UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PALERMO ISTITUTO DI CLINICA MEDICA I LA RACCOLTA CONSAPEVOLE

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PALERMOISTITUTO DI CLINICA MEDICA I

LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO

G.L.P.

“ANTICOAGULANTI E ADDITIVI DI USO LABORATORISTICO

LORO INFLUENZA / INTERFERENZA”

Dott. Vincenzo Di GarboM.M.G. – Specialista in Cardiologia

Centro delle Dislipidemie e del Rischio Trombotico

GOOD LABORATORY PRACTICE (“Buona Pratica di Laboratorio”)

LA STANDARDIZZAZIONE DEI METODI DI LABORATORIO

( SIA QUELLI RELATIVI AL PRELIEVO DEL CAMPIONE EMATICO

SIA QUELLI RELATIVI ALL’ESECUZIONE DEI TESTS )

E’ OGGI CONSIDERATA DI FONDAMENTALE IMPORTANZA

E VIENE SOLITAMENTE RIASSUNTA IN UNA DIZIONE

PRESA IN PRESTITO DAGLI ANGLOSASSONI:

La “GOOD LABORATORY PRACTICE”


G.L.P.

NELL’AMBITO DELLE ATTIVITA’

DI UN LABORATORIO DI ANALISI

UN SETTORE DI PARTICOLARE RILIEVO E’ COSTITUITO

DALLO:

“STUDIO DELL’EMOSTASI e DELLA TROMBOSI”,

I CUI TESTS RICHIEDONO

NON SOLO UNA PRECISA COMPETENZA

MA ANCHE UNA PROFESSIONALITA’ SPECIFICA.

FISIOPATOLOGIA EMOSTASI E TROMBOSI

LA FISIOPATOLOGIA DELL’EMOSTASI E DELLA TROMBOSI

RICONOSCE DUE COMPONENTI FONDAMENTALI:

- LE PIASTRINE, CHE INTERVENGONO NELL’EMOSTASI PRIMARIA

(FASE RAPIDA CHE EVOLVE IN POCHI SECONDI)

- I FATTORI DELLA COAGULAZIONE, CHE INTERVENGONO

NELL’EMOSTASI SECONDARIA (FASE LENTA CHE SI ESAURISCE

IN POCHISSIMI MINUTI).

FISIOPATOLOGIA EMOSTASI E TROMBOSI

LE DUE FASI POSSONO ESSERE TENUTE DISTINTE PER I SEGUENTI MOTIVI:

1) ENTRANO IN AZIONE IN SUCCESSIONE TEMPORALE;

2) SI REALIZZANO CON MECCANISMI FISIOLOGICI IN PARTE INDIPENDENTI;

3) POSSONO ESSERE INDAGATE SEPARATAMENTE in laboratorio;

4) POSSONO GENERARE QUADRI PATOLOGICI per alterazioni delle

loro singole componenti (SIA IN SENSO QUANTITATIVO CHE FUNZIONALE);

5) POSSONO ESSERE INFLUENZATE INDIPENDENTEMENTE DA

DIVERSI FARMACI.

EMOSTASI PRIMARIA E SECONDARIA

RUOLO DELLE PIASTRINE – TROMBO BIANCO

LE PIASTRINE, MENTRE SCORRONO LIBERAMENTE SE IL VASO E’

INTEGRO, TENDONO INVECE AD ADERIRE ALLA BRECCIA VASALE

(ADESIVITA’ PIASTRINICA) in particolare al COLLAGENO

SOTTOENDOTELIALE. DOPO L’ADESIONE, LE PIASTRINE INIZIANO AD

AGGREGARE E, MEDIANTE IL RILASCIO PER UN PROCESSO DI

SECREZIONE (RELEASE REACTION) DI COSTITUENTI ENDOPIASTRINICI

(ADP,Trombossani, Fattore Piastrinico 3, Serotonina), RICHIAMANO ALTRE

PIASTRINE CON ULTERIORE ACCRESCIMENTO DEL COSIDETTO

“TROMBO BIANCO”, CHE E’ SUFFICIENTE AD ASSICURARE L’EMOSTASI

IN VASI DI PICCOLO CALIBRO A RIDOTTO REGIME PRESSORIO.

EMOSTASI PRIMARIA(Fase vasculo-piastrinica)

RUOLO DELLE PIASTRINE – TROMBO BIANCO

LA FASE PIASTRINICA HA QUINDI UNA IMPORTANZA NOTEVOLE

NEL DETERMINISMO DELL’EMOSTASI PRIMARIA, MA NON E’

SUFFICIENTE PER L’EMOSTASI DEFINITIVA.

QUESTO SPIEGA LE MANIFESTAZIONI EMORRAGICHE, QUANDO

SONO ALTERATI ALTRI SISTEMI EMOSTATICI, QUALI QUELLI

DELLA COAGULAZIONE, E LA FASE PIASTRINICA E’ NORMALE.

EMOSTASI PRIMARIA(Fase vasculo-piastrinica)

RUOLO DEI FATTORI COAGULATIVI

E’ LA FASE PIU’ IMPORTANTE DELL’EMOSTASI,

CHE PORTA IN CONDIZIONI NORMALI

AD UN ARRESTO PERMANENTE DELL’EMORRAGIA.

LE MANIFESTAZIONI EMORRAGICHE

CONSEGUENTI AD ALTERAZIONI DI QUESTA FASE

SONO INDUBBBIAMENTE PIU’ GRAVI DI QUELLE LEGATE

A COMPROMISSIONI DELLA FASE PIASTRINICA.

EMOSTASI SECONDARIA (Fase coagulativa)


LA COAGULAZIONE SI COMPIE A SEGUITO DELLA FORMAZIONE DI

FIBRINA AD OPERA DI UN ENZIMA PROTEOLITICO, LA TROMBINA,

CHE TRASFORMA UNA PROTEINA DEL PLASMA, IL FIBRINOGENO

(FATTORE I) IN FIBRINA. IL MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE

DEL FIBRINOGENO IN FIBRINA E’ ASSAI COMPLESSO, IN QUANTO

L’ATTIVAZIONE DELLA PROTROMBINA (FATTORE II) IN TROMBINA

E’ PRECEDUTA DA UNA SERIE NUMEROSA DI REAZIONI

ENZIMATICHE SUI FATTORI DELLA COAGULAZIONE,

CATALIZZATE DALLA PRESENZA DI IONI CALCIO.



LE REAZIONI DELLA FASE COAGULATIVA SONO INNESCATE DAL

CONTATTO CON SUPERFICI ESTRANEE (AD ES.,IN VIVO, COLLAGENE

SOTTOENDOTELIALE o, IN LABORATORIO, SUPERFICI DI VETRO o CAOLINO o

AC. ELLAGICO) E PROCEDONO UTILIZZANDO COMPONENTI DI

ORIGINE ESCLUSIVAMENTE EMATICA (VIA INTRINSECA DELLA

COAGULAZIONE) O DA MATERIALE TROMBOPLASTINICO DI

ORIGINE TESSUTALE, DISPONIBILE IN CASO DI LESIONE DI

CONTINUO DELLA PARETE VASCOLARE (VIA ESTRINSECA DELLA

COAGULAZIONE).



NELLA FIGURA DELLA CASCATA COAGULATIVA ERANO

RAFFIGURATI ANCHE I DUE PRINCIPALI TESTS CHE STUDIANO LA

COAGULAZIONE: IL TEMPO DI PROTROMBINA (PT) , CHE ESPLORA

IL SISTEMA ESTRINSECO, E IL TEMPO DI TROMBOPLASTINA

PARZIALE ATTIVATO (aPTT), CHE ESPLORA IL SISTEMA

INTRINSECO.

L’ESECUZIONE DI QUESTI DUE TESTS CONSENTE DI VERIFICARE

NON SOLO LA PRESENZA NEL SISTEMA DI TUTTI I FATTORI DELLA

COAGULAZIONE, MA ANCHE SE SONO TUTTI FUNZIONALMENTE

EFFICIENTI.


TESTS DI LABORATORIO

TEST DI AGGREGABILITA’ PIASTRINICA ( sec. Born )

RUOLO DEGLI INIBITORI

IL SISTEMA COAGULATIVO E’ UN SISTEMA A CASCATA

AUTOAMPLIFICANTE (UNA VOLTA CHE UN PROENZIMA SI ATTIVA VA AD AGIRE

SUL FATTORE SUCCESSIVO TRASFORMANDOLO IN ENZIMA ATTIVO E COSì VIA) ,

CHE CULMINA NELL’ESPLOSIVA TRASFORMAZIONE

DEL FIBRINOGENO IN FIBRINA.

LE REAZIONI ENZIMATICHE DELLA COAGULAZIONE SONO,

COMUNQUE, CONTROLLATE E MODULATE DAGLI “INIBITORI

FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE”, CHE RIVESTONO UNA

FONDAMENTALE IMPORTANZA NELLA IDENTIFICAZIONE DEI

PAZIENTI A RISCHIO PER TROMBOSI VENOSE ED ARTERIOSE.

GLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE

ANTITROMBINA III – PROTEINA C / PROTEINA S

L’ANTITROMBINA III (AT III) E’ UN INIBITORE FISIOLOGICO DELLA

TROMBINA, DEL FATTORE X ATTIVATO (F. Xa) E DI ALTRE

PROTEASI SERINICHE DELLA CASCATA COAGULATIVA;

E’ DETTA ANCHE CO-FATTORE EPARINICO, PERCHE’ L’EPARINA ACCELERA

GRANDEMENTE LA SUA AZIONE DI CONTROLLO DELLA COAGULAZIONE.

LA PROTEINA C e LA PROTEINA S SONO PROTEINE VITAMINA K

DIPENDENTI CHE INIBISCONO IL F. VIII ED IL F. V.

IN PARTICOLARE E’ LA STESSA TROMBINA CHE LEGANDOSI ALLA

TROMBOMODULINA ENDOTELIALE ATTIVA LA PROTEINA C, LA CUI AZIONE

INIBENTE VIENE ACCELERATA DAL SUO COFATTORE PROTEINA S.


ALTERAZIONI CONGENITE e S. TROMBOFILICA

NELLE TROMBOSI VENOSE O ARTERIOSE, DI RECENTE SONO

STATE IDENTIFICATE MUTAZIONI CHE POSSONO GENERARE UNA

CONDIZIONE DI PREDISPOSIZIONE ALLE MALATTIE

TROMBOEMBOLICHE quali: IL DEFICIT DI ANTITROMBINA III, DI

PROTEINA C, DI PROTEINA S, IL FATTORE V DI LEIDEIN, LA

MUTAZIONE DELLA PROTROMBINA E LE DISFIBRINOGENEMIE.

TALI CONDIZIONI PRESENTI DA SOLE O IN VARIA COMBINAZIONE

HANNO PERMESSO DI IDENTIFICARE “GRUPPI FAMILIARI AD

ALTISSIMO RISCHIO TROMBOEMBOLICO” CON NECESSITA’ DI UN

TRATTAMENTO ANTICOAGULANTE PREVENTIVO.


COMPONENTE ANTI-EMOSTASTICA

LA FIBRINOLISI E’ IN REALTA’ UNA COMPONENTE

ANTI-EMOSTATICA, IN QUANTO LA SUA ATTIVAZIONE

DETERMINA LA DISSOLUZIONE DEL COAGULO DI FIBRINA.

TUTTAVIA E’ IMPORTANTE CONSIDERARE LA FIBRINOLISI NEL

CONTESTO DELL’EMOSTASI, PERCHE’ UNA SUA ALTERAZIONE

PUO’ ESSERE RESPONSABILE SIA DI FENOMENI TROMBOTICI

CHE EMORRAGICI.

IL SISTEMA FIBRINOLITICO

LA PLASMINA

IL PRODOTTO FINALE DELLA FIBRINOLISI E’ LA PLASMINA,

ENZIMA PROTEOLITICO, CAPACE DI LISARE LA FIBRINA DEL

TROMBO (QUESTA REAZIONE GENERA IL COSIDETTO D-DIMERO).

TUTTAVIA LA CAPACITA’ LITICA DI QUESTO ENZIMA SI ESTENDE

SU ALTRI FATTORI DELLA COAGULAZIONE, FRA CUI ANCHE

IL FIBRINOGENO (QUESTA AZIONE GENERA I COSIDDETTI FDP).

IN ALCUNI STATI PATOLOGICI (C.I.D., CIRROSI) SI PUO’

EVIDENZIARE UNA IPERPLASMINEMIA, CHE PROVOCA UNA

GRAVE DEPLEZIONE DEI FATTORI COAGULATIVI E CHE SI

MANIFESTA CON IMPONENTI EMORRAGIE.


ATTIVAZIONE DELLA PLASMINA

LA PLASMINA E’ GENERATA DAL PLASMINOGENO; QUESTA

ATTIVAZIONE PUO’ ESSERE REALIZZATA ATTRAVERSO TRE

DIVERSE VIE: - ATTIVAZIONE INTRINSECA (MEDIANTE IL FATTORE

XIIa, LA CALLICREINA ED IL CHININOGENO AD ALTO PESO MOLECOLARE-

HMWK); - ATTIVAZIONE ESTRINSECA (MEDIANTE L’ATTIVATORE

TISSUTALE DEL PLASMINOGENO (t-PA) RILASCIATO DALLA PARETE

VASALE DOPO DIVERSI STIMOLI: STRESS-ATTIVITA’ FISICA-STASI);

- ATTIVAZIONE FARMACOLOGICA CON UROCHINASI,

STREPTOCHINASI O rTPA.


ANTIATTIVATORI

LE ATTIVAZIONI SIA DELLA VIA INTRINSECA CHE DELLA VIA

ESTRINSECA DELLA FIBRINOLISI, SONO A LORO VOLTA

REGOLATE DALLA PRESENZA DI ANTIATTIVATORI PLASMATICI

(INIBITORE DELL’ATTIVATORE DEL PLASMINOGENO – PAI )

E DALLA PRESENZA DI INIBITORI DELLA PLASMINA CIRCOLANTE

(ALFA-2-ANTIPLASMINA, ALFA-2-MACROGLOBULINA, ANTITROMBINA,

ALFA1-ANTITRIPSINA, INIBITORE DALLA C1-ESTERASI,

ANTICHIMOTRIPSINA).


LE MODALITÀ OPERATIVE DEL LABORATORIO


G.L.P.

LE MODALITÀ OPERATIVE DEL LABORATORIO

LE INDAGINI DI LABORATORIO HANNO COME FINE ULTIMO LA

CONFERMA DI UN SOSPETTO DIAGNOSTICO, LA VERIFICA DI UNA

DIAGNOSI, L’INDICAZIONE AD UNA TERAPIA o IL CONTROLLO

DELL’EFFICACIA DI UNA TERAPIA IN ATTO.

PER ASSOVERE A QUESTE ESIGENZE, OGNI PARAMETRO

INTERESSATO (DAL CAMPIONE ALLA TRASFORMAZIONE DEI DATI

IN UN RISULTATO FINALE) DEVE RISPONDERE A DETERMINATI

CRITERI (SICUREZZA DI QUALITA’)


G.L.P.

ERRORI IN LABORATORIO - METODI DI CONTROLLO

SI POSSONO RILEVARE TRE GRUPPI DI ERRORI: 1) ERRORI GROSSOLANI

DOVUTI PREVALENTEMENTE A SCAMBIO DI REAGENTI, PIPETTE,

STRUMENTI E CAMPIONI (VENGONO EVIDENZIATI PER LA GROSSA DISCREPANZA TRA

VALORI OTTENUTI E ATTESI); 2) ERRORI CASUALI LEGATI ALLA CASUALITA’

CHE COMUNQUE AFFERISCONO A TUTTE LE OPERAZIONI E MISURE;

3) ERRORI SISTEMATICI LEGATI A MODIFICAZIONI PIU’ O MENO GRANDI

DI UN LOTTO DI REAGENTI, DI UNO STRUMENTO O DI UNA METODICA

(SI RIPETONO IN MODO COSTANTE E SONO RICONOSCIUTI DAL CONTROLLO DEI DATI

OTTENUTI PER UN CAMPIONE NOTO CON QUELLI CHE SONO STATI OTTENUTI IN ALTRE

CONDIZIONI DI REAGENTI, DI STRUMENTI O DI OPERATORI).


G.L.P.

CONTROLLO DI QUALITA’ (CQ)

LA VALUTAZIONE DELL’IMPRECISIONE E’ LA MISURA DELLA

CONCORDANZA DEI VALORI MISURATI IN ANALISI RIPETUTE

SULLO STESSO CAMPIONE NELLA STESSA SERIE (Coefficiente di

Variazione INTRASERIE) o TRA SERIE IN GIORNI DIVERSI

(Coefficiente di Variazione TRA SERIE).

L’INSERIMENTO DI PLASMI DI CONTROLLO A

TITOLO NOTO PUO’ ESSERE UNA VALIDA GUIDA PER

L’AFFIDABILITA’ DEI METODI.

“UN METODO PRESENTA UNA BUONA AFFIDABILITA’ SE TUTTI I

VALORI OTTENUTI RIENTRANO IN 2 DS E COMUNQUE NON

SUPERANO UNO SCARTO DEL 5%”.


G.L.P.

IL PAZIENTE :

• Digiuno

• Dieta

• Stress

• Esercizio fisico

• Ora del prelievo

• Trattamenti farmacologici

• Postura


G.L.P.

IL PAZIENTE : IL DIGIUNO- LA DIETA

Un aspetto di grande importanza NELLA RACCOLTA DEL CAMPIONE

DESTINATO ALLE PROVE DI COAGULAZIONE E’ COSTITUITO DAL

DIGIUNO (DI ALMENO 12 ORE). Questo stato è imperativo in quanto tutti

i fattori della coagulazione e le piastrine risentono della presenza in circolo

dei chilomicroni. UN ALTRO DATO DA RACCOGLIERE PRIMA

DELL’ESECUZIONE DEL PRELIEVO E’ LA DIETA SEGUITA DAL PAZIENTE.

Un esempio di particolare rilievo, è la puntualizzazione del regime dietetico

praticato negli ultimi 2-3 giorni nei pazienti sottoposti a terapia con

anticoagulanti orali (in particolare l’ingestione di verdure sia esse crude o

lessate, soprattutto se a foglie larghe, che per le vitamine in esse contenute

possono provocare un falso risultato).


G.L.P.

IL PAZIENTE : LO STRESS-L’ESERCIZIO FISICO-IL FUMO

IL PAZIENTE CHE DEVE SOTTOPORSI AD UN PRELIEVO PER

COAGULAZIONE NON DEVE ESSERE SOTTO STRESS, NON DEVE AVERE

PRATICATO ESERCIZIO FISICO O AVERE FUMATO DA ALMENO 2 ORE,

PERCHE’ TUTTE QUESTE CONDIZIONI NON SOLO POSSONO CREARE

DIFFICOLTA’ AL REPERIMENTO DELLA VENA, MA ANCHE PROVOCARE

UN AUMENTO DELL’EMATOCRITO E UNA ATTIVAZIONE DEI FATTORI

COAGULATIVI E DELLE PIASTRINE CHE CONDIZIONERANNO LE PROVE

DI LABORATORIO.


G.L.P.

IL PAZIENTE : L’ORA DEL PRELIEVO-LA POSTURA

AL FINE DI POTER STANDARDIZZARE LA METODOLOGIA DI RACCOLTA

DEL CAMPIONE EMATICO DESTINATO ALLA COAGULAZIONE SI RENDE

NECESSARIO CHE L’ORA DEL PRELIEVO VENGA POSTA FRA LE 7.30 E LE

8.30, Sia per tenere conto dei ritmi circadiani che per poter effettuare tutte le

determinazioni entro 4 ore. LA POSTURA DEL PAZIENTE CHE SI DEVE

SOTTOPORRE AL PRELIEVO VENOSO PUO’ ESSERE DISTESO SU UNA

LETTIGA o SEDUTO. La sedia dovrà essere comoda ed accogliente, in un

ambiente a temperatura confortevole, mettendo il paziente a suo agio,

rispettando la sua privasy, senza rumori sgradevoli o con musica ad alto

volume. Tutto ciò renderà il prelievo ben accetto dal paziente, che guarderà

l’operatore come una persona amica che non gli arrecherà nocumento.


G.L.P.

IL PRELIEVO VENOSO:

• Il prelievo finalizzato

• Strumentario per il prelievo

• Utilizzazione degli additivi

• Stasi venosa

• Puntura venosa

• Stoccaggio del campione

o contenitorio temperaturao tempoo trasporto


G.L.P.

LA STASI VENOSA

LA STASI VENOSA, INDOTTA DAL POSIZIONAMENTO

DEL LACCIO EMOSTATICO, DEVE ESSERE RIDOTTA AL

MINIMO, IN MODO DA EVITARE UNA CONCENTRAZIONE

DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE ED UN AUMENTO

DELL’EMATOCRITO.


G.L.P.

LO STRUMENTARIO ED IL PRELIEVO

LO STRUMENTARIO PER LA RACCOLTA DEL CAMPIONE

DESTINATO ALLE ANALISI DI LABORATORIO PER L’ESECUZIONE

DI TESTS DELL’EMOSTASI DEVE ESSERE COSTITUITO DA

“MATERIALE ANTICONTATTO” (VETRERIA SILICONIZZATA O

MATERIALE DI PLASTICA): DALLE SIRINGHE ALLE CUVETTE AI

PUNTALI, IN QUANTO L’EFFETTO “CONTATTO” DA’ INIZIO ALLA

COAGULAZIONE PER VIA INTRINSECA, PROVOCANDO UNA

DEPLEZIONE DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE ED

ALTERANDO QUINDI IL RISULTATO FINALE.


G.L.P.

IL PRELIEVO: METODO DELLA DOPPIA SIRINGA

PER IL PRELIEVO, IL METODO MIGLIORE PER EVITARE OGNI POSSIBILE

INTERFERENZA E’ QUELLO DELLA DOPPIA SIRINGA, CON AGHI GROSSI (TIPO 21G)

MONTATI SU SIRINGHE DI PLASTICA DA 10CC. DOPO AVERE ASPIRATO UNA

PICCOLA QUANTITA’ DI SANGUE NELLA SIRINGA VUOTA (QUESTA PROCEDURA

PERMETTE IL LAVAGGIO DELL’AGO ALLONTANANDO I FRUSTOLI DI TESSUTO PENETRATI

NELL’AGO AL MOMENTO DELLA SUA INTRODUZIONE NELLA CUTE E NELLA VENA) SI

DISINSERISCE LA SIRINGA VUOTA E SI INNESTA NELL’AGO TENUTO IN POSIZIONE

LA SIRINGA CONTENTE 1 ML DI SODIO CITRATO AL 3,8% (o 0,11 M/L) ED,

ASPIRANDO LENTAMENTE, SI PORTA LO STANTUFFO SINO ALLA TACCA 10 ML.

ESTRATTA LA SIRINGA DALLA VENA SI PROCEDE AD UNA LENTA OSCILLAZIONE

DELLA SIRINGA PER UNA PERFETTA MISCELA FRA ANTICOAGULANTE E SANGUE

(RAPPORTO 1/10).


G.L.P.

STOCCAGGIO DEL CAMPIONE

PER LE DETERMINAZIONI DI LABORATORIO SULL’EMOSTASI, SI

RENDE IMPERATIVO CHE LE ANALISI VENGANO EFFETTUATE

ENTRO LE 4 ORE DAL PRELIEVO. SE E’ NECESSARIO IL

TRASPORTO, LA PROVETTA, BEN TAPPATA, DEVE ESSERE POSTA

A TEMPERATURA PROSSIMA AI 7-10 C° (E’ SUFFICIENTE UNA BORSA

TERMICA) IN MODO DA RALLENTARE LE ATTIVITA’ ENZIMATICHE

CHE SI ATTIVANO A TEMPERATURA AMBIENTE.

PER ALCUNE ANALISI SI PUO’ PROCEDERE ALLO STOCCAGGIO

DEL CAMPIONE A MENO 70 C°, dopo avere separato il plasma dalla

parte corpuscolata.


G.L.P.

ANTICOAGULANTI ED ADDITIVI

L’IMPIEGO DEGLI ANTICOAGULANTI E’ STATO A LUNGO DISCUSSO IN

LETTERATURA SPECIALISTICA E SI E’ GIUNTI ALLA CONCLUSIONE CHE

IL CITRATO SODICO (0,11M/L – OPPURE 3,8%) RAPPRESENTA L’ANTI-

COAGULANTE CHE GARANTISCE I RISULTATI PIU’ RIPRODUCIBILI.

FRA GLI ADDITIVI, SONO CONSIGLIABILI AL FINE DI INIBIRE LA

REATTIVITA’ PIASTRINICA DELLE SOLUZIONI CONTENENTI TEOFILLINA

E/O PROSTAGLANDINA E2 (ESISTONO IN COMMERCIO PROVETTE CONTENTI

SOLUZIONI GIA’ PREDISPOSTE COME LE “CTAD – TUBES”).

PER I TEST FIBRINOLITICI, ALL’ANTICOAGULANTE E’ NECESSARIO

AGGIUNGERE UN INIBITORE DEGLI ENZIMI PROTEOLITICI (COME L’AC.

EPSILON-AMINO-CAPROICO O L’APROTININA).


G.L.P.

ANTICOAGULANTI:

• Sodio Citrato • Eparina-Na

• EDTA-Na2 • Eparina-Li

• EDTA-K2 • CTAD-Tube

• Fx Sodium fluoride / Potassio Oxalate

• Miscele varie per inibire le piastrine

• Stabilizzanti il sistema fibrinolitico


G.L.P.

IL PRELIEVO PER TESTS DELLA COAGULAZIONE:

– Punti cruciali

• Stasi

• Puntura venosa

• La “schiuma”

• I contenitori

• Il rapporto sangue/anticoagulante

• Temperatura del lettore

• Criticoo < 4 ore dal prelievoo assenza di emolisio siero torbido o opalescenteo altri composti interferenti


G.L.P.

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

NELLA PREPARAZIONE DEL PLASMA PER I TESTS DELLA COAGULAZIONE

UN PUNTO CRUCIALE E’ RAPPRESENTATO DALLA CENTRIFUGAZIONE

DEL CAMPIONE, CHE DEVE ESSERE ESEGUITA A 3.000 GIRI, PER 10 MIN,

IN MODO DA EVITARE LA COMPARSA DI EMOLISI ED ALLONTANARE

TUTTA LA PARTE CORPUSCOLATA, SOPRATTUTTO LE PIASTRINE, CHE

POSSONO ACCELERARE LE REAZIONI COAGULATIVE.

ALLA FINE DELLA CENTRIFUGAZIONE, SE IL PLASMA E’ OPALESCENTE

PER LA PRESENZA DI ELEVATI LIVELLI DI CHILOMICRONI E’ NECESSARIO

RIPETERE LA CENTRIFUGAZIONE PER ALLONTANARE AL MASSIMO LE

PARTICELLE LIPIDICHE.


G.L.P.

PRINCIPALI TEST EMOCOAGULATIVI

TRA GLI ESAMI DI LABORATORIO DI PIU’ FREQUENTE RICHIESTA IN

CAMPO EMOCOAGULATIVO SONO: - IL TEMPO DI PROTROMBINA (PT),

- IL TEMPO DI TROMBOPLASTINA ATTIVATO (aPTT) ed IL DOSAGGIO DEL

- FIBRINOGENO (FB).

I METODI DI LABORATORIO DI PIU’ LARGA DIFFUSIONE SONO FONDATI

SULLA VELOCITA’ DI FORMAZIONE DEL COAGULO (END POINT

COAGULATIVO), DA CUI SI RISALE ALLA CONCENTRAZIONE

PLASMATICA.

SONO IN COMMERCIO ALTRI METODI BASATI SULLO SVILUPPO DI

COLORAZIONE (TESTS CROMOGENICI), IL CUI IMPIEGO TROVA OGGI

LARGO IMPIEGO NEI METODI AUTOMATIZZATI.


G.L.P.

POSSIBILI DIFETTI DELL’EMOSTASI ESPLORATA MEDIANTE I TEST DI COMUNE IMPIEGO

METODI PER IL DOSAGGIO DEL FIBRINOGENO (FATTORE I)

a) Metodi basati sulla precipitazione specifica

b) Metodi immunologici dosaggio di tutta la proteina

c) Metodi chimici e cinetici funzione della molecola


G.L.P.

aPTT (v-n. 30-40 sec.)

LA DETERMINAZIONE DELL’APTT NON PRESENTA PARTICOLARI

DIFFICOLTA’, ANCHE SE UNA CERTA DIFFERENZA DI RISULTATI

PUO’ ESSERE EVIDENZIATA IN RELAZIONE AL MATERIALE CHE

VIENE UTILIZZATO PER DARE INIZIO ALLA COAGULAZIONE.

ESISTONO, INFATTI, METODI CHE IMPIEGANO IL CAOLINO ED

ALTRI CHE IMPIEGANO L’AC. ELLAGICO; ENTRAMBI AGISCONO

SULLA VIA INTRINSECA INNESCANDO LA REAZIONE

COAGULATIVA DAL FATTORE XII (DENOMINATO ANCHE FATTORE

“CONTATTO”).


G.L.P.

aPTT

IL SUO IMPIEGO NELLA DIAGNOSTICA E’ MOLTO DIFFUSO

PERCHE’ E’ IN GRADO DI RISPONDERE ALLA DOMANDA SE

TUTTI I FATTORI DELLA COAGULAZIONE SONO PRESENTI E

FUNZIONALMENTE ATTIVI: IN PRESENZA DI DIFETTI CONGENITI

O ACQUISITI DI FATTORI COAGULATIVI SI AVRA’, INFATTI,

UN ALLUNGAMENTO DEL SUO VALORE.

VIENE USATO, ANCHE, NEL MONITORAGGIO DELLA TERAPIA

EPARINICA (UN VALORE 2-3 VOLTE LA NORMA INDICA TERAPIA EPARINICA

CORRETTA)


G.L.P.

PT (SORVEGLIANZA TAO)

QUESTO TEST (Valori normali: 12-14 sec. oppure 80-100%)

HA OGGI UNA GRANDE RICHIESTA PER IL MONITORAGGIO

DELLA TERAPIA ANTICOAGULANTE (T.A.O.)

NEL TRATTAMENTO E NELLA PREVENZIONE

DELLE TROMBOEMBOLIE

E NEI PAZIENTI PORTATORI

DI PROTESI VALVOLARI CARDIACHE.


G.L.P.

INDICAZIONI ALLA TERAPIA ANTICOAGULANTE

TERAPIA ANTICOAGULANTECARATTERISTICHE ED INDICAZIONI DEGLI

ANTICOAGULANTI

a) ANTICOAGULANTI DIRETTI (EPARINA ED EPARINOIDI) BLOCCANO RAPIDAMENTE LE REAZIONI COAGULATIVE CHE

PORTANO ALLA FORMAZIONE DEL TROMBO. b) ANTICOAGULANTI INDIRETTI (FARMACI ANTI VITAMINA K) RIDUCONO CON EFFETTO FARMACOLOGICO RITARDATO

(> 24 ORE) LA SINTESI EPATICA E LA CONCENTRAZIONE PLASMATICA DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE F.II – F.VII – F. IX – F. X , CON MARCATO RALLENTAMENTO DELLA FORMAZIONE DEL TROMBO.

c) ANTIPIASTRINICI (ASA-TICLOPIDINA-CLOPIDOGREL) INIBISCONO O RIDUCONO CON EFFETTO DOSE DIPENDENTE

TUTTE LE REAZIONI PIASTRINICHE PROLUNGANDO LA FASE INIZIALE DELL’EMOSTASI (VASCULO – PIASTRINICA).

TERAPIA ANTICOAGULANTE

a) DIRETTI : EPARINE – EPARINOIDI (EPARINA SODICA– EPARINA CALCICA – LMW EPARINA)

b) INDIRETTI : FARMACI ANTIVITAMINA K (WARFARINA- ACENOCUMAROLO)

c) ANTIPIASTRINICI : FARMACI ANTIAGGREGANTI (ASA – TICLOPIDINA – CLOPIDOGREL – ETC.)

d) FIBRINOLITICI : FARMACI FIBRINOLITICI (UROKINASI – STREPTOCHINASI – rTPA)


ANTICOAGULANTI INDIRETTI

FARMACI ANTIVITAMINA K

WARFARINA = COUMADIN

ACENOCUMAROLO = SINTROM


FARMACI ANTIVITAMINA K (WARFARINA- ACENOCUMAROLO)

Sono gli anticoagulanti piu’ utilizzati, in quanto vengono assorbiti per via orale in misura pressochè completa e abbastanza costante.

La distribuzione è caratterizzata da una elevata percentuale di legame alla sieroproteine (circa il 97%).

Il decadimento plasmatico (T1/2 circa 35 ore per la warfarina e un po’ minore per l’acenocumarolo: 24 ore) dipende dalla velocità di biotrasformazione epatica (sono possibili infatti fenomeni di induzione enzimatica).

L’eliminazione di entrambi avviene prevalentemente per via urinaria, sotto forma di metaboliti inattivi.

FATTORI VITAMINA K-DIPENDENTEF.II F.VII F.IX F.X

PIVKA

Il blocco della carbossilazione rende i fattori VITAMINA K-

dipendenti (F.II, VII, IX e X) incapaci di legarsi ai calcio

ioni e quindi ai fosfolipidi di membrana, tappe essenziali

per la loro attivita’ procoagulante (PIVKA: Proteins

Induced By Vitamin K Absence Or Antagonist).

FATTORI VITAMINA K-DIPENDENTEF.II F.VII F.IX F.X

VITAMINA K

LA VITAMINA K (DA KOAGULATION = COAGULAZIONE) E’ UNA VITAMINA

LIPOSOLUBILE, CHE NON SINTETIZZATABILE DALL’ORGANISMO UMANO.

ESISTE IN NATURA SOTTO DUE FORME DERIVATE DAL MENADIONE: LA VITAMINA

K1 (presente nelle foglie verdi ed in altri vegetali); LA VITAMINA K2 ( sintetizzata dalla

flora batterica intestinale).

NELL’UOMO E’ DIFFICILE CHE SI MANIFESTI AVITAMINOSI K PER CAUSE

ALIMENTARI; SI POSSONO VERIFICARE INVECE SINDROMI CARENZIALI QUANDO

LA FLORA BATTERICA SIA STATA MODIFICATA PER TRATTAMENTI ANTIBIOTICI E

NELLE FORME IN CUI SI ABBIA UN ALTERATO ASSORBIMENTO INTESTINALE DEI

LIPIDI COME NELL’ITTERO OSTRUTTIVO, oppure NEL NEONATO QUANDO LE

RISERVE DI VITAMINA K DI PROVENIENZA MATERNA SONO INSUFFICIENTI E LA

FLORA BATTERICA INTESTINALE E’ ANCORA SCARSA.


G.L.P.

VITAMINA K

BISOGNA RACCOMANDARE AL PAZIENTE DI NON MODIFICARE

DRASTICAMENTE LE PROPRIE ABITUDINI ALIMENTARI, MA

CERCARE DI ASSUMERE UN QUANTITATIVO COSTANTE DI

VITAMINA K CON LA DIETA, SENZA SUPERARE UN APPORTO

GIORNALIERO DI 200-300 MICROGRAMMI.

POTREBBE ESSERE UTILE FORNIRE AI PAZIENTI UN ELENCO DI

PRODOTTI ALIMENTARI, CON L’INDICAZIONE DELLA QUANTITA’ DI

VITAMINA K IN ESSI CONTENUTA, ED ESPRESSA IN

MICROGRAMMI.


G.L.P.

VITAMINA K

STANDARDIZZAZIONE TROMBOPLASTINE

I METODI AD END POINT COAGULATIVO RICHIEDONO L’AGGIUNTA AL PLASMA IN

ESAME DI TROMBOPLASTINA ESOGENA E IONI CALCIO, PER CUI

LA VELOCITA’ DELLA REAZIONE PER LA FORMAZIONE DEL COAGULO RISULTA

CORRELATA SOPRATTUTTO ALLA QUALITA’ E ALLA FUNZIONALITA’

DELLA TROMBOPLASTINA IMPIEGATA.

PER UNA STANDARDIZZAZIONE SICURA DEI RISULTATI, E’ STATA OTTENUTA UNA

TROMBOPLASTINA DI RIFERIMENTO, CHE POSSIEDE UNA DETERMINATA

SENSIBILITA’ (INTERNATIONAL REFERENCE PREPARATION – I.R.P.). A CUI

TUTTE LE TROMBOPLASTINE COMMERCIALI DEVONO RAPPORTARSI. QUESTO STANDARD CONSENTE DI SEPARARE COMPLETAMENTE I PAZIENTI

SOTTO TERAPIA CON ANTICOAGULANTE ORALE DAI SOGGETTI NORMALI.


G.L.P.

INTERNAZIONAL SENSITIVITY INDEX (I.S.I.)

SE IN UNA CARTA DOPPIO LOGARITMICA SI METTONO A CONFRONTO LA

TROMBOPLASTINA STANDARD INTERNATIONAL REFERENCE PREPARATION (I.R.P.

) E LA TROMBOPLASTINA COMMERCIALE IN USO, SI OTTIENE UNA RETTA

DI CORRELAZIONE CHE PRESENTA UNA PENDENZA (CHIAMATA SLOPE),

CHE CI PERMETTE DI CALCOLARE L’I.S.I. (INTERNATIONAL SENSITIVITY INDEX).

I.S.I.= SLOPE X (I.S.I – I.R.P)

TUTTE LE TROMBOPLASTINE COMMERCIALI RIPORTANO IL LORO I.S.I.,

CHE PROVIENE PROPRIO DAL CONFRONTO DELLA SENSIBILITà DELLA

TROMBOPLASTINA IMPIEGATA E LA TROMBOPLASTINA DI RIFERIMENTO.


G.L.P.

VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITÀ DELLA TROMBOPLASTINA IN CONFRONTO CON I.R.P.

INTERNAZIONAL NORMALIZED RATIO (I.N.R.)

IL CALCOLO DELL’I.N.R. VIENE EFFETTUATO

MEDIANTE IL RAPPORTO DEL TEMPO DI REAZIONE DEL

CAMPIONE (ESPRESSO IN SECONDI) ED IL TEMPO DI REAZIONE DEL

PLASMA NORMALE (ESPRESSO IN SECONDI) ED IL RISULTATO

CORRETTO PER L’I.S.I. DELLA TROMBOPLASTINA IMPIEGATA.

NEI SOGGETTI IN TRATTAMENTO ANTICOAGULANTE

IL VALORE DI I.N.R. DEVE ESSERE COMPRESO TRA 2.0 E 4.5 (IN

RELAZIONE ALLE PATOLOGIE).


G.L.P.

I.N.R. = INTERNATIONAL NORMALIZED RATIO

PR = Tempo di reazione del campione (secondi)

I.N.R. = PR

I.S.I. = INTERNATIONAL SENSITIVITY INDEX

Tempo di reazione nel plasma normale (secondi)

ISI


G.L.P.

TRATTAMENTO CON ANTICOAGULANTI ORALI

COMPLICANZE EMORRAGICHEDELLA TERAPIA ANTICOAGULANTE

CONCLUSIONI (I)

LA BUONA PRATICA DI LABORATORIO RICHIEDE COMPETENZA E

PROFESSIONALITA’ IN OGNI ATTO SANITARIO CHE PUO’ ESSERE

CAUSA DI ERRORE NEL RISULTATO FINALE

(LE CARATTERISTICHE DEL PAZIENTE, LA CORRETTA ESECUZIONE

DEL PRELIEVO VENOSO, LA SCELTA DEGLI ANTICOAGULANTI E

DEGLI ADDITIVI, LE CARATTERISTICHE DEL METODO UTILIZZATO, LA

SCELTA DEI REATTIVI , LA STANDARDIZZAZIONE DEL METODO E DEI

REATTIVI IMPIEGATI).

GOOD LABORATORY PRACTICE (“buona pratica di laboratorio”)

CONCLUSIONI (II)

LA BUONA PRATICA DI LABORATORIO

E’ FONDAMENTALE AL FINE DI UN RISULTATO

CORRETTO ED AFFIDABILE PER IL MEDICO, CHE

DA QUELLE RISULTANZE DOBBIAMO SOTTOLINEARE

TRAE DELLE CONCLUSIONI DIAGNOSTICHE

E TERAPEUTICHE.

GOOD LABORATORY PRACTICE (“buona pratica di laboratorio”)

Date post:	24-Jan-2016
Category:	Documents
Upload:	ansel
View:	49 times
Download:	0 times

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PALERMO ISTITUTO DI CLINICA MEDICA I LA RACCOLTA CONSAPEVOLE

Documents