RISOLUZIONE OIV/ENO 391/2010 LINEE DIRETTRICI SUGLI ... · tecnica si estende ai laboratori di...

Esemplare certificato conforme Tbilisi, il 25 giugno 2010

Il Direttore Generale dell’OIV Secretario dell’Assemblea Generale

Federico CASTELLUCCI

© OIV 2010 1/43

RISOLUZIONE OIV/ENO 391/2010

LINEE DIRETTRICI SUGLI AUTOANALIZZATORI COLORIMETRICI IN ENOLOGIA

L'ASSEMBLEA GENERALE Visto l’articolo 2 paragrafo 2 iv dell’Accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione dell’Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino, Su proposta della Sotto-Commissione Metodi di Analisi, CONSIDERANDO la risoluzione oeno 10/2005 «Guida pratica per la validazione, il controllo qualità e la valutazione dell’incertezza di un metodo di analisi enologica alternativa» che permette ai laboratori di assicurare il lavoro di collegamento del metodo interno automatizzato in rapporto al metodo di riferimento OIV. CONSIDERANDO che questa guida comprende anche procedure di controllo della qualità dei risultati ottenuti tramite questi metodi automatizzati che permettono di renderne sicuro l’utilizzo. CONSIDERANDO che solo i metodi pubblicati nella Raccolta dei metodi internazionali d'analisi dei vini e dei mosti dell’OIV o nella raccolta dei metodi internazionali d'analisi delle bevande alcoliche d'origine vitivinicola dell’OIV hanno carattere ufficiale di riferimento e sono applicabili per il controllo e la risoluzione di controversie. DECIDE di pubblicare indipendentemente le linee direttrici relative agli autoanalizzatori colorimetrici in enologia qui allegati.



Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 2/43

Linee direttrici sugli Analizzatori automatici in enologia

I primi sviluppi dell'analisi automatica in enologia sono apparsi all'inizio degli anni 70. Sono stati realizzati a partire da analizzatori a flusso continuo, utilizzati fino allora principalmente in biologia medica. I principali parametri accessibili erano allora l'acidità volatile, gli zuccheri riduttori, il diossido di zolfo libero e totale. Più tardi, sono state acquisite tecniche enzimatiche che permettevano, in particolare, il dosaggio del glucosio e del fruttosio e degli acidi malico e lattico. Nel 1980 degli analizzatori nel vicino infrarosso (NIR) hanno permesso una misura rapida del titolo alcolometrico volumico nei vini e degli zuccheri nei mosti. I primi analizzatori sequenziali, anch’essi derivati dall'analisi medica, sono apparsi all'inizio degli anni 90. Permisero rapidamente l'accesso a numerose determinazioni a base di reazioni chimiche (composti fenolici totali, diossido di zolfo libero e totale, acido tartarico, acido acetico, o enzimatici (glucosio e fruttosio, acido malico e lattico, acido citrico,…) Più tardi, alla fine degli anni 90, la tecnica infrarossa a trasformazione di Fourier (IRTF) è venuta a completare i dispositivi automatici a disposizione dei laboratori enologici. Tutte queste tecniche automatiche sono attualmente estremamente diffuse in tutto il mondo. Hanno permesso una diminuzione molto significativa del costo dell'analisi enologica che si è tradotta nella possibilità, non di diminuire il costo per gli utenti ma permettere loro di accedere, per un costo dato, a molti più parametri e dunque informazioni. Questa situazione ha permesso di accompagnare, mediante l'analisi, tutte le tappe della vita del vino in modo molto più efficace. L'analisi automatica è dunque rapidamente risultata affidabile e ripetibile, a condizione di attuare tecniche di controllo qualità interna (CQI) adatte. Una caratteristica fondamentale di tutte le tecniche automatiche è che sono strettamente comparative. Gli analizzatori automatici devono, infatti, essere oggetto di calibrature iniziali con campioni di valore conosciuti. Queste calibrature possono essere permanenti, semipermanenti, giornaliere o persino associate ad ogni serie di campioni. La qualità dei risultati ottenuti è così direttamente dipendente da quella dei campioni di calibratura attuati. Questi campioni possono essere vini o mosti che presentano valori conosciuti per i parametri ricercati. Possono anche essere soluzioni sintetiche.

I metodi automatici restano, generalmente, metodi interni per i quali ogni laboratorio deve potersi garantire della qualità dei risultati con vari approcci:

- convalida iniziale del metodo, - qualità delle norme di calibratura e di controllo utilizzate, - partecipazione molto regolare a reti di confronto interlaboratorio, - confronto regolare dei risultati con quelli ottenuti dai metodi di riferimento, ecc.




L’utilizzo decisamente alto delle tecniche automatiche nel mondo del vino rende il loro ruolo tecnologico, commerciale e di controllo, innegabile e fondamentale per l'economia e gli scambi vitivinicoli. Ciò giustifica la pubblicazione di questa guida che non costituisce un documento di riferimento ma soltanto d'informazione. I suoi unici obiettivi sono:

- descrivere il principio delle tecniche attuate, la pratica della loro applicazione ed i limiti del loro utilizzo - esporre nei dettagli i metodi applicati più correnti, tenuto conto che questi sono spesso adattati parzialmente dai laboratori in funzione dell'apparecchio utilizzato o delle matrici attuate. L'elenco proposto non è mai restrittivo e altre applicazioni sono possibili. Nuovi sviluppi sono regolarmente proposti.




LINEE DIRETTRICI SUGLI AUTOANALIZZATORI COLORIMETRICI IN ENOLOGIA

Avvertenza: Questa guida non costituisce un documento di riferimento, ma solo d’informazione. I metodi indicati nelle presenti linee direttrici non possono essere considerati come metodi di riferimento alla stregua di quelli indicati nella Raccolta dei metodi internazionali d’analisi dei vini e dei mosti dell’OIV o alla raccolta dei metodi internazionali d’analisi delle bevande spiritose d'origine vitivinicola dell'OIV. Soltanto i metodi pubblicati nella Raccolta dei metodi internazionali d'analisi dei vini e dei mosti dell’OIV o nella raccolta dei metodi internazionali d'analisi delle bevande spiritose d'origine vitivinicola dell’OIV hanno carattere ufficiale e sono applicabili per il controllo e la risoluzione di controversie.

Questi analizzatori automatizzano le varie fasi di un’analisi chimica o enzimatica e utilizzano una rilevazione colorimetrica. Esistono due grandi famiglie utilizzate in enologia:

Gli analizzatori a flusso continuo; Gli analizzatori sequenziali.

1. GLI ANALIZZATORI FLUSSO CONTINUO

I primi lavori sull’automatizzazione dell’analisi chimica in enologia tramite flusso continuo sono stati realizzati da MORFAUX, SARRIS et al. tra il 1969 e il 1972. Solo a partire dal 1974, tuttavia, questa tecnica si estende ai laboratori di enologia con la messa a punto di metodi affidabili e ripetibili.

1.1 Composizione e principio di una catena di analisi automatica a flusso continuo

Una catena di analisi automatica a flusso continuo si compone di moduli separati che svolgono ciascuno una funzione ben precisa (figura 1).

1.2 Campionatore

Comprende un vassoio che può contenere generalmente da 20 a 60 ciotole per campioni con volume compreso tra 1 e 3 ml. Un braccio rotante provvisto di un ago preleva i campioni uno dopo l’altro. Tra due successivi campioni, l’ago si immerge in un liquido di risciacquo. L’ago è collegato al resto del circuito analitico




tramite un tubo in PVC. A turno vengono aspirati con l’ago, verso il circuito analitico, il liquido di risciacquo, un campione, poi nuovamente il liquido di risciacquo e un nuovo campione. La cadenza dell’analisi è così regolata a livello del distributore di campione. Se l’ago preleva un campione per un minuto poi il liquido di risciacquo per un altro minuto, la cadenza sarà di 30 campioni l’ora. Si possono regolare a piacere sia la cadenza, sia il rapporto tra il tempo di risciacquo e il tempo di prelievo del campione che non è necessariamente pari a 1, come nell’esempio qui sopra, ma può essere di 2, 1/2, 1/3, 1/4, ecc.

1.3 Una pompa peristaltica

E' il cuore della catena di analisi automatica. Tutti i movimenti di liquido nel circuito analitico sono regolati dalla pompa. Comprende in generale da 20 a 30 canali. Ognuno è costituito da un tubo, generalmente in PVC, schiacciato contro un supporto da una serie di rulli. L’avanzamento di questi rulli fa circolare il liquido contenuto all’interno del tubo della pompa. La portata di ciascun tubo è funzione del suo diametro interno. Così, utilizzando tubi di diverso diametro (da 0,005 a 0,110 cm) e a condizione che la velocità di avanzamento dei rulli della pompa sia rigorosamente costante, si ottiene una gamma molto vasta di portate. Tutto questo permette di regolare in modo preciso le portate di aspirazione del campione e dei diversi reagenti nel circuito analitico.

1.4 Una cassetta analitica

Comprende tutti gli elementi del circuito analitico. È al suo livello che il campione può essere sottoposto a diversi trattamenti in funzione dell’analisi da realizzare:

- diluizione; - dialisi; - aggiunta di reagente; - miscelazione; - distillazione; - passaggio a bagno-d’acqua regolata con termostato (temperatura e durata

variabile). Una parte del circuito può essere termoregolata. Tutti i flussi liquidi che circolano nel circuito analitico sono, al momento dell’uscita dalla pompa, segmentati regolarmente da bolle d’aria ogni 1 o 2 centimetri. Queste bolle d’aria, grazie alle forze di tensione superficiale, impediscono la diffusione di un composto in soluzione da una sezione di colonna liquida compresa tra due bolle verso quella che la precede o quella che la segue. La bolla d’aria asciuga inoltre la parete del tubo di vetro o di PVC nel quale circola. In questo modo si eliminano tutte le contaminazioni da un campione all’altro e qualsiasi diluizione di un campione con il liquido di risciacquo che lo precede e quello che lo segue. Questo principio fondamentale della separazione dei liquidi tramite una bolla d’aria è utilizzato a partire dal distributore di campioni. In effetti, al livello dell’ago di prelievo, l’aspirazione è costante; quando l’ago passa dal bagno di risciacquo alla ciotola di campione, viene prelevata una piccola quantità d’aria che favorisce la formazione della bolla che, nel tubo di prelievo, separa il liquido di risciacquo dal campione. È stata proposta una seconda generazione di materiale a flusso continuo che utilizza la tecnica del micro-flusso, permettendo di fare a meno della segmentazione. A causa di problemi di incrostazioni difficili da risolvere, questo tipo di materiale è tuttora poco diffuso. I principi analitici restano gli stessi delle apparecchiature a segmentazione.




1.5 Un rilevatore

La rilevazione più frequente è la colorimetria. La maggioranza delle analisi chimiche automatizzate si basano su un metodo colometrico, in particolare nel campo enologico. Si possono tuttavia utilizzare altri rilevatori:

- spettrofotometro UV; - fotometro a fiamma; - fluorimetro; - nefelometro; - contatore di cellule; - rifrattometro; - elettrodi specifici.

1.6 Un registratore

La presenza del composto ricercato nel campione prelevato è confermata, a livello del rilevatore, da un segnale la cui intensità è proporzionale alla concentrazione di tale composto. Questo segnale è registrato sotto forma di picchi (fig. 2) Il ritorno verso la linea di base tra due picchi successivi corrisponde al prelievo del liquido di risciacquo. L’affidabilità del metodo di analisi a flusso continuo si basa sulla lettura del registratore grazie ai seguenti principi: 1° La creazione di uno stato di equilibrio nel circuito analitico tale che il ritorno alla linea di base è sempre ottenuto tramite prelievo del liquido di risciacquo e dal fatto che una data concentrazione nel campione analizzato dia un picco di altezza costante. 2° Il metodo di dosaggio è un metodo comparativo. Tutte le misure sono fatte rispetto a una curva di calibrazione dalle concentrazioni perfettamente note. Qualsiasi funzionamento errato del circuito dà luogo a una perturbazione della registrazione (deriva della linea di base, variazione della forma dei picchi, variazione dell’altezza dei picchi di verifica, ecc); perciò le possibilità di analisi errata sono ridotte.




1.7 Interfaccia digitale

Permette la conversione del segnale analogico emesso dal colorimetro in un valore digitale che può essere direttamente espresso in concentrazione del componsto dosato. Include, generalmente, un sistema di controllo che permette di assicurarsi che il dosaggio non sia stato alterato.

Fig. 2

Modello di registrazione ottenuto nel caso di dosaggio dell’acidità volatile nei vini con una cadenza di 30 campioni ogni ora.

(i valori indicati sono espressi in g/L di acido solforico)

Risposta

Tempo (min)




GLI ANALIZZATORI SEQUENZIALI

2.1 Principio e organizzazione di un analizzatore sequenziale

Questi analizzatori sono spesso multiparametrici. Possono così eseguire diversi dosaggi sullo stesso campione e tali dosaggi possono essere programmati per ogni campione. Ogni campione da analizzare è prelevato, messo in una vaschetta di misura trasparente, dove riceve il o i reagenti. La misurazione colorimetrica è eseguita direttamente in questa vaschetta. Le cadenze sono comprese tra 50 e 1000 dosaggi l’ora. Le principali applicazioni avvengono sia in analisi chimica, sia in analisi enzimatica. I volumi di reagente necessari sono bassi, limitando i costi, in particolare per quanto riguarda i dosaggi enzimatici. Un analizzatore sequenziale comprende vari elementi.

2.1.1 Composizione di un analizzatore sequenziale

1.6.0.1 Un vassoio di prelievo

Può contenere un numero variabile di contenitori nei quali si pongono i campioni da analizzare.

1.6.0.2 Un vassoio di reazione

È costituito da vaschette trasparenti che ricevono il prelievo effettuato sul campione da analizzare e il o i reagenti necessari. Sono mantenute in un bagno termostatico a temperatura costante e permettono la lettura colorimetrica. Le vaschette possono essere monouso o pulite da un dispositivo di lavaggio prima di un nuovo utilizzo.

1.6.0.3 Un vassoio di reagenti

Contiene i serbatoi dei reagenti per preparare i dosaggi voluti. Sono posti in ambiente refrigerato, per consentire l’utilizzo di reagenti fragili nel caso dei metodi enzimatici.

1.6.0.4 Uno o due bracci di prelievo

Permettono, con l’aiuto di un sistema di siringa automatica, di prelevare i campioni dal vassoio di prelievo e i reagenti dal vassoio dei reagenti e di porli successivamente nella vaschetta di reazione.

1.6.0.5 Un lettore ottico

Permette una misurazione colorimetrica delle diverse vaschette di reazione, sia in momenti precisi (per esempio, inizio e fine della reazione) sia in modo dinamico per poter stabilire una curva di reazione per ciascuna di esse. Nel secondo caso, la misura della velocità iniziale di reazione può essere valutata e utilizzata per il calcolo della concentrazione del composto ricercato.

1.6.0.6 Un modulo elettronico-informatico

Assicura il pilotaggio del sistema e i calcoli necessari per ottenere il risultato ricercato.

2.1.2 Schema analitico

Lo schema analitico può essere variabile. L’esempio riportato di seguito corrisponde al caso più classico. Comporta le seguenti fasi:

Presa del campione Dal vassoio dei campioni si preleva il campione di vino, il cui volume è determinato per ogni dosaggio, e lo si pone in una vaschetta di reazione.

2.1.2.1 Aggiunta del primo reagente

Il primo reagente (R1) è prelevato dal vassoio dei reagenti, per un volume specifico, e aggiunto nella vaschetta di reazione. L’insieme viene di solito omogeneizzato da un sistema agitatore.




2.1.2.2 Temporizzazione 1

La miscela reagente è lasciata nel suo stato per una determinata durata (spesso da 4 a 6 minuti).

2.1.2.3 Misurazione dell’assorbimento

Si esegue una prima misurazione dell’assorbimento alla lunghezza d’onda richiesta. Corrisponde al punto zero della reazione adottata e permette di tenere conto di un’eventuale influenza del colore del vino.

2.1.2.4 Aggiunta del secondo reagente

Nella vaschetta di reazione si aggiunge il secondo reagente (R2). È lo stesso reagente che attiva la reazione colorimetrica cercata.

2.1.2.5 Temporizzazione 2

La miscela reagente è lasciata nel suo stato per una determinata durata (spesso da 4 a 6 minuti).

2.1.2.6 Misurazione dell’assorbimento

Si esegue una seconda misurazione dell’assorbimento alla lunghezza d’onda richiesta. Permette di misurare la variazione di assorbimento dovuta alla reazione stessa.

Questo schema di base può variare. Ad esempio, con le apparecchiature dalle prestazioni più elevate, la misurazione dell’assorbimento può essere eseguita in modo dinamico con una lettura, per esempio, ogni 12 secondi. Questo permette di determinare una curva di reazione e di misurare la velocità iniziale di reazione che, in condizioni analitiche precise, può essere proporzionale alla concentrazione del composto ricercato.

2.1.2.7 Calcolo delle concentrazioni

Per le applicazioni enologiche, il calcolo è sempre eseguito tramite calibratura con vini di concentrazione conosciuta dell’analita o di soluzioni sintetiche dello stesso. Il numero di campioni di calibratura può essere variabile e più elevato se la curva di reazione non è lineare.

Alcuni materiali possono utilizzare un solo reagente, eliminando così la possibilità di realizzare i dosaggi per i quali sono necessari due reagenti distinti. In compenso, gli apparecchi che permettono di utilizzare due reagenti possono facilmente utilizzarne uno solo, se questo è sufficiente per il metodo considerato.




ALLEGATO 1

ESEMPI DI METODI DI DOSAGGI ABITUALI IN ENOLOGIA CON ANALIZZATORI AUTOMATICI A FLUSSO CONTINUO

I metodi descritti di seguito sono forniti a titolo puramente esemplificativo, poiché non sono gli unici adoperabili.

1.Valutazione del tenore dell’acidità volatile nei vini e nei mosti

1.1 Principio L’acidità volatile è costituita dagli acidi grassi appartenenti alla serie acetica. Gli acidi lattico, succinico, carbonico e il biossido di zolfo sono esclusi dall’acidità volatile. Gli acidi della serie acetica sono separati dai costituenti del vino tramite micro-distillazione a 98°C sotto corrente di azoto. L’acido lattico è rettificato al momento della distillazione. Il biossido di zolfo è ossidato in acido solforico con perossido d’idrogeno ed eliminato prima della fase di distillazione. L’anidride carbonica non interferisce. Il distillato degli acidi della serie acetica viene messo in presenza di un reagente di ossido-riduzione, le cui variazioni d’intensità colorante sono proporzionali al tenore in acidità volatile: ioduro di potassio o blu di bromofenolo.

1.2 Apparecchiatura Catena a flusso segmentato.

1.3 Reagenti e soluzioni

1.3.1 Soluzione di perossido d’idrogeno perossido d’idrogeno (N° CAS[7722-84-1]) 30 al 35 % (o 110 vol.) 0,5 ml acqua demineralizzata fino a 200 ml.

Conservazione: 1 giorno.

1.3.2 Soluzione di acido tartarico al 5% acido tartarico (L, D o DL) cristallizzato puro 50 g acqua demineralizzata fino a 1000 ml.

Conservazione in bottiglia leggermente colorata: 1 mese a + 4 °C.

1.3.3 Ioduro e iodato di potassio Soluzione di KI (N° CAS[7681-11-0]) al 10% (p/v) Soluzione di KIO3 (N° CAS[7758-05-6]) al 0,2% (p/v)

Conservazione in bottiglia leggermente colorata: 1 mese. Si può verificare la neutralità delle soluzioni di KI e KIO3 mescolandone piccole quantità in un tubo. La miscela deve restare incolore.

1.3.4 Blu di bromofenolo Indicatore colorato

- Blu di bromofenolo (N° CAS[115-39-9]) 330 mg - Fosfato di potassio (N° CAS[7758-1-4]) 0.1 M 100 ml

- Tetraidroborato di sodio (N° CAS[16940-66-2]) 0,1 M 5 ml - Acqua distillata fino a 1000 ml.

Agitare e poi lasciare a riposo per 3 giorni, al riparo dalla luce.

Prima dell’utilizzo, filtrare poi aggiustare il pH a 4,9 con la soluzione di tetraidroborato di sodio.




1.3.5 Soluzioni di verifica (a scelta)

1.3.5.1 Soluzioni di acido acetico (N° CAS[64-19-7]) da 0,2 a 1 g·l-1 espresso in H2SO4 (da 4 a 20 meq o da 0,28 a 1,40 g·l-1 in acido acetico) Conservazione: 1 giorno.

1.3.5.2 Vini di riferimento dal tenore in acidità volatile noto

1.4 Modo operativo Il diagramma dei flussi è indicato in allegato.

I campioni non subiscono alcun trattamento preliminare. La cadenza di analisi può variare da 30 a 60 campioni l’ora secondo la configurazione utilizzata.

1.5 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità intra-laboratorio: 0,05 g·l-1 in H2SO4 (0,07 g·l-1 in acido acetico)

Riproducibilità inter-laboratorio: 0,10 g·l-1 in H2SO4 (0,14 g·l-1 in acido acetico)

1.6 Bibliografia DUBERNET M. Dosage automatique de l’acidité volatile dans les vins. Connaiss. Vigne et Vin, 1976,10,3, 297-309.

PILONE G.J. Effect of lactic acid on volatile acid determination of wine. J. of Oenol. 1967,18, 149-156.

SARIS J., MORFAUX J.N., DERVIN L. Détermination automatique de l’acidité volatile du vin. Ind. Alim. Agric., 1970, 87, 115-121.

1.7 Allegati : Esempi di diagrammi di flusso

1.7.1 Blu di Bromofenolo




1.7.2 Ioduro di potassio

2 Valutazione del tenore degli acidi L-malico e L-lattico nei vini e nei mosti

2.1 Principio In presenza di nicotinamide-adanina-dinucleotide (NAD), l’acido è ossidato in una reazione catalizzata dal suo enzima specifico:

la malato-deidrogenasi (MDH) nel caso dell’acido malico, la lattato-deidrogenasi (LDH) nel caso dell’acido lattico.

Si tratta di una reazione di equilibrio che si sposta nel senso della formazione di NADH con un tampone di idrazina basica e un eccesso di NAD

MDH L-malato + NAD+ <==> ossalacetato di idrazone + NADH + H+

LDH L-lattato + NAD+ <==> piruvato di idrazone + NADH + H+

La quantità di NADH è proporzionale alla concentrazione in acido del campione. Il suo assorbimento è misurato a 340 nm.

2.2 Apparecchiatura Catena a flusso continuo segmentato.

2.3 Reagenti

2.3.1 Brij 35 (N° CAS[9002-92-0]) 30% (p/v)




2.3.2 Tampone pH 9,5 circa Per 500 ml:

Glicina pura (N° CAS[56-40-6]) 38 g Solfato di idrazina (N° CAS[10034-93-2]) 26 g EDTA (N° CAS[60-00-1]) 1,0 g Idrossido di sodio (N° CAS[1310-73-2]) 20 g Brij 35 30 % 5 gocce Acqua bidistillata fino a 500 ml.

Filtrare se necessario. Conservazione massima 2 mesi a +4°C.

2.3.3 NAD, MDH e LHD β Nicotinamide adenina dinucleotide (forma ridotta) (NAD) (N° CAS [53-84-9]) di purezza

≥ 98% MDH sospensione in solfato di ammonio (N° CAS [9001-64-3]) LDH sospensione in solfato di ammonio (N° CAS [9001-60-9])

Conservazione: Flacone MDH o LDH non iniziato a -20 °C fino alla data di scadenza. Flacone iniziato +4 °C al massimo 6 mesi o fino alla data di scadenza. La polvere di NAD si conserva a secco a +4 °C fino alla data di scadenza.

2.3.4 Soluzioni enzimatiche per l’analisi Soluzione NAD a 100 mg per 10 ml d’acqua bidistillata. Soluzione di MDH o LDH: 100 µl in 10 ml d’acqua bidistillata. Le quantità da preparare sono

in funzione della durata dell’analisi. Conservazione: una settimana a +4 °C.

2.3.4.1.1 Soluzioni di riferimento di acido L-malico (N° CAS[97-67-6]) o L-lattico (N° CAS[79-33-4]) da 0,5 a 5 g/l

2.4 Modo operativo In allegato si fornisce il diagramma dei flussi.

I campioni non subiscono alcun trattamento preliminare. Nel caso di campioni contenenti materiali in sospensione, è indispensabile una centrifugazione.

La cadenza analitica è di almeno 30 campioni l’ora con tempo di prelievo/tempo di risciacquo = 1/1.

Nota: Per i vini rossi molto colorati, si sottrarrà all’assorbimento misurato quello dovuto alla colorazione del vino a 340 nm, con passaggio di campioni senza l’enzima nei reagenti ma mantendo il coenzima NAD.

2.5 Espressione dei risultati I risultati sono espressi in grammi per litro con un decimale

2.6 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità interlaboratorio: 0,15 g·l-1

2.7 Bibliografia Battle, J.-L. et Bouvier, J.C., Automatisation de dosages enzymatiques pour l’analyse oenologique, Revue Française d’Oenologie (Cahier Scientifique), 1986, 26, (101) : 38-43.




Battle, J.-L., Joubert, R., Collon, Y. et Giornoet, C., Dosage enzymatique en flux continu du L-malate et du L-lactate dans les moûts de raisin et les vins, Ann. Fais. Exp. Chim., 1978, 71(766) : 223-228.

Curvelo-Garcia, A. S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées à l’analyse des vins et des moûts, Feuillet Vert de 1’OIV n° 941 (1993).

2.8 Allegato : Esempio di diagramma dei flussi

3 Valutazione del tenore dell’acido tartarico nei vini e nei mosti.

3.1 Principio Il metodo di Rebelein si applica su campioni di vino dializzati per sviluppare un colore rosso aranciato a caldo (37°C) con il metavanadato di sodio in ambiente alcalino. L’assorbimento è misurato a 520 nm. Forti tenori di acido malico e zucchero possono interferire.

3.2 Apparecchiatura. Catena a flusso continuo segmentato.

3.3 Reagenti

3.3.1 Brij 35 (N° CAS[9002-92-0]) 30% p/v

3.3.2 Acido acético (CH3COOH) (N° CAS[64-19-7]) puro.

3.3.3 Soluzione di acetato di sodio (NaCH3COO) (N° CAS[127-09-3]) al 27%.

3.3.4 Vanadato di ammonio (NH4 VO3) (N° CAS[7803-55-6])

ml/mn




3.3.5 Soluzione N di idrossido di sodio (NaOH) (N° CAS[1310-73-2])

3.3.6 Soluzione acida di acetato di sodio acido acetico 80 ml acetato di sodio 27% 320 ml Poliossietilene (35) Lauril Etere 30 % 1 ml acqua distillata fino a 1000 ml

Conservazione: 1 settimana.

3.3.7 Soluzione di metavanadato di sodio. vanadato di ammonio 4 g soluzione NaOH M 150 ml acetato di sodio 27% 200 ml acqua distillata fino a 500 ml.


3.3.8 Soluzioni di riferimento di acido D(+)-tartarico (N° CAS[147-71-7]) da 1 a 8 g/l.

3.4 Modo operativo. In allegato si riporta il diagramma dei flussi.

I campioni non subiscono alcun trattamento preliminare. Nel caso di mosti o altri campioni contenenti materiali in sospensione, è indispensabile una centrifugazione.

La cadenza analitica è di 30 campioni l’ora (tempo di prelievo/tempo di risciacquo = 1/1).

3.5 Espressione dei risultati . I risultati sono espressi in grammi per litro con un decimale.

3.6 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità interlaboratorio: 0,7 g·l-1

3.7 Bibliografia Battle, J.-L., Joubert, R., Colion, Y. et Giornoet, C., Utilisation du flux continu pour le dosage colorimétrique de l’acide tartrique dans les moûts de raisin et les vins par la méthode de Rebelein, Ann. Fals. Exp. Chim., 1978, 71(764), 155-158.

Curvelo-Garcia, A.S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées àl’analyse des vins et des moûts, Feuillet Vert de l’OIV N°941 (1993).

Trossais J. et Asselin C. Influence des teneurs en acide malique des moûts sur le dosage de l’acide tartrique par analyse en flux continu par colorimétrie avec le métavanadate. Conn. Vigne Vin. 1985, 19, 4, 249-259.




3.8 Allegato: Esempio di diagramma dei flussi

4 Valutazione del tenore dell’acido citrico nei vini e nei mosti

4.1 Principio Il metodo automatico per la determinazione fluorimetrica dell’acido citrico è basato sul metodo della dicicloesilcarbodiimide (DCC). Il campione reagisce con la DCC in presenza di acido acetico in ambiente anidro, che provoca la formazione di aconitina. La lunghezza d’onda di trasmissione dell’aconitina è di 490 nm, mentre la lunghezza d'onda di eccitazione è di 400 nm. Il segnale dato dal fluorimetro viene inviato a un’interfaccia collegata al software di sistema.

4.2 .Apparecchiatura

Catena a flusso segmentato.


4.3.1 Soluzione di cloruro di sodio (NaCI)

Cloruro di sodio (NaCl) N° CAS [7647-14-5], 4,0 g Acido acetico (CH3COOH) N° CAS[64-19-7], 180 cm3




Etanolo (CH3CH2OH) N° CAS[64-17-5], 20 cm3 Soluzione di acido citrico 10,0 g/dm3, 30 cm3 Acqua di tipo I (Norma ISO 3696) o equivalente fino a 2000 cm3 Brij 35 (30%) N °CAS [9002-92-0], 6 cm3 Preparazione: In una fiala graduata da 2000,0 cm3, sciogliere il cloruro di sodio in circa 1600 cm3 d'acqua. Aggiungere delicatamente l’acido e lasciare a riposo fino a raggiungimento della temperatura ambiente. Aggiungere l’etanolo e la soluzione di acido citrico e mescolare. Aggiungere fino alla marcatura dell’acqua demineralizzata, quindi il Brij e mescolare. Conservazione: 6 mesi

4.3.2 3. 2-1-butanolo (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3]

4.3.3 Soluzione di acido acetico all’1,7% (v/v)

Acido acetico (CH3COOH) N° CAS[64-19-7], 17 cm3 1-butanolo (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3] fino a 1000 cm3 Preparazione: Nel flacone 1-butanolo (1 litro), aggiungere con precauzione l’acido. Mescolare bene. Conservazione: 1 anno.

4.3.4 Soluzione Dicicloesilcarbodiimide (DCC)

Dicicloesilcarbodiimide (C13H22N2) N° CAS [538-75-0], 41 g 1-butanolo (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3] fino a 1000 cm3 Preparazione: Pesare la Dicicloesilcarbodiimide in una fiala conica da 1000 cm3 e aggiungere l’n-butanolo. Mescolare bene. Conservazione: 1 anno.

4.3.5 Brij 35 N° CAS [9002-92-0]

4.3.6 Soluzione di decontaminazione

1-butanolo (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3]

4.4 Preparazione del campione

Disaerare il campione per eliminare il più possibile il biossido di carbonio tramite lo

spazio vuoto, agitando per almeno 2 minuti. Se il campione è torbido, è necessario

filtrarlo.

4.5 Soluzioni di verifica

4.5.1 Soluzioni di acido citrico (C6H8O7) N° CAS[77-92-9], da 0,07 a 1,00 g/dm3 in acido citrico

Conservazione: la stabilità è data dal controllo interno della verifica.

4.5.2 Campioni di controllo di concentrazione conosciuta dell’acido citrico.

Conservazione: 1 mese o dal controllo interno




4.6 Modo operativo

In allegato si riporta il diagramma dei flussi. La cadenza di analisi è di circa 18 campioni l’ora secondo la configurazione utilizzata.

4.7 Risultati

I risultati sono presentati a due decimali ed espressi in g (acido citrico) ·l-1.

4.8 Caratteristiche del metodo descritto

Ripetibilità: 0,03 g (acido citrico)· l-1 Riproducibilità intralaboratorio: 0,03 g (acido citrico) ·l-1 Incertezza: uexp = 0,20 x concentrazione del campione in g (acido citrico) ·l-1.

4.9 Allegato: Esempio di diagramma dei flussi

DCC

n-butanol

* Membrane de dialyse, Ref SA5283

** Tubes à la bombe en aciflex

air

chlorure de sodium

Evier

Fluorimètre

Émission 490 nm

L'extinction à 400 nm

2 mm d'épaisseur de cellule

Samplerevier

o

evier

Pompes Debits

ml/min

échantillon

air

Acide acétique




5 Valutazione del tenore degli zuccheri riduttori nei vini e nei mosti

5.1 Principio Il metodo di dosaggio permette di determinare separatamente la concentrazione in glucosio e in fruttosio o la somma di queste due concentrazioni nei vini o nei mosti.

5.1.1 Fosforilazione del glucosio e del fruttosio Questa reazione è catalizzata tramite esochinasi (HK):

HK glucosio + ATP <==> glucosio-6-fosfato + ADP (1)

HK fruttosio + ATP <=> fruttosio-6-fosfato +ADP

ATP : adenosina trifosfato ADP : adenosina difosfato

5.1.2 Ossidazione del glucosio-6-fosfato (G-6-P) Si ottiene tramite l’azione della nicotinamide adenina dinucleotide fosfato (NADP), in presenza del suo enzima specifico glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH).

G6PDH G-6-P + NADP+ <==> gluconato-6-fosfato + NADPH + H+ (2)

La reazione d’equilibrio è spostata nel senso della formazione di NADPH, grazie alla scelta delle condizioni operative (tampone pH 7,6 e eccesso di NADP). Il NADPH proporzionale alla concentrazione in glucosio nel campione è dosato misurando il suo assorbimento a 340 nm.

5.1.3 Isomerizzazione del fruttosio-6-fosfato Questa reazione permette di dosare la somma glucosio + fruttosio.

L’enzima utilizzato è il fosfoglucosio-isomerasi (PGI).

PGI fruttosio-6-fosfato <==> glucosio-6-fosfato (3)

Il glucosio-6-fosfato formato reagisce con il NADP secondo (2) per formare NADPH, che si dosa a 340 nm.

5.2 Apparecchiatura Catena a flusso continuo segmentato.

5.3 Reagenti e soluzioni Esistono sul mercato numerosi fornitori che propongono cofanetti contenenti i reagenti preparati. Qui di seguito sono forniti alcuni esempi tra i tanti.

5.3.1 Flacone 1: Liofilizzato composto di:

Tampone trietanolammina pH = 7,6 NADP (N° CAS[53-59-8]) 64 mg ATP (N° CAS[987-65-5]) 16O mg Solfato di magnesio MgSO4 (N° CAS[7487-88-9]) Stabilizzatori




5.3.2 Flacone 2: 0,7 ml di sospensione enzimatica composta da:

Esochinasi (N° CAS[9001-51-8]) circa 200 U Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (N° CAS[9001-40-5]) 100 U in soluzione in solfato

d’ammonio

5.3.3 Flacone 3 : 0,7 ml di fosfoglucosio-isomerasi (N° CAS[9001-41-6]) (circa 490 U) in sospensione in solfato d’ammonio.

5.3.4 Flacone 4 : 7 ml di soluzione standard di D-glucosio (N° CAS[50-97-7]) a 0,5 g-1. Conservazione del cofanetto non iniziato a -20 °C fino alla data di scadenza.

5.3.5 Soluzione tampone NAD/ATP Si prepara a partire dal cofanetto enzimatico:

Sciogliere il contenuto del flacone 1 in 90 ml di acqua bidistillata.

Conservare il tampone diluito a -20 °C al massimo per 3 mesi.

5.3.6 Preparazione di soluzioni di enzimi per il dosaggio Esempio di volumi da preparare per la configurazione:

Dosaggi

Fruttosio e glucosio + fruttosio

Glucosio Durata dell’analisi tampone NAD/ATP HK/G6PDH PGI 1 ora 15 ml 100 µl 100 µl 4 ore 60 ml 500 µl 500 µl 8 ore 120 ml 1000 µl 1000 µl Il dosaggio del fruttosio richiede due passaggi dei riferimenti e campioni, il tempo di analisi raddoppia rispetto al dosaggio del glucosio.

Conservazione delle soluzioni di enzimi per il dosaggio: una settimana a +4°C.

5.3.7 Soluzioni campione

5.3.7.1 Soluzione madre a 10,0 g/l L’utilizzo del solo glucosio è sufficiente per la campionatura: l’isomerizzazione del fruttosio si eseguirà unicamente per i campioni.

D-glucosio anidro 2,50 g Acqua distillata fino a 250 ml Isotiocianato d’allile (conservante) (N° CAS[57-06-7]) 2 gocce.

5.3.7.2 Soluzioni derivate di glucosio: Campione da 3 g/l : 15 ml di soluzione madre in una fiala da 50 ml Campione da 2 g/l : 10 ml di soluzione madre in una fiala da 50 ml Campione da 1 g/l : 10 ml di soluzione madre in una fiala da 100 ml

Queste soluzioni sono poi completate fino alla tacca di gradazione con acqua distillata.

Campione da 0,50 g/l: soluzione standard del cofanetto enzimatico Conservazione: a + 4 °C per 1 mese.




5.4 Modo operativo In allegato si riporta il diagramma dei flussi.

La cadenza analitica è di 60 campioni ogni ora con un tempo di prelievo/risciacquo = 1/1.

I campioni non subiscono alcun trattamento preliminare. Nel caso di mosti o campioni contenenti materiali in sospensione, è indispensabile un filtraggio preliminare.

5.5 Espressione dei risultati La concentrazione in glucosio, in fruttosio o in glucosio + fruttosio è data in g·l-1 con un decimale.

5.6 Bibliografia Battle J.L., Bouvier J.C. Rev. Fr. Oenol., 1986, 101, 38-43.

5.7 Allegato: esempio di diagramma dei flussi




6 Valutazione del tenore del biossido di zolfo libero e totale nei vini e nei mosti dopo dialisi.

6.1 Principio Dopo l’acidificazione del vino, il biossido di zolfo libero si diffonde attraverso una membrana di dialisi. Il biossido di zolfo combinato è liberato con una idrolisi alcalina. I due dosaggi si effettuano a 560 nm in presenza di para-rosanilina (o fucsina basica). La segmentazione si esegue con l’azoto per evitare qualsiasi ossidazione.

SO2 + rosanilina —> complesso incolore + formaldeide —> complesso colorato.

Il metodo è applicabile per una gamma dal LOQ a 200 mg·l-1.

6.2 Apparecchiatura Catena a flusso segmentato.


6.3.1 Reagente specifico per il dosaggio del biossido di zolfo libero

6.3.1.1 Soluzione al 10 % di acido solforico (purezza 98%) H2SO4 (N° CAS[57-06-7]) 20 ml Acqua distillata fino a 200 ml.

6.3.2 Reagenti specifici per il dosaggio del biossido di zolfo totale

6.3.2.1 Soluzione di idrossido di sodio 4 M NaOH (N° CAS[1310-73-2]) 40 g Acqua distillata fino a 250 ml.


6.3.2.2 Soluzione di acido solforico (N° CAS[57-06-7]) al 1/2 (v/v) Conservazione: 1 mese.

6.3.3 Reagenti comuni

6.3.3.1 Azoto tipo R (N° CAS[7727-37-9])

6.3.3.2 Soluzione di acido solforico (N° CAS[57-06-7]) a 1% (v/v) Conservazione: 1 mese.

6.3.3.3 Soluzione di formaldeide al 6% (v/v) Formaldeide al 37% minimo (N° CAS[50-00-0]) 1,2 ml Acqua distillata fino a 200 ml.

Conservazione: 1 giorno in flacone chiuso.

6.3.3.4 Rosanilina (reagente colorato). Soluzione madre: 2 g/l di fucsina basica (o cloridrato di rosanilina) (N° CAS[632-99-5]) Agitare, poi lasciare a riposo per 3 giorni e conservare al riparo dalla luce. Conservazione: 3 mesi in bottiglia leggermente colorata.

Soluzione di lavoro - soluzione madre 40 ml - acido ortofosforico (N° CAS[7664-38-2]) 62 ml - acqua distillata fino a 500 ml.

Conservazione: 2 settimane in bottiglia leggermente colorata. Nota: Questa preparazione è fortemente esotermica. Adottare le precauzioni d’uso.




6.3.4 Soluzioni campione sintetiche

6.3.4.1 Soluzione acida a pH 3 circa.

H2SO4 1 % (N° CAS[57-06-7]) 5ml Acqua distillata fino a 1000 ml. Questa soluzione servirà a completare le fiale campione di SO2.


6.3.4.2 Soluzione madre a 300 mg·l-1 di SO2

Disolfito di sodio puro (N° CAS[7681-57-4]) 227 mg soluzione pH 3 fino a 500 ml. Conservazione: 1 giorno.

6.3.4.3 Soluzioni campione derivate. Esempio di preparazione di una soluzione campione a 120 mg·l-1:

soluzione madre a 300 mg·l-1 50 ml soluzione pH3 40 ml acqua distillata fino a 125 ml.

6.3.5 Vini di riferimento Vini di riferimento o controllati con il metodo di riferimento.

6.4 Modo operativo In allegato si forniscono i diagrammi dei flussi. I campioni non subiscono alcun trattamento preliminare. La cadenza analitica può arrivare a 60 campioni ogni ora con un tempo risciacquo/prelievo = 2/1 Nota:

Al termine dell’analisi, sciacquare il circuito analitico con l’acqua per almeno 10 min. Ogni qualvolta sia necessario, lavare il circuito con candeggina a 1/20 per almeno 30 minuti. Sciacquare con acqua per almeno 2 h.

6.5 Espressione dei risultati I valori in biossido di zolfo si esprimono in mg per litro senza decimali.

6.6 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità inter-laboratorio diossido di zolfo libero: 7 mg·l-1

Riproducibilità inter-laboratorio diossido di zolfo totale: 27 mg·l-1

6.7 Bibliografia DUBERNET M., 1997. L’automatisation de l’analyse chimique en œnologie. Revue Française d’Œnologie, 66, 45-61. Scholten G., Woller R., Holbach B. Automatisierte weinanalyse, 2. Mittteilung. Die Wein. Wiss., 1982, 38, 397-426.




6.8 Allegato : Esempi di diagramma dei flussi




7 Valutazione del tenore del biossido di zolfo libero e totale nei vini e nei mosti tramite distillazione

7.1 Principio

Si utilizza diffusamente anche un’alternativa al metodo precedente. Consiste nel sostituire la dialisi con una distillazione in una micro colonna. Nel caso del biossido di zolfo totale, non si esegue più l’idrolisi alcalina: la liberazione della totalità del biossido di zolfo è assicurata da un’acidificazione più spinta e da una temperatura di distillazione superiore.


7.2.1 Reagente specifico per il dosaggio del biossido di zolfo libero

7.2.1.1 Soluzione all’1% di acido solforico (purezza 98%) H2SO4 (N° CAS[57-06-7]) 2 ml Acqua distillata fino a 200 ml.

7.2.2 Reagenti specifici per il dosaggio del biossido di zolfo totale

7.2.2.1 Soluzione di acido solforico (N° CAS[57-06-7]) al 20 % (v/v) Conservazione: 1 mese.

7.2.3 Reagenti comuni

7.2.3.1 Azoto tipo R (N° CAS[7727-37-9])

7.2.3.2 Soluzione di acido solforico (N° CAS[57-06-7]) all’1% (v/v) con aggiunta di 4 gocce ogni litro di tensioattivo Brij 35 (N° CAS[9002-92-0])

Conservazione: 1 mese.

7.2.3.3 Soluzione di formaldeide Formaldeide al 40% (N° CAS[50-00-0]) 10 ml Acqua distillata fino a 1000 ml.

Conservazione: 1 giorno in flacone chiuso.

7.2.3.4 Soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 0,2 M

Idrossido di sodio (N° CAS[1310-73-2]) 4 g Brij 35 (N° CAS[9002-92-0]) 2 gocce Acqua distillata fino a 500 ml.

7.2.3.5 Rosanilina (reagente colorato) Soluzione madre: 2 g/l di fucsina basica (o cloridrato di rosanilina) (N° CAS[632-99-5])

Agitare poi lasciare a riposo per 3 giorni e conservare al riparo dalla luce.

Conservazione: 3 mesi in bottiglia leggermente colorata.

Soluzione di lavoro soluzione madre 70 ml acido ortofosforico H3PO4 (N° CAS[7664-38-2]) 70 ml acqua distillata fino a 500 ml. Conservazione: 2 settimane in bottiglia leggermente colorata. Nota: Questa diluizione è fortemente esotermica. Adottare le precauzioni d’uso.




7.2.4 Soluzioni campione sintetiche

7.2.4.1 Soluzione acida con pH 3 circa.

H2SO4 1 % (N° CAS[57-06-7]) 5 ml Acqua distillata fino a 1000 ml. Questa soluzione servirà a completare le fiale campione di SO2.


7.2.4.2 Soluzione madre a 300 mg·l-1 di SO2

Bisolfito di sodio puro Na2S2O5 (N° CAS[7681-57-4]) 227 mg soluzione pH 3 fino a 500 ml. Conservazione: 1 giorno.

7.2.4.3 Soluzioni campione derivate. Esempio di preparazione di una soluzione campione a 120 mg·l-1:

soluzione madre a 300 mg·l-1 50 ml soluzione pH3 40 ml acqua distillata fino a 125 ml.

7.2.5 Campioni di vini Vini di riferimento o controllati con il metodo di riferimento.

7.3 Espressione dei risultati I valori in biossido di zolfo si esprimono in mg per litro senza decimali.

7.4 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità inter-laboratorio diossido di zolfo libero: 7 mg·l-1

Riproducibilità inter-laboratorio diossido di zolfo totale: 27 mg·l-1




7.5 Allegato: Esempi di diagrammi dei flussi Dosaggio del biossido di zolfo libero

ml/mn

0,80

0,32

0,32

0,60

1,60

0,05

2,50

1,20

1,40

0,16

5 giri Colorimetro

560 nm

Ripristino colorimetro

5 giri

Cadenza: 90 camp. / ora Rapporto prelievo /risciacquo: 1/1

Azoto per segmentazione

H2SO4 1%

Campione

20 giri

Bagno-maria 48° C ± 5° C

Colonna di distillazione

Pompa

lavello

NaOH 0,2 M

Formaldeide

Azoto per alimentazione

Portata: 40 ml/mn Refrigerante

(acqua fredda)

H2SO4 1% + Brij

Para-rosanilina

5 giri 5 giri

0,05 Azoto per segmentazione




Dosaggio del biossido di zolfo totale

Bagno-maria 105° C ± 5° C

ml/mn

0,80

0,32

0,32

0,60

1,40

0,05

2,00

1,20

1,40

0,16

5 giri colorimetro

560 nm

Ripristino colorimetro

Cadenza: 90 camp. / ora Rapporto prelievo /risciacquo: 1/1

Azoto per segmentazione

H2SO4 10%

Campione

20 giri

Colonna di distillazione

Pompa

lavello

NaOH 0,2

Formaldeide

Azoto per alimentazione Portata: 40

H2SO4 1% + Brij

Para-rosanilina

3 x 20 giri

Refrigerante (acqua fredda)

0,05 Azoto per segmentazione




ALLEGATO 2

ESEMPI DI METODI DI DOSAGGI ABITUALI IN ENOLOGIA CON ANALIZZATORI SEQUENZIALI

I metodi descritti di seguito sono forniti a titolo puramente esemplificativo, poiché non sono gli unici adoperabili.

1 Dosaggio dell’acido acetico nei vini e nei mosti

1.1 Principio Metodo enzimatico. In presenza di ATP, l’acido acetico si trasforma in acetil-fosfato con una reazione catalizzata tramite l’acetato chinasi.

(1) Acetato + ATP —Acetato chinasi Acetil-fosfato + ADP

L’ADP formato da questa reazione è ritrasformato in ATP tramite reazione con fosfoenolpiruvato in presenza di piruvato chinasi.

(2) ADP + fosfoenolpiruvato —Piruvato chinasi Piruvato + ATP

Il piruvato è ridotto in L-lattato tramite la nicotinamide-adenina-nucleotide ridotta (NADH) in presenza di lattato-deidrogenasi.

(3) Piruvato + NADH + H+ —Lattato deidrogenasi Lattato + NAD+ + H2O

La quantità di NADH ossidato in reazione (3) è determinata dalla misura dell’assorbimento a 340 nm, ed è proporzionale alla concentrazione del vino in acido acetico.

Una quarta reazione permette di mantenere l’equilibrio della reazione 1 nel senso della formazione di acetilfosfato tramite eliminazione di quest’ultimo.

(4) Acetil-fosfato + CoA —Fosfotransacetilasi Acetil-CoA + Fosfato inorganico

All’ambiente di reazione si aggiunge polivinilpirrolidone (PVP) per eliminare le interferenze dovute ai composti fenolici del vino.

1.2 Reagenti

1.2.1 Preparazione del tampone MOPS Aggiungere:

13 g di MOPS (Acido N-morfolino-3-propano sulfonico) CAS [1132-61-2] 500 mg di Cloruro di magnesio, 6H2O - CAS [7791-18-6] 1,5 g di Cloruro di potassio (KCl) - CAS [7447-40-7] 250 ml di acqua bidistillata Aggiustare il pH a 4,75 con una soluzione 1,5 M di idrossido di potassio (KOH) - CAS [1310-58-3].

Attendere 5 minuti e riaggiustare nuovamente il pH a 7,45. Riempire fino a 300 ml con acqua bidistillata. Stabilità del tempone: 60 giorni a ± 4 °C.




1.2.2 Preparazione dei reagenti

1.2.2.1 Reagente 1 (R1) : Aggiungere a 100 ml di tampone MOPS 400 mg di Polivinilpirrolidone (PVP) - CAS [9003-39-8].

1.2.2.2 Reagente 2 (R2) Aggiungere a 100 ml di tampone MOPS :

Da 300 a 350 mg di adenosina-5-trifosfato, sale disodico (ATP) - CAS [987-65-5] 50 mg di Fosfo-enolpiruvato di tricicloesilammonio (PEP) - CAS [35556-70-8] 38 mg di β Nicotinamide adenina dinucleotide (forma ridotta) (NADH) - CAS [606-68-8] - Purezza ≥ 98% 25 mg di Sale di trilitio di coenzima A - CAS [18439-24-2] –purezza 2 400 unità circa di piruvato chinasi (PK) - CAS [9001-60-9] e Lattato deidrogenasi (LDH) - CAS [9001-60-9] 600 unità circa di di Fosfotransacetilasi (PTA) - CAS [9029-91-8] 230 unità di Acetato chinasi (AK) - CAS [9027-42-5] Stabilità del reagente: circa 12 ore a + 4 °C.

1.3 Preparazione dei campioni I campioni dei vini sono precedentemente diluiti al 1/10.

1.4 Procedura analitica Può variare in funzione del materiale utilizzato. La seguente descrizione deve essere considerata come esempio.

Il volume delle vaschette di reazione è di 300 µl. Il ciclo analitico è di 10 minuti, ossia 50 giri del vassoio di reazione. Ogni 12 secondi, ossia a ogni giro del vassoio di reazione, si esegue una lettura colorimetrica per poter tracciare la curva di reazione.

1.4.1 Programmazione La lunghezza d’onda di lettura è di 340 nm. Il volume di campione diluito al 1/10, aggiunto al tempo zero è di 20 µl. Il volume di reagente R1 aggiunto a tempo zero è di 111 µl. Il volume di reagente R2 aggiunto allo scadere di 5 minuti è di 125 µl. Il volume di reazione totale è quindi di 256 µl.

1.4.2 Taratura La taratura è realizzata in 4 punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione al 9‰ di cloruro di sodio - CAS [7647-14-15]. Gli altri tre agenti di taratura sono soluzioni con concentrazioni crescenti di acido acetico puro - CAS [64-19-7] (0,25 g·l-1 ; 0,50 g·l-1 ; 1 g·l-1) o di vini campione con concentrazione nota di acido acetico.

1.4.3 Risultati La figura riportata qui sotto fornisce un’illustrazione della curva di reazione ottenuta.




Nelle condizioni della misurazione adottata, la curva di reazione osservata dopo l’aggiunta del reagente R2, nella scala di lavoro considerata (da 0 a 1 g/l) è una retta. Rivela la velocità iniziale di reazione, proporzionale alla concentrazione di acido acetico. La misura della pendenza di questa retta si può fare con una lettura in due momenti ai giri n° 27 e n° 50. Il valore della concentrazione di acido acetico sarà dato dalla formula:

C = K (L1-L2)

Nella quale K è un fattore di reazione calcolato dall’apparecchio dopo ogni taratura secondo la formula seguente:

K CEt CB

AEt AB

Dove:

AB = assorbanza del bianco

CB = concentrazione del bianco

AEt = assorbanza del campione

CEt = concentrazione del campione




I risultati sono espressi in g·l-1 di acido acetico.

1.5 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità intralaboratorio: 0,04 g·l-1

Riproducibilità interlaboratorio: 0,10 g·l-1

1.6 Bibliografia DONECHE B., et SANCHEZ P.J., 1985 : Automatisation en flux continu du dosage enzymatique de l’Acido aceticodans les vins, Connaissance de la vigne et du vin, 1985 ; n°3, 161-169. DUBERNET M., PENNEQUIN F. et GRASSET F., 1997 Adaptation du dosage de l’Acido aceticodans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717, Feuillet vert OIV N°1001 McCLOSKEY Leo P., 1980 : An improved enzymatic assay for acetate in juice and wine, Am. J. Enol. Vitic. Vol 31, N° 2, 1980, pp 170-173.

2 Dosaggio del biossido di zolfo totale nei vini e nei mosti

2.1 Principio Metodo chimico Il campione da dosare è diluito in una soluzione tampone di fosfato con pH8. Dopo la stabilizzazione, il mezzo di reazione riceve una soluzione tamponata di acido DTNB (5,5’-Ditio-bis(2-acido nitrobenzoico) (3,3’-6) o Bis(3-Carbossi-4-nitrofenil) disolfuro, conosciuta con il nome di «reagente di Ellman». Si tratta di un reagente specifico che permette la modifica e la rilevazione quantitativa dei legami disolfuri la cui formula sviluppata è fornita qui sotto:

OH

OH

O

O

O2N

NO2

SS

La reazione sviluppa una colorazione gialla misurabile a una lunghezza d’onda di 405 nm.

2.2 Protocollo di misurazione

2.2.1 Materiale Può essere usato qualsiasi materiale di analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di due reagenti e che consenta una misurazione a 405 nm.




2.2.2 Reagenti Si adottano due reagenti:

Reagente 1 K2HPO4 (CAS [7758-11-4]) 17,4 g Acqua bidistillata fino a 1000 ml Il pH della soluzione tampone così preparata è aggiustato con l’aggiunta di H3PO4 puro (CAS [7664-38-2]) per ottenere un valore di 8 (scarto minimo tollerabile: ± 0,2 unità pH).

Reagente 2 DNTB (CAS [69-78-3]) 760 mg Reagente 1 900 ml Etanolo puro 100 ml

2.2.3 Implementazione La seguente tabella riassume le diverse quantità di campioni di vino e di reagenti da aggiungere nella vaschetta di reazione durante il tempo dell’analisi:

Tempo in minuti

Campione in µl

Reagente 1 in µl

Reagente 2 in µl

Acqua bidistillata in µl

0 8 80 170 5 80

La lettura dell’assorbimento a 405 nm si esegue regolarmente durante un periodo di tempo della durata totale di 10 minuti, ma che può essere eventualmente abbreviato tenuto conto della rapidità di reazione che è praticamente istantanea. Il grafico seguente mostra il tipo di curva di reazione ottenuta:

Courbe réactionnelle

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

12 36 60 84

108

132

156

180

204

228

252

276

300

324

348

372

396

420

444

468

492

516

540

564

588

Temps en secondes

Dopo l’aggiunta del reagente N° 1, la stabilizzazione è rapida. L’aggiunta del reagente N° 2 contenente il DNTB è seguita da una reazione colorata immediata il cui plateau viene raggiunto in pochi secondi. In seguito rimane stabile. La lettura si esegue per differenza tra assorbimento DO 1




rilevato dopo la stabilizzazione del reagente N°1 e l’assorbimento DO 2 rilevato sul plateau. Questa differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di SO2 totale del campione esaminato.

La taratura è realizzata sia con vini campione i cui valori di SO2 totale sono noti e coprono la gamma di misurazione considerata, sia con l’aiuto di soluzioni di metabisolfito di potassio (N° CAS[16731-55-8]) stabilizzate in mezzo solforico all’1% e di concentrazione nota. In generale, non essendo la curva di taratura del tutto lineare, occorrono da 4 a 5 punti di taratura. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰.

2.3 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità intra-laboratorio: 12 mg·l-1

Riproducibilità inter- laboratorio: 20 mg·l-1

2.4 Bibliografia ELLMAN G.L., 1959. For the modification and quantitative detection of sulfhydryl groups ; Arch. Biochem. Biophys. 82,70.

DUBERNET M., LEBOEUF J.P. et GRASSET F., 1998. Méthode automatisée de dosage colorimétrique du dioxyde de soufre total dans les vins. FV N° 1068 OIV.

DUBERNET M., PENNEQUIN F. et GRASSET F., 1995. Adaptation du dosage du dioxyde de soufre total dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717. FV N° 997 OIV.

3 Dosaggio del biossido di zolfo libero nei vini e nei mosti

3.1 Principio Metodo chimico Il biossido di zolfo libero è stabilizzato in mezzo acido. Il suo dosaggio è assicurato tramite lo sviluppo, in presenza di formaldeide, di una colorazione rosa in combinazione con la Fucsina precedentemente decolorata in mezzo fosforico. Il dosaggio è corretto da una reazione parassita dovuta ai componenti fenolici presenti nel vino.

3.2 Materiale Può essere usato qualsiasi materiale di analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di due reagenti e che consenta una misurazione a 570 nm.

3.3 Reagenti Si adottano due reagenti:

3.3.1 Reagente 1

3.3.1.2 Soluzione madre di Fucsina basica (Cloridrato di rosanilina) Cloridrato di rosanilina (N° CAS[632-99-5]) 2g Acqua bidistillata fino a 1000 ml Conservazione: 6 mesi nel frigorifero

3.3.1.2 Soluzione di lavoro (R1) Soluzione madre di Fucsina basica 3 ml Acido fosforico (CAS [7664-38-2]) al 10% 77 ml Acqua bidistillata 20 ml Conservazione: 5 giorni a 4° C e al riparo dalla luce.




3.3.2 Reagente 2 Formaldeide (N° CAS[50-00-0]) 5 ml Acqua bidistillata fino a 1000 ml Conservazione: 1 settimana a temperatura ambiente.

3.4 Preparazione dei campioni I campioni di vino non sono diluiti. Si raccomanda di procedere all’analisi il più rapidamente possibile dopo il prelievo per evitare le perdite di biossido di zolfo libero.

3.5 Procedura analitica La lunghezza d’onda della lettura è di 570 nm.

La sequenza analitica è la seguente:

Giro 1 (6 secondi): prelievo dal campione di vino di 20 µl Giro 1 (12 secondi): aggiunta di 250 µl di reagente R1 Giro 24 (288 secondi): lettura DO1 a 570 nm Giro 25 (300 secondi): aggiunta di 106 µl di reagente R2 Giro 28 (336 secondi): lettura DO2 a 570 nm

3.6 Taratura Si realizza in due punti. Il valore zero è ottenuto con l’utilizzo di una soluzione di cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰. Il valore standard è dato da una soluzione regolarmente titolata di metabisolfito di potassio (N° CAS[16731-55-8]) stabilizzata in mezzo solforico all’1% e dalla concentrazione di 50 mg·l-1 circa.

3.7 Lettura dei risultati Il seguente schema mostra l’evoluzione dell’assorbanza a 570 nm.




Si è constatato che la miscela di vino con la soluzione di fucsina provoca una prima reazione colorata che porta a un aumento dell’assorbimento (reazione N° 1). L’importanza di quest’ultimo è proporzionale alla ricchezza di componenti fenolici nel vino e rappresenta un effetto parassita. La reazione N°2 interviene dopo l’aggiunta del reagente R2 e corrisponde strettamente alla combinazione del biossido di zolfo libero e della fucsina. Si deve tenere conto solo quest’ultima. La lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento di base DO 1 e l’assorbimento DO 2. Questa differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di SO2 libero del campione preso in considerazione.

3.8 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità intra-laboratorio: 6 mg·l-1

Riproducibilità inter-laboratorio: 12 mg·l-1

3.9 Bibliografia DUBERNET M., PENNEQUIN F. et GRASSET F., 1995. Dosage du dioxyde de soufre libre dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717. FV N° 998 OIV.

4 Dosaggio del glucosio e del fruttosio nei vini e nei mosti

4.1 Principio Metodo enzimatico Il glucosio e il fruttosio sono fosforilati in presenza di adenosina trifosfato (ATP). La reazione è catalizzata tramite l’esochinasi (HK) e produce rispettivamente glucosio-6-fosfato (G6P) e fruttosio-6-fosfato (F6P). HK

1) Glucosio + ATP ------> G6P + ADP HK 2) Fruttosio + ATP ------> F6P + ADP

Il glucosio-6-fosfato è ossidato in gluconato-6-fosfato in presenza di nicotinamide-adenosina-dinucleotide (NAD). La reazione è catalizzata con glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH). G6PDH

3) G6P + NAD -----> gluconato-6-fosfato + NADH + H+ Il fruttosio-6-fosfato è trasformato in glucosio-6-fosfato in presenza di fosfoglucosio isomerasi (PGI) PGI

4) F6P -----> G6P L’aumento dell’assorbimento alla lunghezza d’onda di 340 nm è proporzionale alla quantità di D-glucosio e D-fruttosio presente.

4.2 Materiale

Si può usare qualsiasi materiale per analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di due reagenti e che consenta una misurazione a 340 nm.

4.3 Reagenti I reagenti utilizzati sono abitualmente forniti dai fabbricanti sotto forma di cofanetto enzimatico che ne facilita l’utilizzo da parte dei laboratori. Si riporta qui sotto un esempio.




Reagente 1 (30 ml) Soluzione tampone pH 7,5 NAD (N° CAS[53-84-9]) 70 mg ATP (N° CAS[987-65-5]) 90 mg

Reagente 2 (0,6 ml)

HK (N° CAS[9001-51-8]) 160 U e G6PDH (N° CAS[9001-40-5]) 200 U Reagente 3 (0,6 ml)

PGI (N° CAS[9001-41-6]) 380 U Il reagente unico utilizzato nell’apparecchiatura è preparato con l’aggiunta dei 3 reagenti del cofanetto ai quali si aggiungono 900 mg di PVP (Polivinilpirrolidone) (N° CAS[9003-39-8]). Nel caso citato, permette di realizzare circa 600 test. La sua conservazione è di 1 mese a +8° C.

4.4 Preparazione dei campioni I campioni di vino sono diluiti 10 volte. I campioni di mosto sono diluiti in modo da ottenere una concentrazione iniziale inferiore a 1 g·l-1.

4.5 Procedura analitica La lunghezza d’onda di lettura è di 340 nm.


Giro 1 (6 secondi): prelievo di un campione di vino di 5 µl Giro 1 (12 secondi): aggiunta di 50 µl di reagente e 200 µl di acqua demineralizzata Giro 1: lettura dell’assorbanza DO1 a 340 nm Giro 50 (600 secondi): lettura dell’assorbanza DO 2 a 340 nm

4.6 Taratura Si esegue in quattro punti. Il valore zero è ottenuto utilizzando una soluzione di Cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰. I valori standard sono dati da soluzioni di glucosio (N° CAS[50-99-7]) e fruttosio (N° CAS[57-48-7]) (50/50) coprenti la gamma da 0 a 10 g·l-1 diluiti 10 volte al momento del loro utilizzo. La taratura può anche essere effettuata con vini dalle concentrazioni note.

4.7 Lettura dei risultati La lettura è data dalla differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO 1. Questa differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di glucosio e fruttosio del campione adottato. Il risultato è espresso in g di glucosio + fruttosio per litro.

4.8 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità intra-laboratorio: 0,3 g·l-1 da 0 a 5 g·l-1 e 0,6 l-1 oltre i 5 g·l-1. Riproducibilità inter-laboratorio: 0,35 g·l-1 da 0 a 2 g·l-1

5 Dosaggio dell’acido L-malico nei vini e nei mosti

5.1 Principio L’acido L-malico in presenza di nicotinamide-adénosine– dinucléotide (NAD+), è ossidato in ossalacetato in una reazione catalizzata dalla L-malato deidrogenasi (L-MDH). L’equilibrio della reazione è in favore del malato. Lo spostamento dell’equilibrio della reazione nel senso della formazione di ossalacetato si ottiene con l’eliminazione dell’ossalacetato che, in presenza di L-glutammato, si trasforma in L-aspartato. Questa reazione è catalizzata tramite la glutammato-ossalacetato-transaminasi (GOT)




1) L-malato + NAD+ -> ossalacetato + NADH + H+ (in presenza di L-malato deidrogenasi) 2) ossalacetato + L-glutammato -> L-aspartato + 2-ossoglutarato (in presenza di GOT)

La formazione di NADH, misurata con l’aumento di assorbimento alla lunghezza d’onda di 340 nm, è proporzionale alla quantità di L-malato presente.

5.2 Materiale Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che consenta una misurazione a 340 nm.

5.3 Reagenti I reagenti utilizzati sono abitualmente forniti dai fabbricanti sotto forma di cofanetto enzimatico che ne facilita l’utilizzo da parte dei laboratori. Si riporta qui sotto un esempio

Reagente 1 (30 ml) Soluzione tampone pH 10 / acido glutammico (N° CAS[56-86-0]) 440 mg

Reagente 2 (6 ml)

NAD (N° CAS[53-84-9]) 210 mg Reagente 3 (0,6 ml)

L-MDH (N° CAS[9001-64-3]) 2400 U / GOT (N° CAS[9000-97-9]) 160 U

Il reagente unico utilizzato nell’apparecchiatura si prepara con l’aggiunta di 3 reagenti del cofanetto ai quali si aggiungono 300 mg di PVP (Polivinilpirrolidone) (N° CAS[9003-39-8]). La sua conservazione è di 1 mese a 8° C.

5.4 Preparazione dei campioni I campioni di vino o di mosto sono diluiti 10 volte.



Giro 1 (6 secondi): prelievo del campione di vino di 5 µl Giro 1 (12 secondi): aggiunta di 20 µl di reagente e 200 µl d’acqua demineralizzata Giro 1: lettura dell’assorbimento DO 1 a 340 nm Giro 50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento DO 2 a 340 nm

5.6 Taratura Si esegue in tre punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰. I valori standard sono dati da soluzioni di acido L-malico (N° CAS[97-67-6]) che copre la gamma da 0 a 3,5 g·l-1 diluite 10 volte al momento del loro utilizzo. La taratura può essere anche eseguita con vini dalle concentrazioni note.

5.7 Lettura dei risultati La lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO 1. Questa differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di acido L-malico nel campione esaminato. Il risultato si esprime in g di acido L-malico per litro.

5.8 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità intra-laboratorio: 0,4 g·l-1. Riproducibilità inter-laboratorio: 0,6 g·l-1




6 Dosaggio dell’acido L-lattico nei vini e nei mosti

6.1 Principio Metodo enzimatico L’acido L-lattico in presenza di nicotinamide-adénosine-dinucléotide (NAD) è ossidato in piruvato in una reazione catalizzata dalla L-lattato deidrogenasi (L-LDH). L’equilibrio della reazione è in favore del lattato. L’eliminazione del piruvato dal mezzo di reazione sposta l’equilibrio della reazione nel senso della formazione del piruvato. In presenza di L-glutammato, il piruvato si trasforma in L-alanina. Questa reazione è catalizzata dal glutammato-piruvato-transaminasi (GPT)

1) L-lattato + NAD+ -> piruvato + NADH + H+ (in presenza di L-lattato deidrogenasi) 2) Piruvato + L-glutammato -> L-alanina + 2-ossoglutarato (in presenza di GPT)

La formazione di NADH, misurata con l’aumento di assorbimento alla lunghezza d’onda di 340 nm, è proporzionale alla quantità di lattato presente.

6.2 Materiale Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che consenta una misurazione a 340 nm.

6.3 Reagenti I reagenti utilizzati sono abitualmente forniti dai fabbricanti sotto forma di cofanetto enzimatico che ne facilita l’utilizzo da parte dei laboratori. Si riporta qui sotto un esempio.

Reagente 1 (30 ml) Soluzione tampone pH 10 / acide glutammico (N° CAS[56-86-0]) 440 mg

Reagente 2 (6 ml)

NAD (N° CAS[53-84-9]) 210 mg

Reagente 3 (0,6 ml) GPT (N° CAS[9000-86-6]) 1100 U

Reagente 4 (0,6 ml)

L-LDH (N° CAS[9001-60-9]) 3800 U

Il reagente unico utilizzato nell’apparecchiatura si prepara con l’aggiunta dei 4 reagenti del cofanetto ai quali si aggiungono 300 mg di PVP (Polivinilpirrolidone ) (N° CAS[9003-39-8]). La sua conservazione è di 1 mese a 8° C.



La seguenza analitica è la seguente:

Giro 1 (6 secondi): prelievo di un campione di vino di 5 µl Giro 1 (12 secondi): aggiunta di 20 µl di reagente e 200 µl di acqua demineralilzzata Giro 1: lettura dell’assorbimento DO1 a 340 nm Giro 50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento DO2 a 340 nm




6.6 Taratura Si esegue in tre punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰. I valori standard sono dati da soluzioni di acido L-lattico (N° CAS[79-33-4]) che coprono la gamma da 0 a 1,2 g·l-1 diluite 10 volte al momento dell’utilizzo. La taratura si può eseguire anche con vini dalle concentrazioni note.

6.7 Lettura dei risultati La lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO1. Questa differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di acido L-lattico nel campione esaminato. Il risultato si esprime in g di acido L-lattico per litro.

6.8 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità intra-laboratorio: 0,2 g·l-1. Riproducibilità inter-laboratorio: 0,5 g·l-1

7 Dosaggio dei componenti fenolici totali nei vini con indice di Folin-Ciocalteu

7.1 Principio Metodo chimico L’insieme dei componenti fenolici presenti nel vino è ossidato con il reagente di Folin-Ciocalteu. Quest’ultimo è costituito da una miscela di acido fosfotungstico e di acido fosfomolibdico che si riduce, al momento dell’ossidazione dei fenoli, in una miscela di ossidi blu di tungsteno e di molibdeno. La colorazione blu prodotta presenta un assorbimento massimo intorno ai 750 nm. È proporzionale al tasso di composti fenolici presenti nel vino. Il metodo proposto rappresenta un’automatizzazione diretta del metodo manuale.

7.2 Materiale Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di 2 reagenti e che consenta una misurazione a 750 nm.

7.3 Reagenti

Reagente 1 Reagente di Folin Ciocalteu

Reagente 2

Carbonato di sodio (CAS [497-19-8]) 20 g Acqua demineralizzata fino a 100 ml.

7.4 Preparazione dei campioni I campioni di vino o di mosto non sono diluiti.



Giro 1 (6 secondi): prelievo di 2 µl del campione di vino o di mosto Giro 1 (12 secondi): aggiunta di 50 µl di reagente 1 e 40 µl di acqua demineralizzata. Giro 25 (300 secondi): aggiunta di 200 µl di reagente 2 Giro 50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento Do a 750 nm

7.6 Taratura Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰. Un valore standard è dato da un vino dosato con il metodo manuale di riferimento.




7.7 Lettura dei risultati Il valore dell’indice di Folin-Ciocalteu è direttamente proporzionale all’assorbimento misurato DO.

7.8 Caratteristiche del metodo descritto Riproducibilità intra-laboratorio: 4,5 Riproducibilità inter-laboratorio: 8,5

8 Dosaggio dell’azoto -amminico nei vini e nei mosti

8.1 Principio Metodo chimico La quantità di azoto -amminico si determina tramite reazione con l’oftaldialdeide. L’intensità dell’assorbimento a 340 è confrontata con quelle ottenute per campioni di concentrazioni note in isoleucina.

8.2 Materiale Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di 2 reagenti e che consenta una misurazione a 340 nm.

8.3 Reagenti

Reagente 1 NaOH (N°CAS [1310-73-2]) 3,837 g Acido borico (N°CAS [10043-35-3]) 8,468 g Acqua demineralizzata fino a 1000 ml Reagente 2 O-ftaldialdeide 99% (N°CAS[643-79-8]) 0,671 g N-acetil–cisteina (N°CAS [616-91-1]) 0,0816 g Etanolo (N°CAS [64-17-5]) al 1/2 fino a 100 ml

8.4 Preparazione dei campioni I campioni di vino o di mosto non sono diluiti



Giro 1 (6 secondi): prelievo di 5 µl del campione di vino Giro 1 (12 secondi): aggiunta di 200 µl di reagente 1 Giro 24 (294 secondi): lettura dell’assorbimento DO1 a 340 nm Giro 25 (300 secondi): aggiunta di 200 µl di reagente 2 Giro 50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento DO2 a 340 nm

8.6 Taratura Si esegue in 6 punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di Cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰. Gli altri 5 valori si ottengono con una gamma di soluzioni di L-isoleucina.

Soluzione madre di L-isoleucina L-isoleucina (N°CAS [73-32-5]) 0,936 g Acqua demineralizzata fino a 100 ml Agitare bene fino alla completa dissoluzione. Questa soluzione contiene 1 g di azoto -amminico per litro. È stabile per tre mesi.




Soluzioni di taratura Si preparano secondo la tabella seguente:

Quantità in ml di soluzione madre per 100 ml di acqua

demineralizzata

1

5

10

15

20

Concentrazione in azoto amminico in mg/l

Tempo di conservazione: 3 mesi

10

50

100

150

200

8.7 Lettura dei risultati La lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO 1. Questa differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di azoto -amminico del campione esaminato. Il risultato è espresso in mg di azoto -amminico per litro.

9 Dosaggio dell’azoto ammoniacale nei vini e nei mosti

9.1 Principio Metodo enzimatico. In presenza di nicotinamide-adenosina-dinucleotide ridotta (NADH), in una reazione catalizzata con glutammato deidrogenasi(GLDH), gli ioni NH4

+ e il 2- ossoglutarato formano L-glutammato. NH4

+ + 2-ossoglutarato + NADH -> L-glutammato + NAD+ + H2O (in presenza di GLDH) La quantità di NADH ossidato in NAD+ è proporzionale alla quantità di azoto ammoniacale presente.

9.2 Materiale Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di 2 reagenti e che consenta una misura a 340 nm.

9.3 Reagenti I reagenti utilizzati sono abitualmente forniti dai fabbricanti sotto forma di cofanetto enzimatico che ne facilita l’utilizzo da parte dei laboratori. Qui di seguito si fornisce un esempio. Reagente 1 (30 ml)

Tampone TRIS, 2-ossoglutarato pH 8 Reagente 2 (6 ml)

NADH (N° CAS[606-68-8]) 14 mg

Reagente 3 (0,6 ml) GLDH (N° CAS[9029-11-2]) 550 U


9.5 Procedura analitica La lunghezza d’onda della lettura è di 340 nm.


Giro 1 (6 secondi): prelievo di 5 µl del campione di vino o di mosto Giro 1 (12 secondi): aggiunta di 100 µl di reagente e 100 µl di acqua demineralizzata Giro 24 (294 secondi): lettura dell’assorbimento Do1 a 340 nm Giro 25 (300 secondi): aggiunta di 20 µl di reagente 2 Giro 50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento Do2 a 340 nm




9.6 Taratura Si esegue in 6 punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰. Gli altri 5 valori si ottengono con un gamma di soluzioni di solfato di ammonio.

Soluzione madre di solfato di ammonio (NH4)2SO4 (N°CAS [7783-20-2]) 4,8563 g Acqua demineralizzata fino a 100 ml Agitare bene fino alla completa dissoluzione. Questa soluzione contiene 12,5 g di azoto ammoniacale per litro. È stabile per 3 mesi. Soluzioni di taratura Si preparano secondo la seguente tabella:

Quantità in ml di soluzione

madre diluita al 1/10 per 100 ml di acqua demineralizzata

1

5

10

15

20

Concentrazione di azoto ammoniacale in mg•l-1

Tempo di conservazione: 3 mesi

12,5

62,5

125

187,5

250

9.7 Lettura dei risultati La lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO 1. Questa differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di azoto ammoniacale nel campione esaminato. Il risultato è espresso in mg di azoto ammoniacale per litro.

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