Strumenti e Tecniche Strumenti e Tecniche di studio di studio in patologia in patologia
Gli strumenti della patologia:
• Microscopia
• Biologia molecolare
• Indagini biochimiche
Microscopia Ottica Microscopia Ottica
�� citopatologiacitopatologia ed ed istopatologiaistopatologia
�� citochimica ed citochimica ed istochimicaistochimica
�� immunocitoimmunocito((istoisto)chimica )chimica
�� immunofluorescenzaimmunofluorescenza
Microscopia Microscopia Elettronica Elettronica
A trasmissione
A scansione
cytopath.co.uk
Campione citologico • Persa “la geografia spaziale”dell’organo / tessuto, i criteri diagnostici si basano quasi esclusivamente sulle caratteristiche delle cellule
– Caratteristiche morfologiche di nucleo e citoplasma • forma• colore• dimensione
– Pattern di aggregazione
Citologia esfoliativa
cellule esfoliate spontaneamente si ritrovano in: – Urine– Espettorato– Secrezioni– Versamenti – Liquor (liquido cerebrospinale)
Citologia per esfoliazione provocata
• Cellule attivamente asportate dalla superficie cutanea, di una mucosa o di una lesione
Citologia per aspirazione con ago sottile
http://www.vetmed.wsu.edu/resources/Techniques/images/fna_technique.jpg
Campione istologico
Mantenuti “siti, orientamento e rapporti” delle componenti tessutali prelevate
Anche nelle lesioni che si discostano molto dall’anatomia dell’organo da cui derivano, è mantenuta “la geografia spaziale” tra epitelio, stroma, vasi
Quantità di fissativo da utilizzare = rapporto 1:10rapporto 1:10
Fissazione del campione
…in caso di campioni di grandi dimensioni…
1
Lesioni piLesioni piùùrappresentativerappresentative
2
Consentire Consentire unun’’adeguata adeguata
fissazione fissazione ““a cuorea cuore””
Elevato n° di pezzi
++
Scarsa quantità di fissativo
Ridotta fissazioneRidotta fissazione
Attenzione!!!!!Attenzione!!!!!
Inadeguata fissazione….alterazione della morfologia cellulare…preparato istologico illeggibile!!!!
Buona fissazione Scarsa fissazione
Attenzione!!!!!Attenzione!!!!!
Tessuti ricchi di sangue (milza, lesioni emorragiche, ecc.) ���� necessaria la sostituzione periodica del fissativo
1) Incompleta fissazione
2) Formazione di pigmenti formalinici
Scopi:Scopi:
1)1) Immobilizzazione dei costituenti Immobilizzazione dei costituenti cellulari e cellulari e tissutalitissutali
2)2) InattivazioneInattivazione enzimi enzimi autolisantiautolisanti
3)3) InattivazioneInattivazione batteribatteri
4)4) Conferimento di stabilitConferimento di stabilitààstrutturale ai costituenti chimici strutturale ai costituenti chimici del protoplasmadel protoplasma
Fissazione completa dopo 24 oreFissazione completa dopo 24 ore
FissazioneFissazione
Requisiti dei fissativiRequisiti dei fissativi
• Elevato potere di penetrazione
• Fissazione uniforme
• NO coartazione tissutale
• Preparazione dei pezzi per l’inclusione in paraffina
• Compatibilità con numerose colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche
FISSAZIONE MEDIANTE….
Agenti chimici Agenti fisici
-- composti organicicomposti organici
-- composti inorganicicomposti inorganici
-- congelamentocongelamento
-- calorecalore
Fissativi semplici
•• FormaldeideFormaldeide
- in commercio al 40% in soluzione acquosa (formalina)
- si usa al 10% (90 volumi di acqua, 10 volumi di formalina), neutra e tamponata
- assenza di neutralità: produzione di acido formico nella soluzione (riduzione dell’effetto di fissazione!!!)
Alto grado di penetrazione
No eccessivo indurimento dei tessuti
No dissoluzione dei lipidi
Immersione per lungo tempo
Formazione di legami a ponte tra residui di lisina
NO modificazione importante della struttura proteica
PericolositPericolositàà dei fissatividei fissativi
Formaldeide:Formaldeide:
- Tossica
- Infiammabile
- Irritante
1)1) FissazioneFissazione
2)2) DisidratazioneDisidratazione
3)3) ChiarificazioneChiarificazione
4)4) Inclusione in paraffinaInclusione in paraffina
5)5) Taglio delle sezioni Taglio delle sezioni
6)6) ColorazioneColorazione
50 %
etanolo70 %
etanolo
95 %
etanolo
100 %
etanolo
xylolo
Disidratazione
Disidratazione
paraffina
Tessuto fresco
Fissazione in formalina
Inclusione in paraffina Inclusione in paraffina
sezione
vetrino
Taglio Taglio
delle sezioni delle sezioni
ColorazioneColorazione
N° rif. IstologicoTessuto od organoSpecie animaleColorazione
IdentificazioneIdentificazione
Colorazioni cito-istochimiche- forniscono informazioni sul contenuto e sulla natura delle sostanze chimiche contenute nelle cellule (citochimica) o nei tessuti biologici (istochimica)
Alcian
- sfruttano la proprietà di alcuni reagenti di interagire con specifici composti chimici contenuti in cellule e tessuti formando dei prodotti “colorati”visibili al microscopi ottico
- utilizzabili anche per rilevare la presenza di alcuni tipi di agenti biologici all’interno dei tessuti (es. batteri, funghi, protozoi)
Ziehl-Neelsen
Grocott
Tecniche Tecniche immunologicheimmunologiche
Visualizzazione di una reazione antigeneVisualizzazione di una reazione antigene--anticorpo anticorpo mediante lmediante l’’utilizzo di marcatori utilizzo di marcatori
fluorocromifluorocromiComplesso enzima + Complesso enzima + substrato substrato cromogenocromogeno
IMMUNOFLUORESCENZAIMMUNOFLUORESCENZA IMMUNOISTOCHIMICAIMMUNOISTOCHIMICA
PRINCIPIO DI BASEPRINCIPIO DI BASE
ImmunoImmunofluorescenzafluorescenza
FluorocromiFluorocromi::fluoresceina, texasred, rodamina, ecc.
DIRETTA INDIRETTA
ImmunoImmunocitocitochimicachimica
DIRETTA INDIRETTA
EnzimaEnzima substratosubstrato
perossidasi 1) DAB (3,3-diaminobenzidina tetraidrocloruro)
2) AEC (3-amino-9-etilcarbazolo)
3) CN (4-cloro-1-naftol)
Fosfatasi alcalina
1) Fast red
2) Fast blue BB
Preparati citologici o sezioni istologiche sottoposte a reazioni
immunocito(isto)chimiche portano alla formazione di un prodotto “colorato”
che può essere analizzato al microscopio ottico
ImmunoImmunoistoistochimicachimica
Applicazioni dell’immunoistochimica:
• ricerca di base • diagnostica routinaria
Esempi in campo diagnostico:
- individuazione di antigeni di agenti patogeni nei tessuti
- discriminazione tra neoplasie di diversa istogenesi
- migliorare la caratterizzazione di neoplasie appartenenti ad uno stesso gruppo (es. linfomi)
- identificare l’origine di una metastasi di cui non si conosce il tumore primitivo (per es. marcatori tessuto specifici)
Valutazione di marker prognostici/predittivi nei tessuti neoplastici
Consente il reperimento di quantitàanche minime di materiale genetico (DNA) presente nei campioni inviati
l’amplificazione richiede la presenza di primers, ossia oligoncleotidi a singola filamento complementari alle
estremità della regione a sequenza nota
PCR - Polymerase Chain Reaction(Reazione a Catena della Polimerasi)
tecnica in vitro per l’amplificazione esponenziale di una sequenza di DNA disposta tra due regioni a sequenza nota
http://www.gene-quantification.de/block.html
RT (reverse transcription) – PCR: variante della tecnica PCR che consente di amplificare una molecola di DNA partendo da un insieme di RNA totali estratti da un tipo cellulare
ESEMPI DI APPLICAZIONI DELLA PCR
1. Identificazione di agenti patogeni in campioni biologici umani o animali, o negli alimenti (virus e batteri )
2. Identificazione di organismi geneticamente modificati(OGM)
3. Ricerca di farine di origine animale nei mangimi destinati all'alimentazione del bestiame
4. Analisi del DNA in medicina legale (es. test di paternità)
5. Diagnosi di malattie genetiche