutti gli organismi compreso l’uomo. Si sa bene che il numero di neuroni iniziale nel feto è molto

più alto di quello di un neonato, questo perché durante lo sviluppo un enorme numero di neuroni è

eliminato con questo sistema.

Si è poi visto che i geni ced codificano per omologhi delle caspasi, Apaf-1, Bcl-2 e Bad.

In particolare si è visto che l’apoptosi dipende dall’attività di ced-3 e ced-4 e dal silenziamento di

ced-9. Infatti ced-3 e 4 sono rispettivamente una caspasi e apaf-1 mentre ced-9 è Bcl-2.

DROSOPHILA MELANOGASTER

E’ un insetto dell’ordine Diptera, facile da allevare, con un ciclo riproduttivo molto rapido.

E’ un organismo di circa 100000 cellule e ha solo 14000 geni, meno del C. Elegans. I geni sono

conservati, hanno poca ridondanza, e c’è un enorme patrimonio di mutazioni identificate già in

genetica classica.

Lo sviluppo embrionale dura 1 giorno. La larva ha 3 stadi separati da mute, dopo 5 giorni si forma

la pupa. Questa affronta la metamorfosi e diventa un individuo adulto.

Embrione di Drosophila

Abbiamo già descritto precedentemente la scelta dell’oocita.

Questo è il follicolo come si presenta prima della fecondazione.

Dopo la fecondazione l’uovo fecondato comincia una serie di 9 mitosi rapidissime senza citodieresi.

Quindi si trovano molti nuclei in un sincizio, questa struttura è chiamata blastoderma sinciziale.

Dopo altri 4 cicli cellulari i nuclei migrano verso la periferia e la membrana cellulare si invagina tra

essi convertendo il blastoderma sinciziale in un blastoderma cellulare. Le cellule polari daranno

luogo alla linea germinale.

Come si può vedere anche qui la prima decisione presa nello sviluppo embrionale è dividere il pool

di cellule in 2: quelle somatiche e quelle germinali.

Morfologicamente l’embrione di drosophila è divisivile in segmenti ben distinti, che poi

nell’individuo adulto corrisponderanno effettivamente a zone morfologicamente diverse procedendo

dalla testa verso la coda. Per esempio un segmento corrisponderà alla zona del torace, una serie di

altri all’addome, ecc

Si è visto che tali segmenti hanno una

corrispondenza genetica. Cioè tali segmenti

corrispondono a fasce di espressione di

particolari geni. La corrispondenza non è

proprio segmento-gene, ma è possibile

riconoscere dei parasegmenti, che si trovano a

cavallo della linea di demarcazione di 2

segmenti.

Abbiamo quindi 3 livelli di organizzazione

nell’embrione di drosophila. Una polarità

antero-posteriore e una dorso-ventrale come in

C. Elegans e in più questa divisione del corpo

in segmenti lungo l’asse antero-posteriore.

Polarità dell’uovo

Abbiamo visto in C. Elegans come sia necessario che la polarità sia instaurata dalla madre.

Drosophila non fa eccezione infatti i geni della polarità dell’uovo sono ad effetto materno.

Le cellule del follicolo (follicolo non nurse!) sono in contatto diretto con l’uovo (lo sono anche le

nurse, ma qui il compito lo svolgono quelle del follicolo).

Come si vede dallo schema, c’è un gruppo di cellule che forniscono un segnale terminale, per creare

l’asse antero-posteriore e un altro gruppo che fornisce un segnale ventrale per l’asse dorso-ventrale.

Queste cellule del follicolo durante la formazione del blastoderma sinciziale pompano all’interno

mRNA codificante per alcune proteine. Poiché le sorgenti sono localizzate si formeranno gradienti

di concentrazione di tali mRNA. Quando si forma il blastoderma cellulare, le cellule formatesi

avranno ognuna una quantità di mRNA tipica della zona in cui si trovano e saranno questi mRNA a

comunicare alla cellula in che zona dell’embrione si trova, cioè se fa parte della testa, della coda,

del ventre o del dorso.

In particolare si hanno quattro geni coinvolti.

Bicoid ha una concentrazione più alta nelle zone che diventeranno la testa e più bassa verso la coda,

quindi fa parte del sistema anteriore.

Nanos al contrario è maggiormente localizzato alla coda, sistema posteriore.

Torso è un recettore transmembrana localizzato alle regioni terminali dell’embrione, cioè in testa e

coda, ma non al centro del corpo.

Toll è un altro recettore transmembrana che si trova su tutta la zona che sarà il ventre della larva.

E’ evidente che Bicoid e Nanos si occupano della determinazione dell’asse antero-posteriore e della

differenza tra cellule somatiche e germinali.

Torso e Toll determinano le strutture terminali e la distinzione tra mesoderma e ectoderma.

Asse dorso-ventrale

Il risultato di toll è che la proteina Dorsal e il suo mRNA si spostano dal citoplasma in cui si

trovano nel nucleo. Poiché ci troviamo in un “livello precoce” di progettazione, noteremo che man

mano che si va verso il ventre la localizzazione della proteina Dorsal cambia, aumentando sempre

di più la sua quantità nel nucleo.

Il ligando di Toll è Spatzle. Come abbiamo detto Spatzle è attivato da taglio proteolitico, infatti in

una particolare zona della membrana vitellina e solo lì viene innescata la cascata proteolitica capace

di attivarlo.

Spatzle attivo lega Toll che trasduce il segnale. Il risultato di questo pathway è la traslocazione di

Dorsal nel nucleo.

Più saranno i recettori Toll stimolati,

maggiore sarà la quantità di Dorsal nel

nucleo.

Si creerà quindi un gradiente

morfogenico riguardo la localizzazione

di Dorsal.

La particolarità inizia proprio ora. Infatti

a seconda della differente

concentrazione di Dorsal, verranno

attivati particolari geni.

Concentrazione di Dorsal:

Nulla -> Zerknullt -> Produzione

DPP

Bassa -> Short Gastrulation ->

Produz Sog / Inibiz DPP

Media -> Rhomboid

Alta -> Twist e Snail

In realtà non si creano 4 fasce precise,

ma altrettanti gradienti.

DPP e Sog sono ligandi solubili ed entro

la membrana vitellina formano un altro

gradiente dorsale morfogeno, che

innesca altre modificazioni che portano alla distinzione tra tessuto extraembrionale, epidermide

dorsale e ectoderma neurogenico.

Snail invece dove è ad alta concentrazione attiva Single-Minded, dove è a bassa concentrazione lo

inibisce.

La zona di Twist sarà quella che diventerà l’endoderma e si invaginerà con la gastrulazione.

L’asse dorso-ventrale dell’insetto corrisponde all’asse ventro-dorsale dei vertebrati, che risulta

invertito. Mentre gli insetti hanno il sistema circolatorio sul dorso e quello nervoso sul ventre, i

vertebrati sono al contrario.

Segmentazione

Esistono 3 tipi di geni coinvolti nella segmentazione:

Geni gap: organizzano ampie regione lungo l’asse anteroposteriore

Geni della regola della coppia: sviluppo di segmenti alternati del corpo

Geni della polarità segmentale: orientamento antero-posteriore dei segmenti

Possiamo capire meglio la loro funzione vedendo cosa succede quando sono mutati.

Knuppel è un gene gap, quando mancano

questi geni nell’embrione manca tutta la

zona in cui essi sono espressi. Knuppel si

esprime in tutto il corpo tranne le parti

terminali, l’embrione senza Knuppel è

formato solo dalle parti terminali.

Even-skipped è un gene della regola della

coppia, si esprime solo nei segmenti con

numero pari, e infatti con questo si intende

sviluppo di segmenti alternati. Un embrione

senza even-skipped è formato solo da

segmenti pari.

Gooseberry è un gene della polarità segmentale. Quando questi geni sono assenti la polarità

anteroposteriore viene persa, e infatti l’embrione senza gooseberry presenta tutti i segmenti, ma

questi presi singolarmente hanno una simmetria interna, non è possibile distinguere la testa dalla

coda di un segmento.

L’induzione di tali geni è sequenziale, che riflette il loro ordine gerarchico.

I primi ad essere espressi sono i geni gap, che determinano a grandi linee quali sono le zone del

corpo. Poi vengono espressi i geni della regola della coppia che definiscono precisamente tutti i

segmenti. Infine intervengono i geni della polarità segmentale che agiscono all’interno di ogni

segmento.

Tutte e 3 le classi di geni inducono poi i geni selettori omeotici o geni orchestranti che fanno

sviluppare particolari strutture in un determinato segmento, per esempio le antenne, le zampe, le ali,

ecc.

Geni della regola della coppia

Questi si esprimono solo nei segmenti pari o solo in quelli dispari. Il gene even-skipped si esprime

solo in quelli pari, fushi tarazu solo in quelli dispari.

Prendiamo ad esempio il gene even-skipped.

Il suo promotore è possibile suddividerlo in moduli, uno per ogni segmento pari. Per modulo qui si

intende una parte del promotore in cui sono presenti siti di legame per fattori di trascrizione tipici di

quel segmento.

Per esempio il modulo per il segmento 2 possiede 5 siti di legame per Bicoid, 3 siti per Giant, 3 per

Kruppel, e 1 per Hunchback. Alcuni di questi competono tra loro. I siti che competono tra loro sono

ad esempio tra Bicoid e Kruppel o Bicoid e Giant. Questa opposizione non è casuale infatti nel

secondo segmento, di questi 3, solo Bicoid deve essere espresso e la sua presenza insieme a quella

di altri fattori innesca la trascrizione di even-skipped. Negli altri segmenti lo è anche uno degli altri

2 geni (Kruppel o Giant), pertanto si legano sul DNA e creano una combinazione diversa di fattori

per cui alla fine il gene ha una bassa probabilità o nulla di essere trascritto.

Come si può vedere i gradienti morfogeni, i vari livelli sovrapposti

di geni della polarità dell’uovo e geni gap seppure singolarmente

“sfumati” collaborano tra loro a definire in maniera netta e precisa

il secondo segmento.

A livello molecolare bisogna ragionare con le concentrazioni dei

fattori di trascrizione, infatti l’affinità di tali fattori e la sequenza

dei siti di legame è tale che solamente in specifiche condizioni si

attiva la trascrizione, e il luogo in cui si verifica il microambiente adatto è proprio il secondo

segmento.

Una volta creati i segmenti questi geni non servono più perciò possono restare accesi o anche

spegnersi, per la cellula non fa differenza.

Nel giro di poche ore i geni gap e i geni della regola della coppia sono attivati l’uno dopo l’altro. I

loro mRNA compaiono prima in schemi approssimati rispetto al quadro finale; poi in un tempo

breve, attraverso una serie di aggiustamenti, la distribuzione sfumata si dispone in un sistema netto

di strisce. Mentre l’embrione procede verso la gastrulazione, lo schema delle strisce si disintegra,

ma la loro precedente attivazione ha impresso dei valori posizionali sulle cellule del blastoderma,

che sapranno sempre la propria posizione e ruolo all’interno del corpo.

Engrailed è un gene il cui RNA è presente nel blastoderma in 14 bande, che corrispondono alla

porzione anteriore dei futuri parasegmenti. Essendo un gene della polarità segmentale viene

espresso in seguito al lavoro dei geni della regola della coppia e il suo schema di espressione

persisterà tutta la vita, sopravvivendo alla scomparsa dei segnali che lo hanno organizzato.

Geni Hox

I geni Hox sono detti geni omeotici o orchestranti. Si esprimono in determinati segmenti per

organizzare lo sviluppo di strutture complesse come arti, antenne, ecc.

Cioè organizzano la formazione di strutture basate sulla ripetizione modulata.

I vari arti, le dita, sono tutte strutture simili tra loro e a se stesse, e le componenti, cioè muscoli,

tendini, ossa, e i tessuti, i tipi cellulari, hanno poca variabilità, sono sempre gli stessi, come fossero

moduli ma ripetuti, combinati, e organizzati con variazioni.

I geni Hox sono responsabili di tale modularità all’interno del corpo e sono caratterizzati da un

Homeodomain (omeodominio) che è una sequenza di 60 nt molto conservata che lega il dna in un

sito chiamato Homeobox. Quindi gli hox codificano per fattori di trascrizione.

Sono organizzati in un complesso. In drosophila ci sono 8 geni Hox, organizzati in 2 complessi di 5

e 3 geni, chiamati bithorax e antennapedia.

L’espressione dei geni Hox dura per tutta la vita, ricorda alla cellula le proprie coordinate

posizionali, cioè dove si trova rispetto all’intero organismo. Il mantenimento di questa memoria è

ottenuto mediante feedback positivi (molti geni Hox favoriscono la propria espressione) e i 2

complessi funzionano in maniera opposta: l’espressione di uno comporta la repressione dell’altro

mediante compattamento della cromatina e in particolare non-acetilazione dell’istone H4. In questo

meccanismo sono implicate le proteine trithorax e polycomb che funzionano in maniera opposta.

Trithorax sono necessarie a mantenere attiva la trascrizione dei geni Hox nelle cellule in cui questa

è già stata accesa.

Polycomb forma complessi stabili con la cromatina mantenendo allo stato represso i geni Hox nelle

cellule in cui questi non sono stati attivati al momento opportuno.

Praticamente il cluster Hox sarà formato da geni accesi e geni spenti. Quelli accesi vengono tenuti

allo stato di eucromatina tramite iperacetilazione di H4, quelli spenti vengono tenuti compattati

mediante ipoacetilazione di H4.

Il cluster dei geni Hox specifica differenze anteroposteriori del tipo testa-torace-addome ed è

curioso che l’ordine 5’-3’ di tali geni corrisponda all’ordine testa-coda del corpo. Man mano che si

procede dalla testa verso la coda vengono attivati progressivamente tutti i geni a partire dal primo

fino a quello specifico di quel segmento, tuttavia prevale il fenotipo di quest’ultimo.

Per capirci meglio, nell’addome vengono espressi tutti i geni hox sia di testa, sia del torace, più

quelli dell’addome, ma il fenotipo è solo quello dell’addome. I complessi Hox di Drosophila e

uomo provengono dallo stesso complesso ancestrale, infatti nei mammiferi l’asse anteroposteriore è

controllato da geni selettori omeotici.

I geni Hox operano attraverso le proteine da loro codificate, ma queste non sono a loro volta

proteine leganti il DNA. Proprio per il loro lavoro di “progettazione modulare”, esse, piuttosto,

reclutano complessi di proteine che nel loro insieme legandosi al DNA decideranno quali saranno i

geni da trascrivere e quali quelli da reprimere.

Ricombinazione somatica indotta

Per studiare l’organogenesi si utilizzano i soliti sistemi basati ad esempio sullo studio di mutanti

deficitari per l’espressione dei geni coinvolti.

Dato che però tali meccanismi coinvolgono sempre i soliti pochi pathway utilizzati anche nello

sviluppo precoce, così, spesso, capita che mutazioni in questi causino scompensi talmente gravi che

l’embrione muore prima che si possano osservarli.

Un modo di aggirare tale problema è quello di creare mutanti condizionali, modificare ill DNA di

sottopopolazioni cellulari a stadi tardivi di sviluppo, come se operassimo una sorta di chirurgia

genetica per generare gruppi mutanti con un genotipo specifico ad un dato momento.

Per fare ciò, in Drosophila, abbiamo preso in prestito 2 elementi genetici derivati dal lievito: il gene

della ricombinasi sito specifica FLP e la sequenza FRT bersaglio di tale ricombinasi.

La sequenza FRT è posta vicino al centromero su un braccio del cromosoma scelto, sia materno che

paterno. Il gene FLP può trovarsi in un sito qualsiasi del genoma.

Il nostro gene interessato si trova su entrambi i cromosomi in eterozigosi, una variante sarà wild

type e una variante mutata.

Per tutto il tempo l’aplosufficienza del gene non mostrerà il fenotipo mutante, poiché la copia wild

type basterà a mantenere i normali livelli di espressione e lo sviluppo andrà avanti normalmente.

Ad un dato momento però, è

possibile scatenare la ricombinazione

e quindi un crossing over mitotico,

subito dopo la replicazione dei

cromosomi a livello del sito FRT.

Come risultato di tale fenomeno i 2

cromosomi iniziali, si saranno

scambiati un braccio e avranno 2

copie diverse del gene d’interesse.

Sui cromatidi fratelli saranno presenti

non 2 copie identiche, bensì la

variante wild type e la variante

mutante.

Poiché i cromatidi vengono divisi tra

le 2 cellule figlie, ne risulta che,

considerando il singolo cromosoma,

in una cellula finirà la copia

funzionante, e nell’altra quella

inattivata. Se prendiamo in

considerazione entrambi i cromosomi,

con una certa frequenza, i 2 cromatidi

wild type potranno segregare nella stessa cellula, e quindi nell’altra finiranno i 2 cromatidi mutati.

In questo modo da una cellula madre eterozigote si ottengono 2 figlie omozigoti per tutti i geni sul

braccio scambiato.

In seguito a proliferazione clonale si creeranno zone omozigoti in varie regioni del corpo.

Poiché alcuni di questi cloni sono omozigoti per l’allele malato, manifesteranno un fenotipo malato,

ma solo in determinate zone e a uno stadio tardivo di sviluppo.

Per far ciò, l’espressione di FLP deve essere inducibile. Per esempio si può porlo sotto un

promotore dello shock termico, così che esponendo l’embrione o una larva ad alte temperature per

pochi minuti se ne causa l’attivazione. Se l’esposizione è abbastanza breve si potrà localizzare

l’attivazione e quindi la ricombinazione a livello di poche cellule.

Un metodo più fine è quello di porre FLP sotto sequenze attivate e quindi espresse in un dato

momento e in un dato punto del corpo, così che la ricombinazione sarà scatenata proprio nel

momento e nel luogo in cui vogliamo studiare il gene di nostro interesse.

Intrappolamento di Enhancer

E’ un metodo che permette di guidare l’espressione di un gene scelto A nei punti e nei momenti in

cui è normalmente espresso un gene B.

Per fare ciò si prendono in prestito altri 2 elementi del lievito: il gene GAL4, che produce una

proteina che attiva la trascrizione dei geni sotto il nostro secondo componente, cioè una sequenza

chiamata elemento UAS.

Il gene GAL4 viene posto vicino alla regione regolatrice che controlla il gene B, così che quando il

gene B è attivo, è attivo anche GAL4, che codificherà la propria proteina.

UAS viene posto a monte del gene A, così che quando la proteina espressa da GAL4 è in giro, viene

espresso anch’esso.

In teoria si otterrebbe lo stesso effetto “driver” ponendo il gene A sotto una zona regolatrice simile

a quella del gene B, ma la strategia GAL4/UAS permette una strategia più efficiente a lungo

termine.

Infatti vengono create 2 library di Drosophile transgeniche, una con vari inserti GAL4 in punti

random del genoma, cioè a monte di vari geni B casuali, e un’altra con elementi UAS in a monte di

geni A specifici che vogliamo studiare.

Le mosche delle 2 library vengono fatte incrociare a caso, fino a quando si trova la combinazione

giusta, quella cioè in cui GAL4 è capitato proprio nella regione del gene B che viene espressa nel

momento e nel luogo in cui vogliamo studiare il gene A.

In questo modo con questo stratagemma è possibile individuare sequenze regolatrici interessanti nel

menoma, tale tecnica è chiamata infatti “intrappolamento di un enhancer”.

Altre metodiche con trasposasi e ricombinasi

Le ricombinasi sito specifiche sono enzimi capaci di operare appunto, ricombinazioni, a livello di

sequenze particolari: fanno quindi uno scambio di materiale genetico tra 2 molecole di dna a livello

di siti non omologhi. Esiste una ricombinasi sito specifica particolare chiamata CRE, capace di

ricombinare siti LoxP.

L’impiego di trasposasi invece può essere finalizzato a spostare sequenze da un cromosoma all’altro

o da zone all’altre del genoma.

I DISCHI IMMAGINALI

I dischi immaginali sono gruppi di cellule apparentemente non differenziate che si trovano in alcuni

segmenti della larva. Hanno l’aspetto di palloni accartocciati ed appiattiti, derivati da tasche di

epitelio.

Queste strutture restano quiescenti fino al momento della metamorfosi in cui si estroflettono, si

estendono a formare numerose strutture anche complesse come occhi, ali, zampe.

Nonostante le cellule che li compongono sembrano tutte uguali tra loro, tali dischi hanno una

autonomia di sviluppo per cui anche se vengono trapiantati in altre zone seguono il loro programma,

sviluppando la struttura da cui provengono.

Questo accade perché le cellule sono state determinate, così che hanno una memoria posizionale, e

sono già state condizionate a creare una certa parte del corpo.

I geni selettori omeotici hanno un ruolo fondamentale nel creare questa memoria. Infatti se si

eliminano per ricombinazione somatica entrambe le copie del gene omeotico, queste cellule

differenzieranno in strutture non corrette, come se appartenessero a un segmento differente del

corpo.

L’ala

Prendiamo l’ala come esempio per descrivere i meccanismi dell’organogenesi e in particolare come

dal disco immaginale si arrivi a un’appendice matura.

Alcune cellule vanno a formare il disco immaginale, ovviamente, a causa delle condizioni

particolari cui vengono esposte cioè i vari campi morfogenici.

In particolare i dischi immaginali si formano in punti di intersezione tra i gradienti dorsoventrali,

anteroposteriori e segmentali.

In termini molecolari in queste cellule quello che succede è l’accensione del gene “distal-less”, dal

nome del gene e dalla solita usanza di chiamare i geni di Drosophila dal fenotipo che causano, è

ovvio che mutazioni in tale gene causano il mancato sviluppo delle estremità corporee. Tale gene è

essenziale ad indurre quella proliferazione sostenuta necessaria a sviluppare un’estremità allungata.

Eyeless svolge l’azione corrispondente nel disco immaginale dell’occhio.

Polarità dell’ala

Fin dall’inizio il disco immaginale possiede i rudimenti di uno schema interno, ereditato dai campi

morfogeni precedenti. Tale schema stabilisce la polarità dell’ala

anteroposteriore e dorsoventrale.

Engrailed per esempio è espressa nella metà inferiore del disco,

stabilendo un’asse anteroposteriore. Apterous è invece espressa nella

metà dorsale, stabilendo un’asse dorsoventrale.

L’espressione è netta così che l’ala è divisa in 4 quadranti, a cui

corrisponderanno future regioni dell’ala, tali quadranti sono chiamati

compartimenti e tra loro non c’è scambio di cellule.

A partire da questo schema le cellule ai confini dei compartimenti

finiscono poi per creare bande strette di cellule specializzate sulle

quali costruire uno schema più dettagliato dell’ala.

Le cellule del compartimento posteriore esprimono Hedgehog ma non possono rispondere ad essa a

differenza di quelle del compartimento anteriore. Poiché Hedgehog agisce su breve distanza,

saranno attivate dal segnale solo le cellule facenti parte di una stretta banda di confine.

Le cellule di questa banda producono Dpp in risposta stabilendo un gradiente morfogeno.

Eventi simili si verificano sul confine dorsoventrale dove le cellule della banda sono attivate ad

Notch e rispondono esprimendo Wingless creando un ulteriore gradiente.

NotchNotch

Regolazione delle dimensioni

Esistono sicuramente meccanismi genetici che regolano le dimensioni dell’organismo e delle sue

singole parti. Infatti è possibile causare mutazioni nel macchinario del ciclo cellulare, e creare cloni

mitotici iperproliferanti. Questi, però, anche se si replicano con una frequenza molto alta, non

invadono mai i compartimenti esterni, anche a costo di creare zone con numeri anormalmente alti di

cellule molto piccole.

Questo accade perché le cellule, probabilmente, sono capaci di conoscere l’estensione del gradiente

morfogenico, e quanto è ripido e pertanto crescere solamente entro i confini di questo.

Un esperimento interessante è quello della rigenerazione intercalare in cui parte di un arto di insetto

viene amputato e trapiantato su un altro arto amputato. I segmenti trapiantati, però, non devono

essere di zone corrispondenti, così che l’arto finale sarà di dimensioni ridotte.

Nonostante ciò, le cellule cominciano a proliferare fino a coprire lo spazio mancante e ripristinare la

dimensione originaria.

Arti di insetto e di vertebrati sembrano molto differenti in struttura e organizzazione eppure se

esaminiamo i meccanismi molecolari ritroviamo strategie molto simili.

Infatti vengono stabiliti assi di polarità anteroposteriori, dorsoventrali e anche prossimo-distali, e i

geni coinvolti sono gli omologhi di Distal-less, wingless, Notch, Hedgehog, Engrailed e Dpp.

La setola sensoriale

E’ una delle strutture che origina dal disco immaginale dell’ala, può rispondere a stimoli chimici o

meccanici, ma sono tutte strutturalmente simili.

La più semplice è quella meccanocettrice, è costituita da solo 4 cellule: una cellula assiale, un

manicotto, una guaina neurale e un neurone. Quando la cellula assiale viene mossa, questa eccita il

neurone e parte lo stimolo sensoriale. Esse originano tutte da una cellula sensoriale madre.

Achaete e Scute sono 2 geni coinvolti nella genesi di queste cellule madri. Questi codificano

proteine che regolano altre della classe elica-giro-elica basica, cioè leganti il DNA, e sono infatti

espressi in tutte le zone del disco immaginale che formeranno setole.

In realtà, però, non tutte quelle che esprimo questi 2 geni diventeranno strutture sensoriali, esse si

trovano a uno stato precedente chiamato “proneurale” e infatti achaete e scute sono geni chiamati

proneurali. Tra questi poi tramite un sistema di inibizione laterale vengono scelte le future cellule

sensoriali tra i molti candidati proneurali.

Anche in questo caso il sistema di inibizione laterale è basato su Notch/Delta. Inizialmente tutte le

cellule esprimono entrambi i recettori, dalla competizione emergerà una singola cellula

overesprimente Delta, che non è capace di rispondere all’inibizione e così manda un forte segnale

inibitore alle cellule circostanti che esprimono Notch.

Questa diventerà una cellula sensoriale madre, il resto delle cellule normale epidermide. La

competizione è abbastanza vasta, per cui da un gruppo di 30 cellule emerge solo 1 cellula sensoriale.

La cellula sensoriale madre, continua a sfruttare il sistema Notch/Delta per guidare la

differenziazione delle sue figlie nei 4 tipi diversi della struttura della setola, se infatti a questo

momento si spegne la segnalazione tramite ricombinazione mitotica, la cellula madre differenzierà

in 4 neuroni uguali. Così se si riduce la capacità delle cellule di esprimere Delta, le cellule della

zona mutante diventeranno quasi tutte cellule sensoriali madre.

La competizione è truccata, così come in tutti i casi di inibizione laterale. Se infatti le cellule

fossero tutte uguali tra loro, nessuna risulterebbe vincitrice, per cui c’è sempre una cellula che sin

dall’inizio, per posizione, possiede un vantaggio intrinseco.

In questo caso la differenza è data dalla distribuzione asimmetrica di alcune proteine nella divisione

tra cui Numb e Prospero. Questa è capace di interagire con Notch bloccandone l’attività, così che la

cellula Numb + non risponde all’inibizione, mentre la cellula Numb – resta comunque sensibile ai

segnali inibitori delle cellule circostanti.

Alterazioni nell’espressione di Numb causano, come è facile immaginare, alterazioni nello schema

di differenziazione, per cui la sua overespressione rende tutte le cellule insensibili a Delta e si

differenziano in neuroni o glia, mentre la sua perdita rende tutte le cellule troppo sensibili a Delta e

diventeranno tutte cellule assiali o del manicotto.

Perché la divisione asimmetrica funzioni deve esistere un meccanismo per cui i fattori determinanti

migrino preferibilmente da un lato della cellula e che il fuso mitotico, sia allineato con tale

gradiente.

Questa polarità all’interno della cellula si riflette a in una polarità più ampia dell’intero piano

epiteliale, per cui tutte le setole sono allineate e pendono dallo stesso lato, come fossero spazzate

dal vento. Questo orientamento uniforme è diverso dalla polarità apicale delle cellule, anzi coesiste

nelle cellule insieme ad essa, ed è chiamata polarità planare.

Responsabili di questa polarità sono Frizzled e Dishvelled che hanno preso il proprio nome proprio

dall’aspetto disordinato che prendono le setole quando essi sono mutati.

Abbiamo già incontrato questi geni e le loro proteine, ma in situazioni riguardanti l’espressione

genetica. La polarità non c’entra nulla con questo ma piuttosto dipende dall’organizzazione del

citoscheletro.

E infatti Dishvelled che si trova sul

pathway di Frizzled ha 2 domini

separati e uno di questi attiva un

pathway che finisce per controllare

geni che regolano lo scheletro di

actina.

I meccanismi descritti fin’ora che

hanno portato alla differenziazione

delle cellule in epidermide o neuroni a

partire dagli stessi progenitori sono

simili se non identici ai meccanismi

dei vertebrati. Essi coinvolgono infatti

analoghi dei geni proneurali Achaete

e Scute, e sfruttano il meccanismo di

inibizione laterale Notch/Delta.

Fondamentalmente tale sistema serve

per creare una esatta “miscela” di cellule all’interno di un tessuto, bilanciando i vari tipi cellulari tra

loro. E infatti lo stesso meccanismo e riutilizzato, con piccole variazioni, anche nello sviluppo di

organi completamente diversi come muscoli, rivestimento dell’intestino, pancreas, ecc.

Quindi a partire da un singolo meccanismo di comunicazione cellulare (Notch/Delta) vengono

attivati pochi geni che codificano per “proteine regolatrici master”, che a catena attivano la

trascrizione di tutta quella collezione di geni specifica per quel tipo cellulare. Queste proteine

spesso appartengono alla famiglia delle proteine basiche elica-giro-elica, spesso codificate da geni

omologhi a quelli proneurali di Drosophila.

Un numero limitato di meccanismi, usati ripetutamente e in circostanze e combinazioni diverse, è

responsabile del controllo di molti aspetti dello sviluppo di tutti gli animali multicellulari.

Xenopus

E’ un vertebrato, dallo sviluppo esterno e rapido (18 ore). Le rane possono essere ottenute in gran

numero ed è facile mantenerle e manipolarle in laboratorio. Vengono utilizzati soprattutto i suoi

oociti per studi sul ciclo cellulare, ma l’organismo in sé è molto utilizzato per trapiantologia e

embriologia sperimentale.

E’ possibile ottenerne animali transgenici manipolando nuclei spermatici. Questi vengono resi

permeabili con lisolecitina, e viene introdotto dna plasmidico linearizzato.

Il nucleo col dna ingegnerizzato viene poi iniettato nelle uova non fertilizzate, da cui segue la

fusione dei pronuclei maschile e femminile e la segmentazione.

Altri metodi utilizzati sfruttano la strategia degli RNA antisenso che mimano i microRNA. Una

variante di questa tecnica prevede l’utilizzo di oligont di Morpholino che sono più stabili e offrono

un’efficacia più duratura in quanto non sono degradati dalle RNAsi H, ma sono molto aspecifici e

tossici.

Polarità dell’uovo (anteroposteriore e dorsoventrale)

Come per tutti gli organismi descritti fin’ora, Xenopus non fa eccezione e ha bisogno, per prima

cosa, di organizzare i 3 assi principali del corpo: anteroposteriore, dorsoventrale e mediolaterale.

L’ovulo ha già una propria asimmetria: è diviso in 2 emisferi, chiamati polo animale e polo

vegetavio, e questa distinzione corrisponde al futuro asse anteroposteriore del corpo.

A livello molecolare questa asimmetria è dovuta alla diversa localizzazione di mRNA e proteine.

Tra i messaggeri coinvolti troviamo VegT (una proteina di adesione), e VG1 (della famiglia TGF-

beta), tra le proteine compaiono alcune del pathway di Wnt tra cui Dishvelled. Questi sono tutti

accumulati nel polo vegetativo.

Il prossimo evento scatenante una seconda asimmetria è la fecondazione. Infatti lo spermatozoo

entra in un punto casuale del polo animale, da tale punto sono scatenati meccanismi che fanno

ruotare la corteccia di actina immediatamente sotto la membrana, verso quel punto, così che il polo

animale della corteccia è ruotato leggermente verso il futuro lato ventrale, dal lato opposto, lungo

fasci di microtubuli paralleli alla corteccia, è stata trasportata Dishvelled che si troverà quindi nel

futuro lato dorsale.

Clivaggio -> Blastula

A questo segue il clivaggio, cioè una serie molto rapida di divisioni mitotiche, con cicli cellulari

ridotti all’essenziale (solo fasi S e M), in cui la cellula uovo si suddivide rapidamente in numerose

cellule più piccole, i blastomeri, senza variare la sua dimensione iniziale.

Con questo sistema, praticamente, le cellule avranno un citoplasma diversificato che corrisponderà

alla particolare miscela asimmetrica di mRNA e proteine che erano inizialmente distribuite

nell’uovo. Infatti in questo processo non c’è trascrizione genica, e l’uovo procede attraverso queste

fasi sulla scorta di riserve accumulatesi durante la gametogenesi dell’oocita.

Dopo circa 12 cicli di clivaggio la divisione cellulare rallenta e compaiono le fasi Gap, inizia la

trascrizione del genoma embrionale: transizione alla blastula intermedia.

Già a questo livello è possibile notare una differente quantità di divisioni cellulari ai 2 poli, in

particolare le cellule del polo vegetativo si dividono molto meno rispetto a quelle del polo animale.

Alla fine del clivaggio, si è formata la blastula, una struttura simile a una sfera il cui emisfero

animale ha al suo interno una cavità, il blastocele, ripiena di liquido.

Blastula -> Gastrula

Poco dopo la formazione della blastula iniziano una serie di movimenti ordinati di cellule, che

vengono chiamati gastrulazione. Alla fine di questo processo la blastula sarà diventata una struttura

a 3 strati con un tubo intestinale centrale, orientamento anteroposteriore, dorsoventrale e anche

simmetria bilaterale, chiamata gastrula.

I 3 foglietti sono chiamati ecto-, meso- ed endoderma, in base alla loro posizione, rispettivamente

esterna, mediana e interna.

La gastrulazione consiste, grossolanamente, nell’invaginazione delle cellule del futuro endoderma

all’interno dell’embrione, fino a sbucare dal polo opposto nel punto che diventerà la bocca.

Le prime cellule ad invaginarsi saranno quelle che arriveranno per prime al polo opposto e quindi

quelle che formeranno le strutture anteriori dell’apparato intestinale, le ultime, al contrario,

formeranno le strutture posteriori. Insieme alle cellule dell’endoderma migreranno anche quelle del

mesoderma, che come le prime formeranno le strutture della testa o della coda a seconda della

successione con cui invagineranno. Le cellule dell’ectoderma invece si estenderanno man mano su

tutta la superfice esterna dell’embrione.

Per capire meglio il processo bisogna immaginare che le cellule possiedono la marcatura

“anteroposteriore” e “dorsoventrale”, e che spostandosi, non ne acquisiscono una nuova, ma si

comporteranno secondo quella che hanno acquisito alla fine della formazione della blastula.

Per cui se per esempio quando nella gastrulazione una cellula del polo dorsale si sposta dal lato

opposto cioè nella zona descritta come ventrale, non formerà una struttura del ventre, bensì una del

dorso.

Quindi la definizione delle asimmetrie iniziali nella blastula serve solo a marcare le cellule, e solo

alla fine della gastrulazione saranno definiti in maniera stabile gli assi corporei, per cui potremo dire

che quel punto diventerà il dorso e il punto opposto il ventre.

Tuttavia i movimenti di tale fenomeno sono così prevedibili che si possono rintracciare già nella

blastula queste le cellule, soprattutto perché in quel momento sono già state etichettate.

La gastrulazione inizia quando diventa visibile il blastoporo, una corta indentatura proprio sul polo

dorsale dell’embrione. Questa “piega” si estende man mano tutt’intorno all’embrione a circondare

un tappo di cellule contenenti vitello. Fogli di cellule migrano a livello del blastoporo e

approfondiscono l’invaginazione, strisciando sul foglietto ectodermico. A mano a mano che queste

cellule entrano dentro, esse si spostano facendo forza su ciò che sta sotto di loro cioè il futuro

ectoderma, che viene spinto e si estende.

Solidalmente con la sua estensione, il labbro del blastoporo viene tirato giù, restringendo man mano

la sua circonferenza, fino a ridurlo quasi a un punto.

Nel frattempo l’endoderma raggiunge il polo dorsale e lì formerà la bocca, il lato opposto, dove è

iniziata l’invaginazione costituirà l’ano, così in questo modo è stabilito l’asse anteroposteriore del

corpo.

Allo stesso modo bisogna tener presente che a invaginarsi sono soprattutto le cellule di un punto

preciso della blastula, cioè quelle dove compare per prima il blastoporo, che era marcato come

dorsale da dishvelled. Quindi le cellule del mesoderma che si invaginano saranno marcate come

dorsali e formeranno infatti tutte le strutture dorsali centrali dell’asse corporeo principale.

Entriamo ora nei particolari molecolari che definiscono il punto in cui compare il blastoporo.

Il blastoporo compare sulla blastula, che, ricordiamo, conserva le asimmetrie iniziali dell’uovo, cioè

una distinzione animale-vegetativa e dorso-ventrale.

Le cellule del polo vegetativo si distinguono per la loro espressione VegT. Questa dirige la sintesi

di una proteina di segnale Xnr. Il segnale Xnr viene inviato alle cellule immediatamente a contatto

con il polo vegetativo e sotto il blastocele, che saranno indotte a esprimere BMP4 specifico del

mesoderma.

Esiste però una zona, quella del polo dorsale in cui l’espressione di Xnr si sovrappone a quella di

Dishvelled. La combinazione di queste 2 indurrà l’espressione di Chordin, tipica della notocorda.

Al confine tra le cellule esprimenti Chordin, struttura del mesoderma dorsale, e quelle del polo

vegetativo che diventeranno endoderma, compare il blastoporo, cioè al polo dorsale, sul confine tra

endoderma e mesoderma.

Il labbro dorsale del blastoporo se trapiantato in un altro embrione inizia in quel punto una

gastrulazione in più oltre a quella che si verifica normalmente nell’embrione, formando alla fine il

doppio delle strutture corporee, formando un embrione doppio come i gemelli siamesi.

Quindi risulta evidente che il blastoporo è una fonte di forti segnali che ordinano sia la

gastrulazione sia la differenziazione. Proprio per la sua fondamentale importanza è chiamato

Organizzatore di Spemann (per gli amici solo l’Organizzatore, lettera maiuscola).

Il movimento cellulare della gastrulazione inzia grazie a cellule “a bottiglia” che aprono la strada.

Queste si muovono su uno strato di fibronettina e forzano la curvatura. Una volta segnata la piega, il

percorso, le cellule in fila possono strisciare all’interno come un foglio, il metodo che utilizzano per

allungarsi è chiamato estensione convergente.

In vitro è possibile notare come avviene: gruppi di cellule si restringono e si allungano

spontaneamente, mettendosi in fila, strisciando l’una sull’altra con i propri lamellipodi.

L’allineamento dei loro movimenti dipende dallo stesso meccanismo della polarità planare ed è

infatti guidato da frizzled/dishvelled.

Un altro fattore fondamentale nel movimento sono le molecole di adesione:

I 3 foglietti hanno profili di espressione genica differenti, e cosa molto importante, hanno una serie

di molecole di adesione che servono a riconoscersi tra simili.

Gli effetti di adesione selettiva cellula-cellula sono facilmente dimostrati da questo esperimento: se

si separano le cellule di un embrione e le si mischiano tra loro, queste dopo un po’ riprendono una

conformazione che ricorda quella di un embrione normale con endoderma al centro, ectoderma

all’esterno e mesoderma in mezzo.

In questo fenomeno hanno una grande importanza le caderine. E’ stato dimostrato infatti che le

cellule sono capaci di aggregarsi tra loro per pattern di caderine. Cioè non solo si aggregano tra loro

cellule che esprimono caderine simili, ma anche quelle che esprimono concentrazioni simili della

stessa caderina.

Le caderine sono perfette per lo sviluppo embrionale perché infatti creano un legame omofilico

(caderina-caderina) che permette alle cellule di riconoscersi tra loro, hanno bassa affinità di legame,

in maniera da lasciare le cellule abbastanza libere di eseguire tutti i movimenti cellulari richiesti, per

esempio nella gastrulazione, e inoltre intracellularmente forniscono un ancoraggio ai filamenti di

actina.

Cambiamenti negli schemi di espressione di caderine sono strettamente correlati con i cambiamenti

di schemi di associazione tra cellule durante la gastrulazione, neurulazione e formazione di somiti.

Notocorda e tubo neurale

Appena dopo la gastrulazione una snella bacchetta di cellule, derivata direttamente

dall’Organizzatore, separa in 2 il mesoderma lungo l’asse dorsale, finendo con ectoderma sopra di

essa, endoderma sotto e mesoderma ad entrambi i lati.

Questa struttura è chiamata Notocorda e caratterizza il phylum dei Chordata di cui i vertebrati fanno

parte. Le cellule della notocorda sono caratterizzate dalla proteina Brachiury.

Queste cellule sono responsabili dell’allungamento dell’embrione, per cui dalla sfera iniziale si

arriva una struttura oblunga. Infatti non appena le cellule della notocorda si invaginano formano una

colonna di tessuto che si allunga per estensione convergente. L’allungamento è esasperato dal fatto

che tali cellule si rigonfiano con vacuoli.

Una striscia di ectoderma immediatamente sopra la notocorda è chiamata piastra neurale. Qui i

microtubuli delle cellule si allungano formando strutture colonnari, immediatamente sotto la zona

apicale, poi corre un anello di filamenti di actina. Ad un dato momento questi fasci si contraggono

facendo passare le cellule da una forma colonnare a una trapezoidale. Ma siccome a livello di questi

fasci le cellule sono tutte saldate con tight junction, si ripiegano su sé stesse passando da una piastra

a un tubo: il tubo neurale, da cui originerà cervello e midollo spinale.

Non è finita qui. Alcun cellule del tubo neurale cambiano profilo di espressione di caderine e si

staccano dal tubo neurale a formare la cresta neurale. Queste rimarranno in sede o migreranno e

saranno le future cellule gliali, il sistema nervoso periferico, cellule pigmentate della pelle, tessuti

connettivi della testa.

Somiti

Cambiamenti regolati nell’adesione cellulare sono alla base della formazione dei somiti.

La lunga striscia di mesoderma ai lati della notocorda, si spezza in blocchi separati chiamati somiti.

Queste strutture poi formeranno vertebre, costole e muscoli.

La formazione dei somiti procede dalla testa verso la coda, la parte più immatura del mesoderma è

chiamata mesoderma presomitico e fornisce il tessuto necessario: si accorcia progressivamente

verso la coda e nel frattempo deposita via via i somiti.

La formazione dei somiti dipente dall’espressione ciclica di una serie di geni, infatti la formazione

di un somita avviene in un intervallo di tempo ben definito e sempre uguale.

Tra questi geni uno è c-hairy-1. Le cellule vengono arrestate o al picco massimo di c-hairy o nel

cavo (niente c-hairy). A seconda che si fermino in un momento o nell’altro del ciclo, le cellule

esprimono serie diverse di geni.

In questo modo l’oscillazione temporale nell’espressione di c-hairy-1 si riflette in uno schema

spaziale.

I vari somiti poi si separano tra loro perché la parte anteriore e posteriore di ciascun somita esprime

molecole di adesione diverse, per cui inizio e fine di ogni somita si repellono (?) a vicenda.

I meccanismi molecolari con cui è realizzata questa oscillazione ciclica non sono conosciuti, ma

esistono ipotesi e meccanismi simili in altri organismi:

Il meccanismi del ritmo circadiano di Drosophila, per esempio, sono in parte conosciuti, e sono

dovuti a espressione ciclica di geni, in particolare Tim e Per.

Tim e Per formano un eterodimero nel citoplasma e sono capaci di inibire la trascrizione di sé stessi

e di altri geni.

Però Tim viene degradato in risposta alla luce, cioè di giorno viene degradato. Con un meccanismo

simile Per è fosforilato e degradato.

Per cui di giorno, con la luce i dimeri non si formano, quindi non c’è inibizione, e quindi si

trascrivono certi geni. Di notte invece, la luce scompare, Tim e Per si accumulano, formano gli

eterodimeri e inibiscono la trascrizione.