Dipartimento di FisicaUniversità degli Studi di Milano-Bicocca
BIOFISICA
Laura SironiMargaux Bouzin
Mykola Borzenkov
Biofisica @UNIMIB:Giuseppe Chirico, Maddalena Collini,
Laura D’Alfonso, Laura SironiMykola Borzenkov, Margaux BouzinAmirbahador Zeynali, Mario Marini
SISTEMI BIOLOGICI COMPLESSI
proteine cellule tessuti
organellivirus
batteri
10 nm 100 nm 1 mm 10 mm 100 mm 1 mm
La figura del biofisico si propone di studiare sistemi cellulari, tessuti e piccoli organismi con metodologie fisiche sia a livello sperimentale sia
a livello di modellizzazione.
MICROSCOPIA VISIBILE/INFRAROSSA
sorgente laser
sistema ottico + scansione
rivelatore (PMT, termocamera..)
• Rivelazione del segnale in funzione di spazio e tempo: I(x,y,t)
• Rivelazione del segnale in funzione di molteplici parametri: I(x,y,q,l)
• Risoluzione spaziale ∼ 1 mm – 50 nm
Sistema MultispotOttica adattiva per correzione aberrazioniSistema per imaging termico a super-risoluzione
MICROSCOPIA VISIBILE/INFRAROSSA
sorgente laser
sistema ottico + scansione
rivelatore (PMT, termocamera..)
1 mm
1 mm
Tra
smis
sio
ne
Tem
per
atu
raF
luo
resc
enza
2°C
0.5°C
1 mm
TUMORIProcessi di fibrosi (fegato, reni, polmoni)
Patologie della corneaPatologie della pelle
Cicatrici/Rimarginazione feritePatologie muscolari
L’organizzazione del collagene è differente in tessuti sani o affetti da patologia
La struttura del collagene cambia durante lo sviluppo di una patologia
Individuazione patologia
Stadio di sviluppo della malattia
MICRO-ARCHITETTURA COLLAGENE
SVILUPPO TUMORE
Organizzazione collagene nella matrice extracellulare tumoraleMetabolismo
SVILUPPO TUMORI
Generazione di Seconda Armonica (SHG)
qLqF
z
x
k
kjijk
j
i EEP )()(),()2()2()2(
lSHG=linc/2
Processo ottico non lineare in cui due fotoni di frequenza vengono trasformati in un singolo fotone di frequenza doppia, 2 Interazione con molecole non centrosimmetriche (tripla elica collagene)Sensibile alla simmetria della molecola e alla polarizzazione
)2()2(/ zxxzzz
COLLAGENE
cos
1
0
1
0
N
n
n
L
N
n
n
L
n
L
I
KI
g
q
qq q
q
1
0
1
0
sin
N
n
n
L
N
n
n
L
n
L
I
KI
s
q
qq q
q
cos
1
0
12/
0
N
n
F
n
L
N
n
F
n
LF
n
L
I
KI
g
qqqq
1
0
12/
0
sin
N
n
F
n
L
N
n
F
n
LF
n
L
I
KI
s
qqqq
12 FNK qq
12 qq NK
N=/qq angular resolution
0 qL <
qF qL
𝑔𝜃
𝑠𝜃
𝜃𝐶
𝑔𝛾
𝑠𝛾
𝛾𝐶 ∆𝛾𝑖𝑗
qC = 1o and C = 0.2
qC = 30o and C = 1
Cluster size43 20
Cluster size115 40
qC = 1o and C = 0.2
cij
j
ciji qq qc c
Cluster nello spazio dei fasoriDipendente da proprietà microscopiche
Radaelli F. et al., Sci Rep. 2017 Dec 12;7(1):17468.
ETEROGENEITA’ ECM
(1) Caratterizzazione morfologica (2) Misura di parametri funzionali in sistemi biologici(3) Studio di processi dinamici
(fenomeni di trasporto)
TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI
(1) Caratterizzazione morfologica (2) Misura di parametri funzionali in sistemi biologici(3) Studio di processi dinamici
(fenomeni di trasporto)
Cellule endoteliali
Zebrafish
TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI
Globuli rossi
10 mm
Sistema animale modello con impieghi in genetica, medicina rigenerativa e
ricerca cardio-vascolare
Misure emodinamiche in vivo (in regime di flusso
pulsatile), su regioni estese, con risoluzione
spaziale minima ~ 10 mm
Inverso, D. et al. Cell, 161(3), 2015
Micro-circolazione epatica
Qdots
Cellule T
Cellule T
Epatociti
TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI
Misure emodinamiche in vivo con risoluzione spaziale minima ~ 10 mmin sistemi circolatori dalla geometria
complessa + single cell tracking
Bouzin, M. et al. Biophys. J., 109:2246-2258, 2015
Terapia fototermica & drug delivery
10 mm
TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI
Nanoparticelle d’oro in cellule HeLa
Dall’emodinamica ai processi di trasporto intra-cellulare:moto Browniano, trasporto attivo, diffusione anomala
10 mm
SPETTROSCOPIA DI CORRELAZIONE
tempo t
F(t
)
t
Fluttuazioni di intensità
Diffusione Browniana
Moto direzionale
Reazioni chimiche
Fotodinamica
Tempo di ritardo t
G(t
)
Funzione di auto-correlazione
𝛿𝐹 𝑡 = 𝐹 𝑡 − 𝐹 𝑡 𝑡
𝐺 𝜏 =𝛿𝐹 𝑡 𝛿𝐹(𝑡 + 𝜏) 𝑡
𝐹(𝑡) 𝑡2
xy
z
SPETTROSCOPIA DI CORRELAZIONE
tem
po
1 2
Flusso, v
R
F2(t)
t
F1(t)
t t1
t1 + t
t1
t1 + t
Flusso, v
1 2
Globuli rossi
𝜏𝑉,𝑅 =𝑅
𝑣
R // v
SPETTROSCOPIA DI CORRELAZIONE
tem
po
1 2
Flusso, v
R
F2(t)
t
F1(t)
t t1
t1 + t
tV,R
t1
t1 + t
Flusso, v
1E-3 0.01 0.1
0.000
0.004
0.008
𝜏𝑉,𝑅 =𝑅
𝑣𝐺12 𝜏 =
𝛿𝐹1(𝑡)𝛿𝐹2(𝑡 + 𝜏) 𝑡𝐹1(𝑡) 𝑡 𝐹2(𝑡) 𝑡
∝1
1 +4𝐷𝜏𝜔02
1
1 +4𝐷𝜏𝜔0𝑧2
𝑒𝑥𝑝 −1
𝜔02
𝑅 − 𝑣𝜏2
1 +4𝐷𝜏𝜔02
G12
t
Globuli rossi
R // v
Globuli rossi
SPETTROSCOPIA DI CORRELAZIONE
Misura della velocità del flusso arterioso+ parametri emodinamici critici (frequenza
battito, flow rate, shear stress..):
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00
750
1500
2250
3000
3750
v (
mm
/s)
Time (s)t (s)
sistole
diastole
Sviluppo e applicazione di metodi correlativi per la misura di campi di velocità 3D in geometrie anche complesse
SINGLE PARTICLE TRACKINGxyt-stack
t1
tN
Identificazione picchi + fit Gaussiani
Ricostruzione traiettoria
?
?MSD(t):
spostamentoquadratico medio
𝑥 𝑡𝑗=1…𝑁 ≡ 𝑥 𝑡𝑗 , 𝑦 𝑡𝑗
𝑥 𝑡𝑗𝑥 𝑡𝑗−1
∆𝑥 𝑡𝑗 = 𝑥 𝑡𝑗 − 𝑥 𝑡𝑗−1
𝑝 ∆𝑥 𝑡𝑗 , ∆𝑡 = 𝑡𝑗 − 𝑡𝑗−1
𝑝 𝑥, 𝑡|𝑥′, 0
𝑥 − 𝑥′2=ඵ
−∞
+∞
𝑥 − 𝑥′2𝑝 𝑥′ 𝑝 𝑥, 𝑡|𝑥′, 0 𝑑𝑥𝑑𝑥’
SINGLE PARTICLE TRACKINGxyt-stack
t1
tN
Identificazione picchi + fit Gaussiani
Ricostruzione traiettoria
?
?MSD(t):
spostamentoquadratico medio
𝑥 𝑡𝑗=1…𝑁 ≡ 𝑥 𝑡𝑗 , 𝑦 𝑡𝑗
𝑥 𝑡𝑗𝑥 𝑡𝑗−1
∆𝑥 𝑡𝑗 = 𝑥 𝑡𝑗 − 𝑥 𝑡𝑗−1
𝑝 ∆𝑥 𝑡𝑗 , ∆𝑡 = 𝑡𝑗 − 𝑡𝑗−1
𝑝 𝑥, 𝑡|𝑥′, 0
𝑥 − 𝑥′2=ඵ
−∞
+∞
𝑥 − 𝑥′2𝑝 𝑥′ 𝑝 𝑥, 𝑡|𝑥′, 0 𝑑𝑥𝑑𝑥’
0 1 2 3 4 5
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
t (s)
MS
D (m
m2 )
D=(0.024±0.001) mm2/s
𝑝 𝑥, 𝑡 =1
4𝜋𝐷𝑡𝑒𝑥𝑝 −
𝑥2
4𝐷𝑡
0 1 2 3 4 5
0
15
30
45
MS
D (m
m2 )
t (s)D=1 mm2/s, v=1 mm/s
moto Browniano, diffusione + drift& diffusione anomala
a=1.3
a=0.7
𝑀𝑆𝐷 𝑡 = 4𝐷𝑡
𝑀𝑆𝐷 𝑡 = 4𝐷𝑡 + 𝑣2𝑡2
𝑀𝑆𝐷 𝑡 = 4𝐷𝛼𝑡𝛼
SINGLE PARTICLE TRACKING
Nanoparticelle d’oro in cellule HeLa
10 mm
1. D=(3.9±0.1)10-5 mm2/sMoto Browniano ✓
2. D=(8.9±0.3)10-5 mm2/sv=(2.3±0.1)10-3 mm/sDiff. + drift ✓
3. Moto Browniano ✗Diff. + drift ✗Trasporto attivo intermittente ✓
Modellizzazione e analisi delle traiettorie
Dinamica intra-cellulare:
0.2 mm
0.2 mm
0.2 mm
0.2 mm
0.2 mm
0.4 mm
1
2
3
Bouzin, M. et al. Biophys. J.,
109:2246-2258, 2015
TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI
modellizzazione fenomeni di trasporto su
scala sub-cellulare (trasporto intermittente, diffusione anomala…)
100 500
sviluppo/programmazione di algoritmi e metodi per l’analisiquantitativa di immagini in risposta a problemi di interessebiologico, biomedico, nanotecnologico
sviluppo di metodi correlativi per studidi emodinamica in-vivo su sistemicircolatori dalla geometria complessa
OUTLINE
Nanoparticles and photo-thermal effect
Research background
Novel application possibilities:
Remotely activated antibacterial surfaces Scaffolds for tissue engineering
Nanoparticles and Photo-Thermal Effect
Nanoparticles and Photo-Thermal Effect
Nanoparticles can convert absorbed light into heat
NIR LIGHT INCREASE OF TEMPERATURE APPLICATION
Nanoparticles
solution Cancer cellsablation
Research background
TRITON X-100 assisted synthesis of GNSChem.Commun. 2013, 49, 6225
GNS feature two intense LSPRs in the 600-900 and 1100-1600 nm ranges, and are able to convert laser radiation into heat, offering two photo-thermally active channels
Small, 2014, 4, 631
CuS nanoparticles and thin films display interesting electrical and optical properties. In comparison with other plasmonic nanoparticles, the absorption wavelength of CuS nanoparticles is less affected by synthetic conditions, particle shape and surrounding environment.
PB nanoparticles display an intense absorption band with λmax ≈ 650-900 nm and the irradiation of this band results in thermal relaxation. PB nanoparticles are biocompatible and non-toxic.
Supramol. Chem., 2017, 19, 1
Research background
Langmuir, 2015, 31, 8081
Increase of temperature of GNS printed patterns
during NIR laser irradiation
Remotely activated antibacterial surfaces
No NIR After NIR
Scaffolds for tissue engineering
ΔT ≈3-4.5°C
F11 neuronal cells
growth after NIR
irradiation
CONCLUSIONI
Le nanoparticelle fototermiche hanno potenziali applicazioni nell’ambito della nanomedicina e delle biotecnologie, consentendo di eliminare batteri
e biofilms ma anche di stimolare la crescita delle cellule.
RESEARCH NETWORK
Biophysics Group
Dipartimento di FisicaUniversità degli Studi di Milano-Bicocca
ESPERIMENTAZIONIDI BIOFISICA
ESPERIMENTAZIONI DI BIOFISICA
DOCENTE RESPONSABILE: Dott.ssa Laura Sironi
ESPERIMENTAZIONI DI BIOFISICA
ORGANIZZAZIONE DEL LABORATORIOesperimenti ruotati sui diversi gruppi
ESAMERelazioni relative agli esperimenti svolti + orale
Corso propedeutico consigliato: ELEMENTI DI BIOFOTONICA
(Prof. G.Chirico/Prof.ssa M.Collini) I semestre, III anno
ORGANIZZAZIONE LABORATORIO
ARGOMENTISPETTROSCOPIA DI BIOMOLECOLE
PROPRIETA’ DI NANOPARTICELLE D’OROMICROSCOPIA OTTICA
Spettroscopia di fluorescenza:
Proprietà fluorescenza
Interazione proteina-farmaco
Protein unfolding
ESPERIMENTI
ESPERIMENTI
Unfolding proteine
Spettroscopia infrarossa
Dicroismo circolare
Struttura=
Funzione fisiologica
Folding non corretto
Malattie (Alzheimer, Huntington, Parkinson,
tumori)
Fluorescenza
Determinazione della dimensione diNANOPARTICELLE mediante light scattering
0 100 200 300 400
20
25
30
35
40
45
50
T (
°C)
Time (s)
CTRL
NC
NC20
NC12
Termocamera (terapia fototermica)
ESPERIMENTI
Imaging di cellule e tessuti mediante microscopia confocale a fluorescenza
Analisi immagini/esperimenti di ottica
ESPERIMENTI