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Un nuovo marcatore prognostico del tumore alla prostata Test in vitro con validazione clinica
Un nuovo marcatore prognosticodel tumore alla prostata
Test in vitro con validazione clinica
La societàPharma Bullet srlè proprietaria del marchio
e della licenza del brevetto
via Clemente Mauro 1381123 Salerno
Tel. +39 0892580829Fax. +3900892580829 - 2574293
Un nuovo marcatore prognostico del tumore alla prostataTest in vitro con validazione clinica per la determinazìone immunoistochimica del tumore alla prostata da biopsie prostatiche
SCORE 2-6 = CARCINOMA BEN DIFFERENZIATOSCORE 7 = CARCINOMA MODERATAMENTE DIFFERENZIATOSCORE 8-10 = CARCINOMA POCO DIFFERENZIATO O INDIFFERENZIATO
Attualmente il metodo più usato nella diagnosi e nella prognosi del cancro della prostata è la scala di Gleason (Gleason Score) che classifica il tumore in base a 5 aspetti ghiandolari, con un punteggio di crescente gravità da 1 a 5, viene assegnato ai 2 pattern istologici più rappre-sentati nel campione e si definisce punteggio primario quello prevalente. I due numeri così ottenuti (il primo si riferisce al pattern più frequente) vengono sommati per ottenere un punteggio (che va da 2 a 10). Score 2-6 = carcinoma ben di�erenziato Score 7 = carcinoma moderatamente di�erenziato Score 8-10 = carcinoma poco di�erenziato o indi�erenziatoIl Gleason score, su biopsie prostatiche multiple, rappresenta, un fattore sia diagnostico che prognostico molto importante su cui si basa sempre la decisione terapeutica. Tuttavia, nonostante la sua importanza, ci sono una delle criticità riguardanti il Gleason score di cui di seguito sono riportate le principali: • nonostante i continui aggiornamenti e le ri-definizioni del sistema di gradazione (cfr. Epstein JI, 2010), il Gleason score è ancora gravato da una notevole soggettività e variabilità inter-individuale, soprattutto per quanto riguarda i bassi gradi (cfr. Berg KD et al., 2011); • soprattutto nei casi con score 7 di Gleason, la prognosi cambia in relazione alla maggiore o minore rappresentanza della componente di maggior grado (es. 4+3 vs 3+4) (Herman C et al., 2001); • non c’è sempre coincidenza fra grading bioptico e grading post-operatorio; • difficoltà di attribuzione dello score in caso di un pattern secondario elevato presente in limitata estensione; • difficoltà di valutazione nel caso di più pattern con un 3° pattern significativamente rappresentato; • difficoltà nella definizione dello score in caso di punteggi diversi sulle diverse biopsie di uno stesso paziente; • è inattendibile in caso di pregressa terapia; • non bisogna dimenticare le problematiche legate ad un campionamento inadeguato. Il nostro marcatore UTR-II (recettore dell’Urotensina II) consente di valutare la prognosi del tumore, riuscendo a di�erenziare con assoluta certezza i tumori della prostata aggressivi da quelli non aggressivi e fornendo indicazioni molto utili sulla futura progressione della malattia. L'età e lo stato di salute del paziente, così come la di�usione del tumore e la relativa stadiazione pre-operatoria, l'aspetto microscopico e la risposta al trattamento iniziale, sono importanti per determinare la prognosi. I marcatori attualmente disponibili non permettono di identificare con precisione i pazienti con malattia ad andamento meno aggressivo e ciò rende di�coltosa una selezione accurata del tratta-mento per il singolo paziente, soprattutto in caso di tumori allo stadio iniziale di sviluppo, ancora localizzati solo alla prostata.
5000SCALA di GLEASON
La decisione se trattare o meno un tumore localizzato implica un bilancio tra i benefici attesi e gli e�etti negativi in termini di sopravviven-za e qualità della vita del paziente.Attuale classificazione in gruppi di gradi istologici “G” (AJCC cancer staging manual; 8th Attuale ed.; 2017) Grado e gruppo 1: score di Gleason ≤ 6; pattern di Gleason ≤ 3+3;Grado e gruppo 2: score di Gleason 7; pattern di Gleason 3+4;Grado e gruppo 3: score di Gleason 7; pattern di Gleason 3+4;Grado e gruppo 4: score di Gleason 8; pattern di Gleason 4+4;Grado e gruppo 5: score di Gleason 9 o 10; pattern di Gleason 4+5 o 5+4 o 5+5.La valutazione del Gleason (grado di di�erenziazione del tumore) è a�data al patologo ed è esclusivamente basata su criteri morfologici (interpretazione soggettiva e dipendente dall’esperienza dell’operato-re). L’Urotensina II (U-II) è un peptide ciclico originalmente isolato dall’urofisi di teleostei e sequenziato più di 20 anni fa. U-II è il ligando di un recettore (UTR) che è coinvolto nella contrazione vasale. Infatti la U-II è il più forte vasocostrittore esistente nell’uomo. L’Urantide (H-Asp-c[Pen-Phe-DTrp-Orn-Tyr-Cys]-Val-OH) è un agonista- antagonista di U-II recentemente brevettata nei laboratori del Prof. Paolo Grieco (proprietario del brevetto). L’UTR è stato recentemente riscontrato in alcuni tumori della corticosurrenale umana dove sembra mediare e�etti proliferativi. Sulla base di questi dati abbiamo valutato l’espressione dell’UTR su un ampio panel di linee cellulari tumorali umane osservando una anomala espressione nelle cellule del carcino-ma prostatico. Sulla base di tali dati abbiamo ipotizzato ed accertato l’esistenza di una correlazione tra l’ espressione di UTR e l’evoluzione del cancro della prostata. Si è scoperto che: -la presenza di UTR è elevata nelle cellule tumorali; infatti l’UTR è un vettore di calcio che rende più mobili le cellule, consentendo alle stesse di evolversi più velocemente; questo accade nella prostata quando il tumore viene identificato da un Gleason score intermedio; all’interno quindi di uno stesso score intermedio di Gleason è possibile di�erenziare un tumore più potenzialmente aggressivo (con maggiore presenza di UTR) da un tumore potenzialmente meno aggressivo (con minore presenza o assenza di UTR), avendo quindi la possibilità di valutare in misura più precisa l’upgrading del tumore stesso; -I corpuscoli intracitoplasmatici di UTR II tendono ad essere espulsi dalle cellule tumorali .
Abbiamo prodotto ricerche e brevetti per la scoperta dell'UTR II(Recettore dell'urotensina II)La sua intensità di espressione correla direttamente con il grado e l’estensione del tumore
DEGLI ANZIANIIL CARCINOMA PROSTATICO È DIVENUTO, NEGLI ULTIMI ANNI IL TUMORE PIÙ FREQUENTE
Tessuto prostatico benigno con disposizione prevalentemente basale e/o medio basale
nel citoplasma di fini granuli contenenti UTR-Receptors.Benign prostatic tissue showing basal or medio-basal
predominant cytoplasmic ditribution of refined corpuscles of UTR-Receptors.
70%
La scoperta ci ha portati alla costruzione di un test da realizzare con processi “automatizzati” di immunoistochimica, in grado di marcare e misurare, attraverso una reazione biochimica, l’UTR nelle cellule tumorali. Abbiamo così validato un nuovo marcatore che servirà alla valutazione prognostica del cancro alla prostata.
VANTAGGI CLINICI PROGNOSTICI1) determinazione più precisa dell’outcome prognostico dei pazienti, 2) determinazione dell’aggressività della malattia attraverso l’impiego di parametri oggettivi basati sulla determina-zione dell’UTR oltreché sul Gleason; 3) discriminazione tra pazienti ad outcome favorevole da quelli ad outcome sfavorevole in pazienti con Gleason alto (maggiore od uguale a 7) e con Gleason medio-basso; 4) discriminazione tra pazienti ad outcome favorevole da quelli ad outcome sfavorevole con lo stesso stadio di malattia;
Il prodotto è un dispositivo che comprende anticorpi e reagenti. È stato validato, cioè ha superato il regolare processo di validazione clinica nelle strutture cliniche di cui alle pubblicazioni riportate precedentemente. È stato certificato col marchio CE e risulta conforme alla normativa europea. La società Pharma Bullet srl è proprietaria del marchio registrato e della licenza del brevetto internazionale. La società alla fine di Novembre conseguirà la Certificazione di Qualità (dispositivo CE)Il dispositivo “in vitro” si compone dei seguenti componenti: Diluente anticorpo primario Anticorpo primario Bloccante per proteina Bloccante per perossidasi Anticorpo secondario biotinilato HRP streptavidina-coniugato Ematossilina
L’INNOVAZIONE E IL BREVETTO
484.000 PERSONE È LA NEOPLASIA PIÙ FREQUENTE
TRA I SOGGETTI DI SESSO MASCHILE.
IL PRODOTTO E IL PROCESSO
15%DEI CARCINOMIDIAGNOSTICATI
“PEPTIDIC AND NON PEPTIDIC LIGANDS FOR IMMUNODETECTION OF THE RECEPTOR FOR UROTENSIN II” 1. EUROPEAN PATENT: Application N° 12 194 425 0 - Date of filing 08.02.2008 – Legal e�ect since 09.02.2007 (Italian Patent).2. U.S.A. PATENT: pending.3. RUSSIA PATENT: pending.Inoltre è in fase di deposito una domanda di brevetto di prodotto (il test creato “ad hoc”). Infine stiamo sviluppando un anticorpo monoclonale specifico.
VANTAGGI CLINICI DIAGNOSTICIDiagnosi precoce della neoplasia: dopo biopsie random prostatiche la determi-nazione immunoistochimica dell’UTR permette la diagnosi di carcinoma in pazienti che sarebbero altrimenti risultati falsi negativi. L’innovazione si è tradotta in un brevetto europeo già concesso che copre tutte le tecniche di misurazione del marcatore:
Il prodotto consente di e�ettuare l’analisi immunoistochimica del campione bioptico di tumore della prostata attraverso un processo automatizzato e certificato su sistema “Leica Microsystems immune-painting” e automatizzabile su altri sistemi. Le fasi del processo automatizzato sono le seguenti: Smascheramento HER2 Blocco perossidasi Marcatore Blocco Post-primario Polimero Mixed Dab Refine (cromogeno per colorazione) Ematossilina
La società Pharma Bullet srl è proprietaria del marchio e della licenza del brevetto internazionale
Come riportato nella terza pubblicazione, per l’interpretazione del test, un gruppo di anato-mopatologi esperti ha analizzato indipendentemente e alla cieca le reazioni relative agli stessi vetrini su cui erano fissate cellule tumorali di adenocarcinoma prostatico, raggiungendo gli stessi risultati in termini di valutazione. È stato così possibile creare uno “score” sulla base di una misurazione dell’espressione dell’UTR, fondata sull’intensità della colorazione (indice colorimetrico) prodotta da un’immunoreazione intervenuta sulle cellule stesse dopo l’azione del prodotto della Pharma Bullet srl. Per rendere più evidenti l’interpretazione del test e il significato dello “score”, si allega la brochure con le foto di alcune delle principali immunorea-zioni e�ettuate, accompagnate da semplici didascalie. Esse sono state condotte con l’utilizzo di cromogeni diversi: rosso e nero.
1. Le biopsie vengono inserite in contenitori contenenti formalina al 4%.2. I frustoli bioptici sono posizionati in una biocassetta. 3. Le biocassette vengono processate per la disidratazione del tessuto ed incluse in para¤na. 4. Gli inclusi vengono sezionati al microtomo, posizionati su un vetrino portaoggetti, spara¤nate in stufa ed infine colorate con le colorazioni tradizionali.5. Eventuali sezioni da avviare all’immunoistochimica (UTR-II) vengono precedentemente o successivamente posizionate su vetrino elettrostatico.CONCLUSIONECon una singola inclusione in para�na è possibile diagnosticare istologicamente la lesione prostatica e avviare il test UTR-II quando necessario. È quindi su�ciente 1 reazione per ogni vetrino, su cui vengono posizionate le sezioni da analizzare delle biopsie.
55%La neoplasiae cresciuta del
È su�ciente 1 reazione per ogni vetrino, su cui vengono posizionate le sezioni da analizzare delle biopsie.
L’INTERPRETAZIONE DEL TEST LO SCORE L’USO EFFICIENTE
Articolo “Journal of Cellular Biochemistry” 112:341–353 (2011)“Urotensin-II Receptor predicts the clinical outcome of Prostate Cancer patients and Is Involved in the regulation of motility of prostate adenocarcinoma cells”.Il recettore dell’Urotensina II predice l’outcome clinico del tumore della prostata ed è coinvolto nella regolazione della motilità delle cellule di adenocarcinoma prostatico. Paolo Grieco (1), Renato Franco (2) Giuseppina Bozzuto (3), Laura Toccacieli (3), Alessandro Sgambato (5), Monica Marra (5), Silvia Zappavigna (5), Mario Migaldi (6), Giulio Rossi (6), Stefano Striano (7), Luigi Marra (7), Luigi Gallo (7), Achille Cittadini (4), Gerardo Botti (2), Ettore Novellino (3), Agnese Molinari (3), Alfredo Budillon (5), and Michele Caraglia (5)*1. Department of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry, University of Naples Federico II, Naples, Italy2. Pathology Unit, National Institute of Tumours, Fondazione ‘‘G. Pascale’’, Naples, Italy3. Department of Technology and Health, Italian National Institute of Health, Rome, Italy4. Institute of General Pathology, ‘‘Giovanni XXIII’’ Cancer Research Center, Catholic University of Sacred Heart, Rome, Italy5. Experimental Pharmacology Unit, National Institute of Tumours, Fondazione ‘‘G. Pascale’’, Naples, Italy6. Department of Pathology, University of Modena and Reggio Emilia, Modena, Italy7. Uro-Gynecological Department, National Institute of Tumours, Fondazione ‘‘G. Pascale’’, Naples, Italy
LE PUBBLICAZIONI
in meno di 5 anni
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