Date post: | 01-May-2015 |
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TERRENI DI
COLTURA
Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare
nelle condizioni di laboratorio
Per questo scopo si devono conoscere quali sostanze nutritizie e
quali condizioni fisiche essi richiedono
COLTIVAZIONE DEI BATTERI
La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l’impiego di “terreni di coltura” con i quali si
cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare
le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare
I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo
La composizione chimica dei diversi terreni di coltura è in parte differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera coltivare
Alcune sostanze sono necessarie a tutti i microrganismi, in quantità notevoli: si tratta di quelle che sono necessarie per le biosintesi, e che entrano quindi a far parte delle principali
componenti strutturali della cellula, come carboidrati, proteine, lipidi e acidi nucleici Queste
sostanze vengono definite: “Macronutrien
ti” CARBONIO
AZOTO
OSSIGENO
IDROGENO
ZOLFO
FOSFORO
servono per la sintesi dei
componenti strutturali della
cellula
In un secondo gruppo di macronutrienti si trovano gli elementi usati in quantità
relativamente elevate rispetto agli altri sali. La maggior parte di queste sostanze è necessaria a
tutti i batteri, ma alcune sono fondamentali soltanto per alcune specie o in particolari
momenti
Alcuni elementi sono necessari alla cellula, ma in quantità molto esigue: generalmente le tracce contenute in sali o nell’acqua sono sufficienti a
garantire la crescita del microrganismo
Se tuttavia si usano sali e acqua particolarmente puri, questi elementi devono essere aggiunti ai
terreni sotto forma di soluzioni bilanciateQueste sostanze vengono definite:
“Micronutrienti”
Per poter utilizzare i nutrienti è necessario portarli all’interno della cellula: l’unico
composto chimico che entra o esce senza difficoltà alcuna dalla cellula batterica, è
l’acqua
TRASPORTO DEI NUTRIENTI ALL’INTERNO DELLA CELLULA
la concentrazione interna si mantiene superiore a quella esterna, spendendo
energia
L’energia spesa per il trasporto dei nutrienti può provenire dall’ idrolisi di
ATP
TRASPORTO ATTIVO
Alcuni soluti possono passare il filtro della membrana per diffusione passiva (senza spesa di energia da parte del microrganismo) questo
processo è tuttavia poco efficiente e troppo lento e i procarioti fanno ricorso a enzimi di
membrana (le permeasi)
TRASPORTO FACILITATO
contenere tutti i nutrienti necessari alla crescita dai batteri da coltivare
l’acqua disponibile (Aw) deve essere adeguata (per la maggior parte dei microrganismi l’ideale è superiore a 0,98) il pH deve essere intorno a 7,2 a meno di richieste particolari, e il potenziale redox idoneo
Possono essere liquidi (per ottenere biomassa senza limiti spaziali), o solidi
I terreni che si usano in batteriologia devono:
Per solidificare i terreni si impiega L’AGAR
Un polisaccaride, estratto da alghe, che presenta il fenomeno della sovrafusione (liquefa a 100°C ma resta liquefatto fino a 45°C). L’uso dell’agar permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare
Inoltre:
non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri; non manifesta alcuna tossicità;
i microrganismii microrganismi
invisibili ad occhio nudoinvisibili ad occhio nudo
(<0,2 mm) si rendono visibili, dopo (<0,2 mm) si rendono visibili, dopo replicazione su substrato solido o replicazione su substrato solido o
liquidoliquido
Preparazione dei terreni
1. Dissoluzione degli ingredienti in volume di H2O.
2. Determinazione del pH ed eventuale correzione.
3. Distribuzione in contenitori idonei.4. Sterilizzazione
In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni relative, i terreni di coltura sono
classificati come: Sintetici (o definiti) Complessi
Terreni sintetici o definiti
I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si conosce l’esatta composizione. Vengono quasi sempre preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo che si desidera far crescere.
Contengono un numero definito di sostanze a concentrazione nota.
sono quei terreni di cui non si conosce in
maniera dettagliata la composizione chimicaQuesti mezzi di coltura risultano di estrema
utilità in quanto permettono di far crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro
Inoltre è possibile crescere specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute
Terreni complessi
Oltre alle sostanze “standard” i terreni complessi contengono:Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica (questi particolari proteine son parzialmente idrolizzate altrimenti denaturerebbero ad alte temperature);Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi peptidi, acidi organici, vitamine e sali minerali; Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell’azoto.
COLONIE SU AGAR
ACCRESCIMENTO SU AGAR A BECCO DI CLARINO
ACRESCIMENTO SU BRODO NUTRITIZIO
ACCRESCIMENTO PER INFISSIONE IN GELATINA
I caratteri colturali forniscono indizi utili per l’identificazione
Caratteristiche visive dell’avvenuto accrescimento in brodo
Crescita in terreni solidi (piastre Petri)
Crescita in substrati solidi (agar becco di clarino)
POPOLAZIONI MICROBICHE NATURALI
La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti
specie microbiche popolano contemporaneamente vari distretti del nostro corpo (mucose: orale, intestinale, cutanea) ed
in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua).COLTURE MISTE
Una coltura pura è costituita da una popolazione di cellule
derivate tutte da un’unica cellula madre
Essa rappresenta una condizione artificiale per l’accrescimento
dei batteri ed è una condizione imposta da manipolazioni di
laboratorio
PER STUDIARE I DIVERSI BATTERI CHE COLONIZZANO UN HABITAT O PER ISOLARE UN PATOGENO BISOGNA ISOLARE E COLTIVARE IN
FORMA PURA IL MICRORGANISMO
Terreni elettiviSono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o cavallo, che consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche di interesse medico.
Terreni selettiviSono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie.
Terreni differenzialiSono terreni che, grazie alla presenza di particolari componenti, permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata.
Terreni di arricchimentoSono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame.
Classificazione qualitativa dei terreni
emolisi su piastra di agar sangue
ESEMPIO DI TERRENO DIFFERENZIALE
selettivi perché favoriscono la crescita di determinate specie batteriche inibendone altre
differenziali perché permettono la crescita di colonie dello stesso genere ma di specie diverse
Terreni selettivi e differenziali
ESEMPIO DI TERRENO SELETTIVO E DIFFERENZIALE
Fermentazione del
mannitolo in piastra
di MSA
ASETTICITA'
Le finalità : ottenere e mantenere pure le colture di
microrganismi Una “coltura pura” è costituita solo da
una specie di microrganismo. La contaminazione delle colture è a rischio in quanto i microbi si trovano ovunque, sulla pelle, nell’aria.
volgere il lavoro in un laboratorio di microbiologia in sicurezza
Le regole fondamentali di asetticità sono:
la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm
quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla vedere facilmente
sterilizzare la vetreria e il materiale usati
disinfettare e pulire il banco da lavoro accuratamente
sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto