Date post: | 01-May-2015 |
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Terapia Genica
• E’ un approccio moderno per trattare, curare o in ultima analisi prevenire una malattia cambiando l’espressione di uno o più geni. Può essere applicata a cellule somatiche o a cellule germinali.
• La terapia genica allo stato attuale è largamente sperimentale. La terapia genica germinale non è ad animali di grossa taglia e all’uomo.
Gene therapy in medicina interna
• Definizione: modificazione di un fenotipo mediante trasferimento di (un) gene.
• Notevolmente sviluppata dal punto di vista sperimentale in modelli cellulari ed animali.
• Relativamente avanzata dal punto di vista clinico.
Cosa è realmente la terapia genica?
• Per inserire un gene in un sistema complesso bisogna innanzitutto avere un gene.
• La terapia genica fornisce quindi uno strumento per conoscere meglio le funzioni dei geni e delle proteine da essi codificati.
A cosa serve la terapia genica?
• Cancro: cellule tumorali, progenitori ematopoietici,T-cells, fibroblasti, cellule muscolari.
• Disordini ereditari monogenici: cellule epiteliali polmonari, macrofagi, progenitori ematopoietici, epatociti, cellule muscolari.
• Malattie infettive: cellule T, progenitori ematopoietici, cellule muscolari.
• Malattie cardiovascolari: cellule endoteliali, cellule muscolari.
• Artrite Reumatoide: cellule epiteliali sinoviali.• Sindrome del tunnel Carpale: cellule nervose.
Sistemi di gene transfer
• DNA nudo
• Lipidi cationici
• Particelle di DNA condensato
• Gene guns
• Virus
Dna nudo
• Funziona meglio in vivo che in vitro.• Uso: vaccini.• Pro: economico e facilmente
maneggiabile.• Contro: poco efficiente, breve
espressione, non si presta a selettività tissutale, crea infiammazione (CpG non metilate).
Lipidi Cationici
• Legano il DNA mediante interazioni elettrostatiche (non covalenti)
• Transitorio• Uso: Fibrosi Cistica (entra bene
nell’epitelio polmonare)• Pro: come il DNA nudo.• Contro: bassa efficienza, breve
espressione.
DNA condensato
• I polimeri usati sono: polilisine, oligopeptidi,imine polietileniche.
• Pro: si presta a future manipolazioni può prababilmente favorire la selettività se usato insieme ad altre tecnologie.
• Contro: come si fa a far andare il dna nel nucleo (dove deve replicarsi).
Gene Guns
• Cannoncini che sparano il DNA nudo o nelle cellule (difficile in vivo) o nell’interstizio. E’ un alternativa all’iniezione.
• Pro: bassa immunogenicità. Sostituirà l’ago nell’iniezione di DNA nudo.
• Contro: Si può sparare sulla pelle, ma quali altri organi?
Elettroporazione
• Mediante delle differenze di potenziale
(scariche elettriche) si fanno dei buchi sulla membrana citoplasmatica e il DNA entra nelle cellule.
• Poco applicabile in vivo, in vitro “uccide” molte cellule.
Vettori virali
• Adenovirus.
• Retrovirus.
• Virus Adeno associati (AAV): Parvo virus.
Adenovirus
• I più efficaci sistemi di gene transfer a disposizione.• Oltre 50 sierotipi di AV umani.• In G.T: si usano quasi esclusivamente il sierotipo 2 e 5, in
più comuni.• 36 Kb DS-DNA.• >50 polipeptidi divisi in:-E1 fattori di trascrizione.-E2 replicatori genoma virale-E3 Fattori prottetivi immunogeni-E4 replicatore genoma viraleFirst generation: E3 def. Circa 7.5 KBNewer generations: E1,E2/E4.
• Promotore CMV.
• Fegato sito di maggiore uptake.
• Pro: molto efficaci, elevata e rapida espressione, relativa specificità.
• Contro: tossici, rapida eliminazione, molti umani sono già sensibilizzati, spesso contaminati.
Retrovirus
• SS-RNA avviluppato in lipidi, 7-11 KB, si inseriscono nel genoma dopo essere stato retrotrascritto.
• Si divide in: Onco Retrovirus, Lenti virus, Spuma virus.
• Infezioni croniche. Ben tollerati dall’ ospite in cui si slatentizzano di tanto in tanto.
• GAG: proteine strutturali; POL: polimerasi; ENV: proteine di superficie.
• 83 KB di Dna eterologo che si può inserire nel genoma.
• Prolonged transgene expression.
• Ridotti livelli di espressione.
• Le proteine di superficie hanno recettori specifici sulle membrane cellulari, per cui entrano più facilmente in alcuni tessuti che in altri.
• Vengono rapidamente eliminati dal circolo.
• Molto usati ex vivo, poco usati in vivo.
Virus Adeno Associati (AAV)
• Parvovirus.• Necessitano di un helper.• 6 sierotipi, si usa il 2.• Non ci sono malattie associati agli AAV.• Nel genoma ci sono 2 geni che producono
multipli polipeptidi:- REP produce prodotti per la
replicazione.- CAP produce proteine strutturali.
• REP permette l’ integrazione nel cromosoma 19.
• Espressione lenta ma duratura
• 5.0 KB di spazio.
• Pro: espressione stabile e duratura.
• Contro: poco spazio, difficile da produrre su larga scala.
Studi clinici
• Malattia: Ischemia (Miocardio,Claudicatio intermittens).• Gene: VEGF.• Transfer: in vivo.• Vettore: Dna nudo.• Risultati: VEGF è un fattore solubile. L’iniezione di DNA
nudo IM conduce all’aumento dei livelli circolanti del fattore induzione della neoangiogenesi. Rivascolarizzazione eterotropa del vaso.
• Obiezioni: Studio in fase 1, mancano i controlli. Per il miocardio, mancano evidenze angiografiche di rivascolarizzazione, solo evidenze “morfologiche e funzionali” ottenute alla scintigrafia.
Studi di fase I/II per valutare la tossicità
• 1° studio: Malattia SCID.• Gene: ADA.• Transfer: ex vivo in T Cell.• Vettore: LASN (Retrovirus).• Risultato: miglioramento del quadro clinico• Obiezioni: scarso numero di pazienti (n=2)
assenza di controlli. La terapia tradizionale non fu discontinuata.
• NIH trial.• Telethon study.
Caso Gelsinger
• Malattia: Iperammonemia.• Gete: OTC (Ornithyne
Transcarbamylase).• Transfer: in vivo, target: il Fegato.• Vettore : Adenovirus, replicatio
deficient.• Risultato: morte per ARDS nell’ ambito
di SIDS.
Gene therapy in Hypertension
• L’ ipertensione è una sindrome (malattia) a trasmissione familiare, ma multifattoriale. Probabilmente più di un gene vi è coinvolto e alcuni geni in certi tipi di ipertensione sono più colpevoli di altri.
• Si definisce iperteso:
Sistolica >140 mmHg.
Diastolica > 90 mmHg
Condizioni cliniche che derivano dall’ipertensione
• Stroke
• Cardiopatia ipertrofica e poi dilatativa.
• Cardiopatia ischemica.
• Arterosclerosi.
• Insufficienza renale.