Spettrometria di massa

• Separazione di ioni in fase gassosa in funzione della loro massa molecolare

• Analisi di frammenti che si generano per attivazione e selezione di un singolo ione

Spettrometro di massa

Sorgente AnalizzatoreRivelatore

m/z

Sorgenti

• Ionizzazione diretta– EI, CI

• Desorbimento– FAB– MALDI

• Nebulizzazione– ESI

Ionizzazione diretta

MS & Proteomics

Spettro ESI del Tripsinogeno (MW 23983)

1599.8

1499.91714.1

1845.91411.9

1999.62181.6

M + 15 H+

M + 13 H+

M + 14 H+M + 16 H+

m/z Mass-to-charge ratio

Rel

ativ

e A

bund

ance

Calcolo accurato della massa (MR = 23983 Da)

• (M+16)/16 = 1499.9 23982.4• (M+15)/15 = 1599.8 23982.0• (M+14)/14 = 1714.1 23983.4• (M+13)/13 = 1845.9 23983.7

1599.8

1499.91714.1

1845.91411.91999.6

2181.6

• (M+n+3)/(n+3) = 1499.9 • (M+n+2)/(n+2) = 1599.8 • (M+n+1)/(n+1) = 1714.1 • (M+n)/n = 1845.9 n =

13

Uses a combination of Radio Frequency(RF) and Direct Current(DC) voltages to operate as a mass filter.• Has four parallel metal

rods.

• Lets one mass pass through at a time.

• Can scan through all masses or sit at one fixed mass.

Quadrupolo

Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

Schema esemplificato del processo di ionizzazione MALDI

Flight Tube

Detector

Ion Source

time-of-flight (TOF)

Principle: If ions are accelerated with the same potential at a fixed point and a fixed initial time and are allowed to drift, the ions will separate according to their mass to charge ratios.

20-25 kV

Flight Tube

Detector

Ion Source

time-of-flight (TOF)

The ions enter the flight tube with the lighter ionstravelling faster than the heavier ions to the detector

Flight Tube

Detector

Ion Source

The lighter ions strike the detector before the heavier ions.This “time of flight” (TOF) can be converted to mass

time-of-flight (TOF)

MALDI/TOF MASS SPECTROMETRY

Spetto MALDI/TOF di IgGR

elat

ive

Abu

ndan

ce

m/z

0

10000

20000

30000

40000

50000 100000 150000 200000

MH+

(M+2H)2+

(M+3H)3+

Analyzer System Highlights

Quadrupole Unit mass resolution, fast scan, low cost

Sector (Magnetic and/orElectrostatic)

High resolution, exact mass

Time-of-Flight (TOF) Theoretically, no limitation for m/z maximum,high throughput

Ion Cyclotron Resonance (ICR) Very high resolution, exact mass, perform ionchemistry

Mass Analyzers

Risoluzione e sensibilità

Risoluzione MALDI

Peptide mass fingerprinting

Limiti del peptide mass fingerprinting

• La proteina non è presente nel database• La proteina è ricca di modificazioni

co/post-traduzionali• Lo spot nasconde più di una proteina

La sorgente ESI può essere collegata all’uscita di un sistema di separazione

LC Fraction collector

Mass spectrometer7:1 flow split

0.18mm X 15cms C18 column

4µl/min

Further MS analysis

400nl/min

MS/MS

mass scanning mode

m1m3m4 m2

m3

m1

m4

m2

single mass transmission mode

m2 m2 m2 m2m3

m1

m4

m2

Quadrupolo

Tandem MS

MS/MS

Frammentazione dei peptidi

LC-MS-MS

Isotope-coded affinity tagging

ICAT

ICAT

ICAT

iTRAQ

Activity-based protein profiling

Protein arrays

Protein arrays

Protein arrays