“Alla ricerca del ciclo perduto”: la citofluorometria nell’analisi del
ciclo cellulare
Obiettivo dell'esperienza
Saccharomyces cerevisiaeCiclo Vitale Ciclo di Divisione Cellulare
Identificare:*la ploidia della popolazione*la fase del ciclo cellulare in cui si trovano le cellule di una coltura di lievito
Protocollo
●Ogni partecipante sceglie un campione da analizzare, contenente una coltura di lievito (una provetta a testa)
1) Trasferire 1 ml di coltura in una provetta eppendorf (GUANTI!)
2) Centrifugare la provetta 2 minuti, eliminare il surnatante
3) Aggiungere 1 ml di etanolo 70% e mettere in ghiaccio per fissare
...15 minuti...
FACSFluorescence Activated Cell Sorter
A cosa serve? Analisi di parametri biologici nelle singole cellule di popolazioni cellulari
Contenuto di DNA (→ Studio della Ploidia e del Ciclo Cellulare) Presenza di antigeni superficiali (→ Esame emocromocitometrico, )
Controllo di qualità nelle produzioni alimentari (→ Individuazione di microorganismi indesiderati durante le fermentazioni, Conta delle cellule somatiche nel latte)
Per cosa lo useremo?Quantificare il contenuto di DNA nelle singole cellule per identificare la ploidia e la fase delciclo cellulare in cui si trovano
VantaggiMisurazione contemporanea di diversi parametri (Analisi Multiparametrica)
FACSCome funziona?
UV Det.Fluoroforo
Parametri Misurati:*Fluorescenza*Forward Scattering*Side Scattering
FACS
Scanner Ago Monitor Dati
FACS Flow
Fissaggio
Preparazione dei campioni
RNAsi
Uccidere le cellule e bloccare la progressione del ciclo cellulare
Degradare completamente l'RNA che interferisce con
le lettureProteinasi K
Degradare completamente le proteine interferiscono
con la colorazione del DNA
Protocollo
1) Centrifugare I campioni fissati 3 minuti, eliminare il surnatante
2) Aggiungere al pellet 500 μl di RNasi
3) Vortexare per risospendere perfettamente il pellet
4) Incubare 60 minuti a 37°C per digerire completamente l'RNA
...60 minuti...
Il contenuto del DNA nelle diverse fasi del ciclo cellulare
G1
S
G2
M
1C
1<C<2
2C
Ciclo cellulare aploide
G1
S
G2
M
2C
2<C<4
4C
Ciclo cellulare diploide
Analisi dei risultati
Intensità della fluorescenza=
Contenuto di DNA
Numero di Cellule
1C 2C 3C 4C1C = contenuto di DNA di un genoma aploide
Il profilo FACS nel ciclo cellulare
1C 2C 3C 4C 1C 2C 3C 4C 1C 2C 3C 4C
1C 2C 3C 4C
G1 S G2
In una coltura sincronizzata diploide
In una coltura asincrona invece...
Il profilo FACS in un ciclo cellulare
1C 2C 3C 4C 1C 2C 3C 4C 1C 2C 3C 4C
In una coltura sincronizzata diploide
In una coltura asincrona invece...
G1 S G2
1C 2C 3C 4C
Un esempio di coltura sincrona
1C 2C
Tempo
Un metodo alternativo
G1
S
G2
M
1C
1<C<2
2C
Osservazione morfologica
Protocollo
1) Centrifugare i campioni trattati con RNasi per 3 min
2) Eliminare il surnatantem e aggiungere al pellet 500 μl di Proteinasi K
3) Vortexare per risospendere perfettamente il pellet
4) Incubare 60 minuti a 50°C per digerire le proteine
...60 minuti...
Forward ScatteringIl forward scattering cresce con l'aumentare delle dimensioni della cellula analizzata
G1 G2
For
war
d S
catt
erin
g
Side ScatteringIl side scattering cresce con l'aumentare della complessità della cellula analizzata
G1 G2
Sid
e S
catte
ring
Forward vs Side Scattering
For
war
d S
catt
erin
g
Side Scattering
Protocollo – Giorno 2
1) Aggiungere 100 μl di cellule al colorante del DNA
2) Agitare brevemente
Gruppo 1: 1,2,3,4,5,6,7Gruppo 2: 8,9,10,11,12,13,14Gruppo 3: 15,16,17,18,19,20,21
3) Sonicare
4) Leggere al citofluorimetro
Acquisizione dei dati
Istogrammi FL1/2
Dot Plot FL1/2 vs FSc
Istogrammi FL2/3
Dot Plot SSc vs FSc