I VACCINII VACCINI

BASE RAZIONALEBASE RAZIONALE

UNA PRECEDENTE RISPOSTA IMMUNE UNA PRECEDENTE RISPOSTA IMMUNE VERSO UN MICRORGANISMO RENDE VERSO UN MICRORGANISMO RENDE

UN INDIVIDUO MENO SUSCETTIBILE O UN INDIVIDUO MENO SUSCETTIBILE O ANCHE RESISTENTE AD UNA ANCHE RESISTENTE AD UNA

INFEZIONE DA PARTE DELLO STESSO INFEZIONE DA PARTE DELLO STESSO AGENTE INFETTIVOAGENTE INFETTIVO

I VACCINII VACCINI

DEFINIZIONEDEFINIZIONE

MICRORGANISMI, VIRUS, MATERIALI DI MICRORGANISMI, VIRUS, MATERIALI DI ORIGINE MICROBICA (TOSSINE) RESI ORIGINE MICROBICA (TOSSINE) RESI POCO O PER NULLA DANNOSI PER POCO O PER NULLA DANNOSI PER

L’ORGANISMO, MA IN GRADO DI L’ORGANISMO, MA IN GRADO DI FUNZIONARE DA ANTIGENIFUNZIONARE DA ANTIGENI

I VACCINII VACCINI

VACCINAZIONEVACCINAZIONE

INOCULAZIONE DI VACCINI PER INOCULAZIONE DI VACCINI PER INDURRE UNA RISPOSTA INDURRE UNA RISPOSTA

IMMUNITARIA SIMILE A QUELLA CHE IMMUNITARIA SIMILE A QUELLA CHE SI OSSERVA NELL’INFEZIONE SI OSSERVA NELL’INFEZIONE

NATURALE, IN ASSENZA DI MALATTIANATURALE, IN ASSENZA DI MALATTIA

CENNI STORICI E. JENNER (FINE ‘700)E. JENNER (FINE ‘700)

SCOPERTA DEL PRINCIPIO DELLA SCOPERTA DEL PRINCIPIO DELLA VACCINAZIONE (VAIOLO)VACCINAZIONE (VAIOLO)

PASTEUR (FINE ‘800)PASTEUR (FINE ‘800)

ATTENUAZIONE DI MICRORGANISMI ATTENUAZIONE DI MICRORGANISMI PATOGENIPATOGENI

WRIGHTWRIGHT

USO DI VACCINI IN TERAPIAUSO DI VACCINI IN TERAPIA

VACCINI VACCINI TRADIZIONALITRADIZIONALI

BATTERICIBATTERICI- ANATOSSINE O TOSSOIDI- ANATOSSINE O TOSSOIDI

- BATTERI- BATTERI

VIRALI (CON ORGANISMI)VIRALI (CON ORGANISMI)- INATTIVATI- INATTIVATI

- ATTENUATI- ATTENUATI

VACCINI VACCINI BATTERICIBATTERICI

1.1. ANATOSSINE O TOSSOIDIANATOSSINE O TOSSOIDI

ESOTOSSINE BATTERICHE PRIVE DEL ESOTOSSINE BATTERICHE PRIVE DEL POTERE TOSSICO, MA CON POTERE TOSSICO, MA CON INALTERATE PROPRIETA’ INALTERATE PROPRIETA’

ANTIGENICHEANTIGENICHE

(ES. V. ANTIDIFTERICO E ANTITETANICO)(ES. V. ANTIDIFTERICO E ANTITETANICO)

VACCINI VACCINI BATTERICIBATTERICI

2.2. BATTERIBATTERI

a)a) PATOGENI UCCISIPATOGENI UCCISI V. ANTITIFICOV. ANTITIFICO V. CONTRO V. CONTRO Rickettsia prowazekiiRickettsia prowazekii (TIFO (TIFO

PETECCHIALE)PETECCHIALE)

VACCINI VACCINI BATTERICIBATTERICI

b)b) VARIANTI APATOGEN VIVENTIVARIANTI APATOGEN VIVENTI

V. ANTITUBERCOLARE (B.C.G.: bacillo V. ANTITUBERCOLARE (B.C.G.: bacillo di Calmette e Guerin)di Calmette e Guerin)

V. ANTITIFICO (CEPPO ATTENUATO Ty V. ANTITIFICO (CEPPO ATTENUATO Ty 21 DI 21 DI Salmonella typhiSalmonella typhi))

VACCINI VIRALIVACCINI VIRALI

1.1. VIRUS INATTIVATIVIRUS INATTIVATIVIRUS CHE HANNO PERSO LA CAPACITA’ VIRUS CHE HANNO PERSO LA CAPACITA’

REPLICATIVA. NON HANNO POTERE REPLICATIVA. NON HANNO POTERE INFETTANTE O PATOGENO, MA INFETTANTE O PATOGENO, MA CONSERVANO IL POTERE ANTIGENICOCONSERVANO IL POTERE ANTIGENICO

PUNTO CHIAVE: PUNTO CHIAVE: INATTIVAZIONEINATTIVAZIONE

(ES. POLIOVIRUS, VIRUS DELL’EPATITE A, (ES. POLIOVIRUS, VIRUS DELL’EPATITE A, DELL’INFLUENZA, DELLA RABBIA…)DELL’INFLUENZA, DELLA RABBIA…)

VACCINI VIRALIVACCINI VIRALI2.2. VIRUS ATTENUATIVIRUS ATTENUATI

PREPARAZIONI VIRALI CHE MANTENGONO PREPARAZIONI VIRALI CHE MANTENGONO INALTERATO IL LORO POTERE ANTIGENICO, INALTERATO IL LORO POTERE ANTIGENICO,

DOTATE DI CAPACITA’ REPLICATIVA LIMITATA DOTATE DI CAPACITA’ REPLICATIVA LIMITATA NELL’OSPITE SENZA INDURRE MANIFESTAZIONI NELL’OSPITE SENZA INDURRE MANIFESTAZIONI

PATOLOGICHE E CON CARATTERISTICHE PATOLOGICHE E CON CARATTERISTICHE ATTENUATE STABILI NEL TEMPOATTENUATE STABILI NEL TEMPO

PUNTO CHIAVE: PUNTO CHIAVE: CONTAMINAZIONECONTAMINAZIONE

(ES. POLIOVIRUS, VIRUS DEL MORBILLO, DELLA (ES. POLIOVIRUS, VIRUS DEL MORBILLO, DELLA PAROTITE, DELLA ROSOLIA, VARICELLA-PAROTITE, DELLA ROSOLIA, VARICELLA-ZOSTER…)ZOSTER…)

Live attenuated virus vaccinesLive attenuated virus vaccines

Successful live attenuated vaccines are effective for 3 reasons:Successful live attenuated vaccines are effective for 3 reasons: The attenuated viruses replicate to some extent in the hostThe attenuated viruses replicate to some extent in the host The attenuated viruses have a reduced capacity to spread The attenuated viruses have a reduced capacity to spread

from the site of replicationfrom the site of replication The attenuated viruses cause mild or inapparent disease.The attenuated viruses cause mild or inapparent disease.

LIMITI DEI VACCINI LIMITI DEI VACCINI TRADIZIONALITRADIZIONALI

CRESCITA IN COLTURA DELI AGENTI INFETTIVICRESCITA IN COLTURA DELI AGENTI INFETTIVI COSTICOSTI MISURE DI SICUREZZAMISURE DI SICUREZZA INVOLONTARIA DIFFUSIONE DELLA MALATTIAINVOLONTARIA DIFFUSIONE DELLA MALATTIA POSSIBILE REVERSIONE DEL CEPPO POSSIBILE REVERSIONE DEL CEPPO

ATTENUATOATTENUATO NON EFFICACI PER TUTTE LE MALATTIE (ES. NON EFFICACI PER TUTTE LE MALATTIE (ES.

AIDS)AIDS) PROBLEMI DI CONSERVAZIONEPROBLEMI DI CONSERVAZIONE

VACCINI DI NUOVA GENERAZIONE VACCINI DI NUOVA GENERAZIONE (TECNOLOGIA DEL DNA (TECNOLOGIA DEL DNA

RICOMBINANTE)RICOMBINANTE) VACCINI SUBUNITA’VACCINI SUBUNITA’ V. PEPTIDICIV. PEPTIDICI V. ATTENUATI TRAMITE MANIPOLAZIONE V. ATTENUATI TRAMITE MANIPOLAZIONE

GENETICAGENETICA VETTORI VACCINICIVETTORI VACCINICI VACCINI GENETICIVACCINI GENETICI

VACCINI SUBUNITA’VACCINI SUBUNITA’UTILIZZANO COMPONENTI DELL’ORGANISMO UTILIZZANO COMPONENTI DELL’ORGANISMO

PATOGENO ANZICHE’ L’ORGANISMO PATOGENO ANZICHE’ L’ORGANISMO INTEROINTERO

VANTAGGIVANTAGGI STABILI E SICURISTABILI E SICURI PRIVI DI EFFETTI COLLATERALI INDESIDERABILIPRIVI DI EFFETTI COLLATERALI INDESIDERABILI

SVANTAGGISVANTAGGI PURIFICAZIONE COSTOSAPURIFICAZIONE COSTOSA ALTERAZIONE DELLA CONFORMAZIONE NATIVA ALTERAZIONE DELLA CONFORMAZIONE NATIVA

>>ALTERAZIONE DELL’ANTIGENICITA’ALTERAZIONE DELL’ANTIGENICITA’

New MethodsNew Methods

• Recombinant DNA

•Single gene (subunit)

S-antigen mRNA

cDNA

Express plasmid

S-antigen mRNA

protein

Hepatitis B vaccine

raised in yeast

PRODUZIONE DI VACCINO CONTRO EPATITE B IN LIEVITOPRODUZIONE DI VACCINO CONTRO EPATITE B IN LIEVITO

-VACCINI ATTENUATI SONO VIRUS ALTERATI IN MODO CHENON POSSANO PIU’ RIPRODURSI NELL’ORGANISMO IN CUIVENGONO INOCULATI

-QUESTI VACCINI SONO POTENZIALMENTE PERICOLOSI :POSSONO ESSERE CONTAMINATI CON VIRUS INFETTIVI -TENTATIVI DI PRODURRE ANTIGENE DI SUPERFICIE DI VIRUS EPATITE B (HBsAg) IN E. Coli FALLIRONO

-IL GENE CODIFICANTE HBsAg E’ STATO CLONATO IN UN VETTORE DI ESPRESSIONE DI LIEVITO.

-LIEVITO TRASFORMATO CON QUESTO VETTORE PRODUCEELEVATE QUANTITA’ DI HBsAg

-UTILIZZANDO FERMENTATORI E’ POSSIBILE OTTENERE50-100 mg DI PROTEINA PER LITRO DI COLTURA

PRODUZIONE DIPRODUZIONE DI VACCINO CONTRO VACCINO CONTRO

EPATITE BEPATITE B IN LIEVITOIN LIEVITO

VACCINI SUBUNITA’: VACCINI SUBUNITA’: VIRUS DELL’HERPES VIRUS DELL’HERPES

SIMPLEXSIMPLEXHSV:HSV:

TRASMISSIONE DI MALATTIE PER VIA TRASMISSIONE DI MALATTIE PER VIA SESSUALESESSUALE

GRAVI INFEZIONI DELL’OCCHIOGRAVI INFEZIONI DELL’OCCHIO ENCEFALITEENCEFALITE AGENTE ONCOGENOAGENTE ONCOGENO

VACCINI SUBUNITA’: VIRUS DELL’HERPES

SIMPLEX VACCINO TRADIZIONALE:V. CON VIRUS UCCISO O ATTENUATO >

ESPOSIZIONE A RISCHIO DI TUMORE

VACCINO DI NUOVA GENERAZIONE:V. SUBUNITA’> PRIVO DI AZIONE

ONCOGENA

CREAZIONE DI UN VACCINO CREAZIONE DI UN VACCINO SUBUNITA’ ANTI-HSV-1SUBUNITA’ ANTI-HSV-1

IDENTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI DEL VIRUS IDENTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI DEL VIRUS CHE SUSCITANO GLI ANTICORPI CAPACI DI CHE SUSCITANO GLI ANTICORPI CAPACI DI

REAGIRE CONTRO LA FORMA INTATTA DEL VIRUS REAGIRE CONTRO LA FORMA INTATTA DEL VIRUS STESSOSTESSO

GLICOPROTEINA DGLICOPROTEINA D (gD) DELL’INVOLUCRO DI HSV (gD) DELL’INVOLUCRO DI HSV TIPO I (HSV-1)TIPO I (HSV-1)

CREAZIONE DI UN VACCINO SUBUNITA’ ANTI-HSV-1

(Difficile da purificare)

(Solubile)

(Cellula ospite)

CLONAZIONE DEL GENE gD MODIFICATO IN UN VETTOTE DI ESPRESSIONE EUCARIOTICO

TRASFEZIONE IN CELLULE DI OVAIO DEL CRICETO CINESE (CHO)

GLICOSILAZIONE E SECREZIONE NEL MEZZO ESTERNO DEL PRODOTTO

FORMA MODIFICATA DI gD

EFFICACE SIA CONTRO HSV-1 CHE HSV-2

TUBERCOLOSI: TUBERCOLOSI: Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis

VACCINO ATTUALMENTE IN USO IN ALCUNI PAESI:VACCINO ATTUALMENTE IN USO IN ALCUNI PAESI:

V. DI CALMETTE-GUERIN (BCG):V. DI CALMETTE-GUERIN (BCG): CEPPO DI CEPPO DI Mycobacterium bovisMycobacterium bovis VIVO VIVO

CONTESTAZIONICONTESTAZIONI CAUSA DI MALATTIE IN PZ IMMUNODEPRESSI CAUSA DI MALATTIE IN PZ IMMUNODEPRESSI

(AIDS…)(AIDS…) IMPOSSIBILITA’ DI DISTINGUERE GLI INDIVIDUI IMPOSSIBILITA’ DI DISTINGUERE GLI INDIVIDUI

REALMENTE AFFETTI DA TUBERCOLOSI DA REALMENTE AFFETTI DA TUBERCOLOSI DA QUELLI VACCINATI CON BCGQUELLI VACCINATI CON BCG

TENTATIVI DI CREAZIONE DI UN TENTATIVI DI CREAZIONE DI UN VACCINO PIU’ SICURO ED EFFICACE VACCINO PIU’ SICURO ED EFFICACE

CONTRO CONTRO LA TUBERCOLOSI (V. SUBUNITA’)LA TUBERCOLOSI (V. SUBUNITA’)COLTIVAZIONE DI COLTIVAZIONE DI M. tuberculosisM. tuberculosis IN MEZZO LIQUIDO IN MEZZO LIQUIDO

ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DI 6 PROTEINE ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DI 6 PROTEINE (EXTRACELLULARI)(EXTRACELLULARI) SECRETE SECRETE

UTILIZZO DI TALI PROTEINE (SINGOLARMENTE ED IN UTILIZZO DI TALI PROTEINE (SINGOLARMENTE ED IN COMBINAZIONE) PER IMMUNIZZARE LE CAVIECOMBINAZIONE) PER IMMUNIZZARE LE CAVIE

LE COMBINAZIONI DI PROTEINE PURIFICATE ASSICURANO LE COMBINAZIONI DI PROTEINE PURIFICATE ASSICURANO LO STESSO LIVELLO DI PROTEZIONE FORNITO LO STESSO LIVELLO DI PROTEZIONE FORNITO

DAL V. BCGDAL V. BCG

AEROSOL (200 CELLULE VIVE DI M. tuberculosis)

IMMUNOGENI PROTETTIVI USATI, O IMMUNOGENI PROTETTIVI USATI, O POTENZIALMENTE UTILIZZABILI, POTENZIALMENTE UTILIZZABILI,

IN V. SUBUNITA’IN V. SUBUNITA’

Ag DI SUPERFICIE DELL’EPATITE B gp 120 DI HIV EMOAGGLUTININA DEL VIRUS

DELL’INFLUENZA Ag G DELLA RABBIA GLICOPROTEINA D DI HSV

VACCINI PEPTIDICIVACCINI PEPTIDICI

COSTITUITI DA BREVI PEPTIDI SIMULANTI EPITOPI (DETERMINANTI ANTIGENICI)

CHE HANNO AZIONE IMMUNOGENA

LIMITAZIONI: PER ESSERE EFFICACE, UN EPITOPO DEVE ESSERE COSTITUITO

DA UN BREVE TRATTO DI AA CONTIGUI… NON SEMPRE E’ COSI’ IN NATURA

IL PEPTIDE DEVE ESSERE CAPACE DI ASSUMERE LA STESSA CONFORMAZIONE CHE HA L’EPITOPO DELLA PARTICELLA INTATTA

UN SOLO EPITOPO PUO’ NON ESSERE SUFFICIENTEMENTE IMMUNOGENO

N.B. NECESSITANO DI UNA PROTEINA CARRIER!

VACCINI ATTENUATI TRAMITE MANIPOLAZIONE GENETICA

(BATTERICI O VIRALI)

COSTITUITI DA: ORGANISMI NON PATOGENI MANIPOLATI IN MODO CHE

TRASPORTINO ED ESPRIMANO DETERMINANTI ANTIGENICI DERIVANTI DALL’AGENTE PATOGENO BERSAGLIO

CEPPI MANIPOLATI DI ORGANISMI PATOGENI I CUI GENI DELLA VIRULENZA SONO STATI MODIFICATI O DELETI

I DETERMINANTI ANTIGENICI CHE CONTANO SI PRESENTANO AL SISTEMA IMMUNITARIO CON UNA

CONFORMAZIONE ASSAI SIMILE A QUELLA CHE AVREBBE L’ANTIGENE DELL’ORGANISMO PATOGENO

COLERA: COLERA: Vibrio choleraVibrio cholera

V. ANTICOLERA ATTUALE: V. cholera INATTIVATO CON IL FENOLO

MODERATA PROTEZIONE CHE PERMANE DA 3 A 6 MESI

ENTEROTOSSINA COLERICA

1 SUBUNITA’ A

5 SUBUNITA’ B IDENTICHE

CREAZIONE DI ALTRI TIPI DI VACCINI

PEPTIDE A1

PEPTIDE A2

CREAZIONE DI UN CEPPO DI CREAZIONE DI UN CEPPO DI V. V. choleracholera CON DELEZIONE DEL PEPTIDE CON DELEZIONE DEL PEPTIDE

A1 : VACCINOA1 : VACCINO

SELEZIONE TETRACICLINA!!SELEZIONE TETRACICLINA!!

• 90% PROTEZIONE MA 90% PROTEZIONE MA EFFETTI COLLATERALIEFFETTI COLLATERALI

LE SPECIE DI LE SPECIE DI SalmonellaSalmonella

CEPPI DI Salmonella: FEBBRI INTESTINALI, MORTE INFANTILI, FEBBRE TIFOIDE, INTOSSICAZIONE ALIMENTARE

ATTENUAZIONE DI VARI CEPPI DI Salmonella

DOPPIA DELEZIONE

GENI aro GENI purBIOSINTESI DI METABOLISMO PURINICO

COMPOSTI AROMATICI

CEPPI ATTENUATI DI Salmonella: INFEZIONI DI BASSO LIVELLO. VIRULENZA DI 106

VOLTE O PIU’.

VACCINI ORALI EFFICACI

VETTORI VACCINICI

VIRUS VACCINO UTILIZZATO COME VETTORE VACCINICO

VIRUS VACCINO POXVIRUS, VAIOLO, DNA DOPPIO FILAMENTO,

REPLICAZIONE CITOPLASMATICA (INDIPENDENTE DALLA CELLULA OSPITE). INFETTA UOMO E MOLTI ALTRI VERTEBRATI E INVERTEBRATI.

BEN CARATTERIZZATO A LIVELLO MOLECOLARE

STABILE, SOLITAMENTE BENIGNO

VETTORI VACCINICI

VIRUS VACCINO

IDONEO A SERVIRE DA VETTORE VACCINICO

MA…. GENOMA MOLTO GRANDE, PRIVO DI SITI DI RESTRIZIONE

UNICI IMPOSSIBILE INSERIRE DIRETTAMENTE NEL GENOMA

VIRALE ALTRO DNA

RICOMBINAZIONE OMOLOGA IN VIVO!

INTEGRAZIONE NEL VIRUS VACCINICO DI UN ANTIGENE VIRALE CHE EVOCA

LA RISPOSTA IMMUNITARIA

1. COSTRUZIONE DI UN PLASMIDE RECANTE IL GENE DI UN ANTIGENE (HBcAg)

TRASFEZIONE DI FIBROBLASTIDI EMBRIONI DI POLLO (TK NEGATIVE) PRECEDENTEMENTE INFETTATE CON IL VIRUS VACCINO WT (TK POSITIVO)

2. INTEGRAZIONE DEL GENE DELL’ANTIGENE NEL DNA DEL VIRUS VACCINO

TK TK

TK

DOPPIO DOPPIO CROSSING-OVERCROSSING-OVER

HBcAg

Cellule ospiti: TK-Cellule ospiti: TK- Virus ricombinato: TK-Virus ricombinato: TK-

I SELEZIONEI SELEZIONE : : Bromodeossiuridina Bromodeossiuridina (MORTE (MORTE DI CELLULE TK+)DI CELLULE TK+)

II SELEZIONEII SELEZIONE:: Sonda di ibridazione a DNA Sonda di ibridazione a DNA per l’antigeneper l’antigene

Construction of a Construction of a recombinant recombinant vaccinia virus vaccinia virus expressing the expressing the influenza virus influenza virus

HA geneHA gene

ALCUNI ANTIGENI INSERITI ALCUNI ANTIGENI INSERITI NEL GENOMA DEL VIRUS NEL GENOMA DEL VIRUS

VACCINOVACCINO PROTEINA G DEL VIRUS DELLA RABBIA Ag DI SUPERFICIE DELL’EPATITE B PROTEINE NP E HA DEL VIRUS

INFLUENZALE PROTEINE N E G DEL VIRUS DELLA

STOMATITE GLICOPROTEINE DEL VIRUS

DELL’HERPES SIMPLEX

ESEMPI DI VIRUS VACCINI ESEMPI DI VIRUS VACCINI RICOMBINANTI EFFICAIRICOMBINANTI EFFICAI

VIRUS VACCINO RICOMBINANTE-GENE VIRUS VACCINO RICOMBINANTE-GENE DELLA PROTEINA G DI TIPO 1 DI HSV:DELLA PROTEINA G DI TIPO 1 DI HSV: PREVENZIONE DELL’INFEZIONE PREVENZIONE DELL’INFEZIONE ERPETICA NEI TOPIERPETICA NEI TOPI

VIRUS VACCINO RICOMBINANTE-Ag DI VIRUS VACCINO RICOMBINANTE-Ag DI SUPERFICIE DEL VIRUS DELLA RABBIA:SUPERFICIE DEL VIRUS DELLA RABBIA: NEUTRALIZZAZIONE DEGLI ANTICORPI NEUTRALIZZAZIONE DEGLI ANTICORPI NELLE VOLPI (IN EUROPA I PRINCIPALI NELLE VOLPI (IN EUROPA I PRINCIPALI PORTATORI DELLA RABBIA)PORTATORI DELLA RABBIA)

VACCINI VIRALI RICOMBINANTI VIVI

VANTAGGI- ESPRESSIONE DEGLI ANTIGENI AUTENTICI IN

MODO CHE ASSOMOGLIA MOLTO DA VICINO ALL’INFEZIONE NATURALE

- ATTIVAZIONE DI CELLULE B (RISPOSTA UMORALE) E DI CELLULE T (RISPOSTA CELLULO-MEDIATA)

- RIDUZIONE ULTERIORE DELLA VIRULENZA DOVUTA ALL’INSERIMENTO DI GENI DEGLI ANTIGENI IN UNO O PIU’ SITI DEL GENOMA VIRALE

VACCINI VIRALI RICOMBINANTI VIVI

SVANTAGGI

IL LORO IMPIEGO IN INDIVIDUI IMMUNODEPRESSI (ES. AIDS…) PUO’ CAUSARE GRAVE INFEZIONE VIRALE.

BATTERI COME SISTEMI DI INSERIMENTO DEGLI

ANTIGENISTRATEGIA: COLLOCAZIONE DI UN Ag NEUTRALIZZANTE DI

UN BATTERIO PATOGENO SULLA SUPERFICIE DI UN BATTERIO NON PATOGENO VIVO.

ESEMPIO: ESPRESSIONE SUI FLAGELLI DI UN

ORGANISMO NON PATOGENO DI UNO SPECIFICO EPITOPO DERIVANTE DA UN BATTERIO PATOGENO PER REALIZZARE UNA IMMUNOGENICITA’ PROTETTIVA.

COSTRUZIONE DI UN VACCINO ANTI-COLERA

1. INSERIMENTO DI UN OLIGONUCLEOTIDE SINTETICO (EPITOPO DEALLA SUBUNITA’ B DELLA TOSSINA COLERICA) IN UNA PORZIONE DEL GENE DELLA FLAGELLINA DI Salmonella.

2. INTRODUZIONE DEL COSTRUTTO IN UN CEPPO DI Salmonella FLAGELLINA-NEGATIVO.

COSTRUZIONE DI UN COSTRUZIONE DI UN VACCINO ANTI-COLERAVACCINO ANTI-COLERA

IMMUNIZZAZIONE DI TOPI (MEDIANTE INIEZIONE INTRAPERITONEALE) CON

BATTERI RECANTI “FLAGELLI INGEGNERIZZATI” E INATTIVATI CON

FORMALINA

PRODUZIONE DI ELEVATI LIVELLI DI ANTICORPI DIRETTI CONTRO LA

MOLECOLA DELLA TOSSINA COLERICA INTATTA!

VACCINI GENETICI

IMMUNIZZAZIONE GENETICA

TRASFERIMENTO DI UN GENE CODIFICANTE UN ANTIGENE ALL’INTERNO DI UN ORGANISMO OSPITE CHE NON ESPRIME TALE ANTIGENE IN CIRCOSTANZE NORMALI.

ANTIGENE: DNA O RNA VACCINI AD RNA: POCHI ESEMPI (BREVE

ESPRESSIONE) VACCINI A DNA: SEMPRE PIU’ NUMEROSI

VACCINI A DNA

COSTITUITI GENERALMENTE DA VETTORI PLASMIDICI (DERIVATI DA BATTERI) CHE CONTENGONO GENI

ETEROLOGHI (TRANSGENI) INSERITI SOTTO IL CONTROLLO DI UN PROMOTORE EUCARIOTICO,

DETERMINANDO ESPRESSIONE PROTEICA IN CELLULE DI MAMMIFERO

STIMOLANO EFFICACEMENTE UNA RISPOSTA IMMUNE:

UMORALE CELLULARE

IMMUNITA’ UMORALE:IMMUNITA’ UMORALE:PRODUZIONE DI ANTICORPI ANTIGENO-SPECIFICI DA

PARTE DI CELLULE B ATTIVATE NEUTRALIZZAZIONE DELL’AGENTE PATOGENO (Sufficiente da sola per la profilassi di alcune malattie, Es. EPATITE B)

IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA (CMI):IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA (CMI):INDUZIONE DI LINFOCITI T CITOTOSSICI (CTLs)

DISTRUZIONE DI CELLULE INFETTE (COINVOLGIMENTO DI MOLECOLE CODIFICATE DAI GENI DEL COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA’). (MHC) (Essenziale per la protezione contro malattie causate da patogeni intracellulari, Es. TUBERCOLOSI)

ori

Plasmid constructPlasmid constructexpression gene

cassette

resistance gene

poly (a)-signals:- BGH-SV40

promoters:- CMVIE or CMV intron A- RSV LTR- SV40 early

E. coli origin of replication- ColE1- no mammalian origin

bacterial resistance gene:- kanamycin - none

DNA Vaccines

Inoculation technology

needle inoculation i.m. i.d.

gene gun

air food uptake

Types of Injection for DNA Vaccines

Gene Gun (bombardment)~ Propels DNA-coated gold particles directly into the cytoplasm of cells in target tissue by means of electrical discharge or helium pulse

Injection by a needle~ “plasmid DNA immunization has been accomplished using epidermal, mucosal, intramuscular, and intravenous routes of administration”

“Striated muscle initially was considered to be the only tissue capable of efficiently taking up and expressing free plasmid DNA in an aqueous solution.”

Intra-muscular DNA vaccine

muscle

La preparazione di un Vaccino a DNA solitamente si attua isolando uno o più geni dell’agente patogeno e integrandoli in plasmidi (a), piccoli anelli circolari di DNA.I plasmidi vengono rilasciati in piccoli gruppi di cellule, spesso per iniezione nelle cellule muscolari (b) o per trasferimentoattraverso la pelle utilizzando una pistola genica (gene gun) (c). I geni codificano per gli Ag del patogeno. Gli Ag prodotti sono in grado di stimolare la risposta immune nell’ospite.

a

b

c

patogeno materialegenetico

gene per l’antigene

plasmidemodificato

pelle

muscolo

Mechanism of immunisation

myocytetransfection

transcriptionintegration ? translation

processing

secretion

processing/presentation

MHC II

APC

B-cell stimulationand selection

T-cell selection and stimulation

Th I

Th II

selection ofT-helper cells

cytotoxicT-cell responseCD8+ T CELL

antibody-dependentimmune responses

• neutralisation • ADCC • C-lysis

cross priming

plasmid

MHC I

CD4+ T Cell

Features of DNA vaccination Antigenicity of expressed viral antigens similar to that

observed during natural infection

Efficient elicitation of CD8+ CTLs (MHC I presentation)

Expression of multiple combined antigens possible by mixing multiple expression plasmids

Simplicity of vector construction

Simplicity of vector production and transport

Possible applications of DNA vaccines

Virus HIV/SIV, Influenza, HBV, HCV, HSV, HCMV, Dengue, Rota, Rabies,

LCMV... Bacteria

Borreliosis, Tetanus, Tuberculosis, M. pulmonis, Salmonella typhi, ... Parasite

Malaria, Leishmania major, Schistosoma jap., Toxoplasma gondii, ...

Tumor B-cell lymphoma/ Non-Hodgkin lymphoma, colorectal carcinoma, breast

cancer (CEA+), Melanoma, ...

Allergy, auto-immune disease, immune tolerance Hausstaubmilben, TCR-autoimmune encephalomyelitis, rheumatoid

arthritis, Systemic Lupus Erythematodes (TGF-ß/IL-2), Plasmodium yoelii-tolerance

100g plasmid DNAi.m.

10 mg plasmid DNAi.m./i.d./gene gun

10-50 mg plasmid DNAi.m./i.d./gene gun

Amount of DNA Amount of DNA used as a vaccineused as a vaccine(complete dosage)(complete dosage)

Clinical trials

HIV-1 (env,rev,gag,pol, nef) HSV-1 (gD,gB,ICP-27) Malaria parasite (CSP) Influenza A virus (HA,M1,NP) HBV (HBsAG)

tumour vaccines (tumour-specific antigens)

HIV-1(env, tat, nef, multi-epitope)

preventive

therapeutic

Pro and cons of DNA vaccines

Synthesis in vivo of a selected antigen or designer gene product

No risk of infection Use of immunogen from yet

uncultured pathogens Induction of cellular and

humoral immune responses Cheap and easy production Easy transport and storage

• Risk of cancer (insertional mutagenesis) ?

• Risk of induction of tolerance ?

• Risk of induction of auto-immune disease ?

• Prophylactic use e.g. in children affords particular safety features

Special safety considerations

tumor induction due to chromosomal integration

tolerance due to long-term presentation of antigen

adverse reactions and immunopathology due to co-administration of cytokine and/or immun stimulatory

genes auto-immune reactions

correlated with the induction of anti-DNA antibodies biologic activity (apart from immunogenicity)

of the expressed antigen

Chromosomal integration:Can it take place in vivo?

No, following i.m. naked DNA inoculation up to 8 months after inoculation, no integration has been

detected in muscle tissue

Yes, following other routes and methods of administration publication describing evidence of integration 17 days after

inoculation in spleen cells

Chromosomal integration:The variables

formulation naked, lipids, etc.

type of sequences homology to chromosomal DNA sequences

route of administration i.m., i.d., s.c., etc.

type of tissue rate of proliferation?

quality of the DNA amount of linear or nicked plasmid ? Degree of

supercoiledness?

Chromosomal integration:Where should we look?

in every tissue extensive biodistribution of naked DNA observed in mice

in gonads major concern of germ line gene transfer

in various tissue depending on formulation formulation may target DNA to different cell types or tissues

Chromosomal integration:What sensitivity of detection should we aim for?

PCR most sensitive

sensitivity is limited due to rapid biodistribution of DNA

at which time point after inoculation 5 days or 15 days integration assay, if DNA is detected in a given tissue by PCR

Chromosomal integration:Should we look for it in all cases?

yes because consequences could be detrimental preventive vaccines will be used in healthy adults or children

not in all cases after i.m. inoculation FDA: if expression construct is changed (insert), but plasmid

backbone identical: not necessary for early trials EU: ?

yes, in all cases if route of administration is changed if method of delivery is changed

Production process, risks, consequences

E.coli fermentation

extraction and primary recovery

chromatography

product

antibiotics

endotoxin

bovine ribonuclease

antibiotic resistance genes

anaphylaxis

toxachia

infection with nvCJD or viral zoonoses

gene transfer to pathogenic bacteria with subsequent reduction in the efficacy of antibiotic therapy

pre-clinical safety evaluation: animal models

translation of authentic gene product absence of replication competent viruses

(vector-derived) absence of any other viruses etc. titre, dosage absence of DNA or protein contaminants,

pyrogens etc.

Quality and safety evaluationsQuality and safety evaluations

organ and tissue distribution of transgene,persistence, expression over time

exclusion of germ line transmission and environmental risk

physiological consequences of gene expression

include functional end point in vivo

Toxicity studiesToxicity studies

absence of germ line transfer

spread into other tissues

antibodies against vector, antigen orgenetically modified cell

Biological MonitoringBiological Monitoring