Caratterizzazione dei fattori di virulenza di Listeria monocytogenes e delle tossine botuliniche
Caratterizzazione dei fattori di virulenza di Caratterizzazione dei fattori di virulenza di Listeria monocytogenesListeria monocytogenes e delle tossine botulinichee delle tossine botuliniche
Giovanna Giovanna [email protected]@iss.it
Workshop: Workshop: Workshop: FocusFocusFocus su Sicurezza d’Uso su Sicurezza d’Uso su Sicurezza d’Uso e Nutrizionale degli Alimentie Nutrizionale degli Alimentie Nutrizionale degli Alimenti
Roma 21Roma 21Roma 21---22 novembre 2005, ISS22 novembre 2005, ISS22 novembre 2005, ISS
Listeria monocytogenesListeria monocytogenesAsporigenoAsporigeno
MicroaerofiloMicroaerofiloProduce fattori di virulenzaProduce fattori di virulenza
ClostridiumClostridium botulinumbotulinumSporigenoSporigeno
Anaerobio obbligatoAnaerobio obbligatoNeurotossigenoNeurotossigeno
Patogenesi della listeriosi umanaPatogenesi della listeriosi umanaPatogenesi della listeriosi umana
Meccanismo infettivo di L. monocytogenesMeccanismo infettivo di Meccanismo infettivo di L.L. monocytogenesmonocytogenes
Principali fattori di virulenza che governano il meccanismo infettivo di L. monocytogenes
Principali fattori di virulenza che governano il Principali fattori di virulenza che governano il meccanismo infettivo dimeccanismo infettivo di L. monocytogenesL. monocytogenes
Regolatore positivo trascrizioneRegolatore positivo trascrizionePrfAPrfAFattore accessorio lisi vacuolo IIFattore accessorio lisi vacuolo IIPCPC--PLCPLCAttivazione PCAttivazione PC--PLCPLCMplMplMovimento Movimento intraintra-- ed intered inter--cellularecellulareActAActAFattore accessorio lisi vacuolo IFattore accessorio lisi vacuolo IPIPI--PLCPLCCitolisinaCitolisina; lisi vacuolo; lisi vacuoloHlyHlyAdesione Adesione epatocitiepatociti ed altre celluleed altre celluleInlBInlB
Adesione epitelio GI e placentareAdesione epitelio GI e placentareInlAInlA
RuoloRuoloFattoreFattore
GENI VIRULENZAGENI VIRULENZAGENI VIRULENZA
GastroentericaGastroenterica
Tratto GastrointestinaleTratto Gastrointestinale
Persone che non presentano Persone che non presentano fattori di predisposizionefattori di predisposizione
Dose infettiva: altaDose infettiva: alta
Tempo medio d’incubazioneTempo medio d’incubazione1212--24 ore24 ore
InvasivaInvasiva
SNC e placentaSNC e placenta
Popolazione ad alto rischio Popolazione ad alto rischio ((immunoimmuno--compromessicompromessi, anziani, , anziani, donne in gravidanza, neonati)donne in gravidanza, neonati)
Dose infettiva: bassaDose infettiva: bassa
Tempo medio d’incubazione Tempo medio d’incubazione 22--3 settimane3 settimane
Listeriosi invasiva e gastroentericaListeriosi invasiva e gastroentericaListeriosi invasiva e gastroenterica
Episodi di gastroenterite associati aL. monocytogenes
EpisodiEpisodi di di gastroenteritegastroenterite associatiassociati aaL. monocytogenesL. monocytogenes
Luogo Anno Numero di casi Veicolo Rif.
Giappone 2001 38 Formaggio Kawamoto et al., 2004
Svezia 2001 48 Latticini Carrique-Mas et al., 2003
USA 2001 16 Sandwich tacchino Frye et al., 2002
Australia 2000 31 Carni ready-to-eat Sim et al., 2002
Finlandia 1999 5 Trota Miettinen, 1999
Italia 1997 1566 Insalata di mais Aureli et al., 2000
Canada 1996 1 Polpa di granchio Farber et al., 2000
Danimarca 1996 3 Sconosciuto Heitmann et al., 1997
USA 1994 45 Latte al cioccolato Dalton et al., 1997
Italia 1993 18 Insalata di riso Salamina et al., 1996
USA 1989 10 Gamberi Riedo et al., 1994
Ceppi di L. monocytogenes paragonati per caratteristiche di virulenza
Ceppi di Ceppi di L. monocytogenesL. monocytogenes paragonati paragonati per caratteristiche di virulenzaper caratteristiche di virulenza
6 INVASIVI1 da un outbreak
5 da casi sporadici
C1340 (Canada)
G6006 (USA)
L 254 (Italia)
3 GASTROENTERICI
9 di sierotipo 1/2b
16 INVASIVICeppo ScottA
15 da casi sporadici
F60594 (Danimarca)
L 90 (Italia)
2 GASTROENTERICI
18 di sierotipo 4b
27 CLINICI
L 285, n.s.
ATCC 43248, 1/2aavirulento
ATCC 15313, n.s., avirulento
3 NON-UMANI
30 CEPPI TOTALI
Valutazione della virulenza dei ceppi di L. monocytogenes
Valutazione della virulenza dei Valutazione della virulenza dei ceppi di ceppi di L. monocytogenesL. monocytogenes
inoculo (i.p.)inoculo (i.p.)inoculo (i.p.)intraintraintra---peritonealeperitonealeperitoneale
inoculo (i.g.)inoculo (i.g.)inoculo (i.g.)intraintraintra---gastricogastricogastrico
PCRPCRPCR---RFLP di 8 principali RFLP di 8 principali RFLP di 8 principali geni associati alla virulenza geni associati alla virulenza geni associati alla virulenza (VAG)(VAG)(VAG)
tipizzazionetipizzazionetipizzazione PFGE PFGE PFGE
Test di virulenza Test di virulenza in vivoin vivo su topinisu topini
Approccio molecolareApproccio molecolare
Prodotti PCR di ActA ristretti con DraIProdotti PCR diProdotti PCR di ActAActA ristretti con ristretti con DraIDraI
700 bp400 bp
M
Scot
tAL4
39L6
6
L67
L335
L337
L339
L340
L344
L349
L448
L599
L645
L864
L958
L959
L90
F605
94
M
Ceppi 4bCeppi 4bCeppi 4bCeppi 4b
800 bp
300 bp
Ceppi 1/2bCeppi 1/2b
500 bp
L281
8
L310
L312
L330
L364
L941
L254
G60
06
C13
40
L285
ATC
C43
248
M
Ceppi 1/2bCeppi 1/2b
Ceppi avirulentiCeppi Ceppi Ceppi avirulentiavirulentiavirulenti
Profili PFGEProfili PFGE concon ApaIApaIM Sc
ottA
L439
L66
L67
L335
L337
L339
L340
L344
L349
L448
L599
L645
L864
L958
L959
L90
F605
94L2
85
ATC
C15
ATC
C43
M
248
313
M L281
8L3
10L3
12L3
30
L364
L941
L254
G60
06C
134
M
0
Ceppi 4b Ceppi Ceppi 1/2b avirulenti
Conte batteriche recuperate negli organi dei topi inoculati i.g.
Conte batteriche recuperate Conte batteriche recuperate negli organi dei topi inoculati negli organi dei topi inoculati i.gi.g..
p < 0.05
Scott A
(4b)
L 90 (4
b)
L 2818
(1/2b
)
L 254 (
1/2b)
Scott A
(4b)
L 90 (4
b)
L 2818
(1/2b
)
L 254 (
1/2b)
Scott A
(4b)
L 90 (4
b)
L 2818
(1/2b
)
L 254 (
1/2b)
0123456789
intestineliverspleen
Log 1
0 C
FU/g
org
an
Listeria monocytogenes sierotipo 4bCLONI EPIDEMICI (EC)
Listeria monocytogenesListeria monocytogenes sierotiposierotipo 4b4bCLONI EPIDEMICI (EC)CLONI EPIDEMICI (EC)
17B
133
85M
ECI + + +Altri 4b - - -ECII - - -
17B
133
85M
ECI + + +Altri 4b - - -ECII - - -
MarkersMarkersper ECIper ECI
MarkersMarkersper ECIIper ECII
MarkersMarkers specifici dei cloni epidemicispecifici dei cloni epidemici
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M bp
20001500
750
250
A ECI-specific markers B ECII-specific markers
Distribuzione dei markers epidemici fra i ceppi diDistribuzione dei L. monocytogenes 4b isolati in Italia
Distribuzione dei markersmarkers epidemici fra i ceppi diepidemici fra i ceppi diL.L. monocytogenesmonocytogenes 4b isolati in Italia4b isolati in Italia
81 ceppi analizzati81 ceppi analizzati
6/32 clinici (18.7%) 7/32 clinici (28%)6/32 clinici (18.7%) 7/32 clinici (28%)7/44 alimentari (15.9%) 6/44 alimentari (13.6%)1/5 ambientale (20%) 1/5 ambientale (20%)
14 ECI 14 ECII34.6%
Studio del fattore di virulenza Studio del fattore di virulenza InternalinaInternalina((InlAInlA))
Internalin-mediated Listeria invasion
Internalina: forma intera e forma troncataInternalinaInternalina: forma intera e forma troncata: forma intera e forma troncata
InlA intera
InlA troncata
InternalinaInternalina dei ceppi clinici di dei ceppi clinici di L.L. monocytogenesmonocytogenes isolati in Italiaisolati in Italia
65 ceppi analizzati 65 ceppi analizzati mediante Western mediante Western blottingblotting
7 producono 7 producono internalinainternalina troncatatroncata
FARMACO BOTULISMO
TOSSINA BOTULINICATOSSINA BOTULINICATOSSINA BOTULINICABeauty the Beast…
and
ARMA BIOLOGICACOSMETICO
Struttura e meccanismo d’azioneStruttura e meccanismo d’azionedella tossina della tossina botulinicabotulinica
Tossine botuliniche e targetsTossine botuliniche e Tossine botuliniche e targetstargets
Cluster genici codificanti per i “complessi tossici”
ClusterCluster genici codificanti per i genici codificanti per i “complessi tossici”“complessi tossici”
Struttura del cluster genico per la tossina botulinica di tipo A (bont/A)
Struttura del Struttura del clustercluster genico per la tossina genico per la tossina botulinicabotulinica di tipo A (di tipo A (bontbont/A)/A)
ha70ha70 ha17ha17 ha33ha33 botR/A ntnhntnh bontbont/A1/A1Tipo A1
orfX2 orfX1 botR/A p47p47 ntnh bontbont/A2/A2Tipo A2
Prodotti PCR di ha33 e p47da C. botulinum tipo A
Prodotti PCR di ha33 e p47da C. botulinum tipo A
ha33(774 bp)
p47(1236 bp)
16361018506
3054
bp62A
2776 1903 52771882 3517 588
CL91CL130
CL2962A
27761882
19033517
5277588
CL91CL130
CL29
Pattern di restrizione con XbaI dei prodotti PCR di bontbont/A/A
62A 1757 1882 1903 35171839 588 CL91 S1572171 CL130 CL186 CL127 CL29 CL104
1500
Tipo A1 Tipo A2Tipo A1 Tipo A2Tipo A1 Tipo A2
bp bp
25002 000
800
ClusterCluster genico di genico di bontbont/A/A
Strains ha33 gene p47gene bont/A RFLP type
bont/A gene cluster
C. botulinum type A
10 (U.S.) + − A1 1 33 (Italy) − + A2 2 2 (U.S.) − + A1 3
C. botulinum type Ab
4 (Italy) + + A2 2 1 (U.S.) + + A1 3
C. botulinum type A(B)
5 (U.S.) + + A1 3 1 (U.S.) + + A2 2
Strategia di SequenziamentoStrategia di Strategia di SequenziamentoSequenziamentoCluster genico di BoNT/A (CEPPO C. botulinum “MASCARPONE”)
K2Frammento 1: ~ 5Kb
Frammento 2: ~ 5Kb
K33NT1
K6NT1
K2 111
1213
142
34 15
5 166 17
1878 19
920
10 K6K33
OrfsOrfs individuati nella sequenza del ceppo individuati nella sequenza del ceppo “Mascarpone” (10,6 “Mascarpone” (10,6 KbKb))
9489999912963891boNT/A
9592979511593480NTNH
878198954161251p47
98979692178537botR
99999088142429ORFX1
9997100100210631ORFX2(parziale)
% omologia ceppo NCTC2916 (A1)
% identitàceppo NCTC2916 (A1)
% omologia ceppo Kyoto-F (A2)
% identitàceppo Kyoto-F (A2)
AminoacidiNucleotidiORF
Ruoli delle proteine accessorieRuoli delle proteine accessorie
• Protezione della tossina nel tratto gastrointestinale• Legame alle pareti intestinali• Interazione con i residui di carboidrati sui globuli rossi• Ruolo nella stabilità dell’agente terapeutico
Differenze nella sequenza Differenze nella sequenza aminoacidicaaminoacidicadella tossina della tossina botulinicabotulinica tipo Atipo A
• Diverse proprietà antigeniche• Diversità nel riconoscimento del recettore?
RingraziamentiRingraziamenti
Paolo Aureli
Laura Toti
Francesca Floridi
Antonella Maugliani
Concetta Scalfaro