Microrganismi positivi
Microrganismi negativi
+ +Microrganismi
*autoctoni *inerti
*alteranti * indici di contaminazione
Qualità Salubrità
? ?
Qualità microrganismi positivi
Sono protagonisti del processo produttivo
Contribuiscono alla tipicità dell’alimento
BATTERI LATTICI: Lactobacillus helveticus, L. bulgaricus, Lactococcus lactis, L. cremoris, Streptococcus thermophilus
LIEVITI: Saccharomyces cerevisiae
MUFFE: Penicillium roqueforti, P. camemberti
Indicatori della qualità tecnologica
non dannosi, presenti nelle materie prime, dove non contribuiscono all’ottenimento e/o conservazione del prodotto finito
non dannosi ma in grado di causare, se presenti in alto numero, alterazioni organolettiche, incidendo sulla conservabilità del prodotto (Pseudomonadaceae, micrococchi, lieviti, muffe)
non patogeni, ma ma con lo stesso habitat e caratteristiche dei patogeni (più numerosi e più facilmente rilevabili: stafilococchi, coliformi fecali Escherichia coli)
autoctoni
alteranti
indici di contaminazione
Salubrità microrganismi negativi
patogeni
Salmonella spp.Shigella spp.Listeria monocytogenesE. coli enteropatogenoVibrio cholereae
Staphylococcus aureusBacillus cereusClostridium botyulinum
Presenza nell’alimento o nell’organismo
(carica e suscettibilità dell’ospite)
Produzione di tossine
nell’alimento o nell’organismo
(carica)
Identificazione dei microrganismi
Isolamento da matrici complesse
*Terreno complesso*Terreno selettivo*Terreno di arricchimento
*Condizioni colturali
Mantenimento in coltura coltura pura
*Conta totale
*Conta selettiva
*Riconoscimento
Studio
Analisi microbiologiche di matrici alimentari
Campionamento
Determinazione della carica microbica
1. Scelta del metodo di conta
2. Scelta e preparazione del diluente
3. Scelta e preparazione dei terreni nutritivi
4. Preparazione del campione
5. Analisi
Matrice liquida
Matrice solida Prelievi in punti diversi (superficie, interno, centro, etc.)
Diluizioni successive e piastramento in terreno solido
Soluzione fisiologica sterile : 9 g/l NaCl; sterilizzazione 1/2x1/2
Prelievo di una aliquota da matrice liquida: 1 ml (t.q.)
Prelievo di una aliquota da matrice solida: in sacchetti sterili per Stomaker, determinazione del peso, aggiunta di 10 vol. di diluente, omogenizzazione, prelievo di aliquota: 1 ml (10-1)
Impiego di terreni complessi per la carica totale (sterilizzazione ¾ x 20):PCA per conta batterica (30 °C, 3 gg, aerobiosi/anaerobiosi)YGC per conta di eumiceti (30 °C 3-7 gg, aerobiosi)Impiego di terreni selettivi per la ricerca di gruppi microbici: ad esempioMRS per conta lattobacilli (30 °C, 3 gg, anaerobiosi)M17 per conta cocchi lattici (30 °C, 3 gg, anaerobiosi)
Diluizioni successive , piastramento per inglobamento, incubazione, rilevazione risultati, espressione della carica in UFC/gr o ml)
Isolamento in coltura pura
Prelievo dalle piastre di conta di colonie rappresentative mediante ansa; risospensione di ciascuna colonia selezionata in soluzione fisiologica sterile; diluizioni e piastramento; selezione di una colonia; determinazione delle caratteristiche macromorfologiche; prelievo e trasferimento in terreno di mantenimento (solido: striscio su slant per aerobi, infissione per anaerobi)
Preservazione della coltura pura
Trapianto settimanale in terreno fresco per colture che devono essere utilizzate ; conservazione delle colture per lungo tempo mediante liofilizzazione o preparazione di brodocolture glicerinate a – 20 °C
Coltura pura = ceppo microbico
IDENTIFICAZIONE A LIVELLO DI SPECIE
La specie batterica è l’unità tassonomica di base. E’ costituita da un insieme di ceppi che possiedono:Un FENOTIPO simileUn GENOTIPO simileUna storia FILOGENETICA correlabile
Fenotipo simile = caratteristiche comuni alla specie + caratteristiche secondarie legate all’adattamento dei singoli ceppiGenotipo simile = 70 % omologia genetica >DNA/DNAStoria filogenetica correlabile = omologia di sequenza del gene codificante per l’rRNA 16 S > 97-98%
Criteri di identificazione innovativa
Fenotipo
GenotipoOmologia DNA/DNA
MacromorfologiaMicromorfologiaReazione di GramMetabolismo energeticoEsigenze nutrizionaliEsigenze colturaliPattern enzimaticoCaratteristiche strutturali
Impiego di tecniche di indagine genetica, basate sulla possibilità
di amplificare in breve tempo, regioni specifiche del cromosoma
batterico
PCR (Polymerase chain reaction)
Studi filogenetici e genetici
Appartenenza alla specie in tempi ridotti ed in modo specifico, anche per un
numero elevato di isolati da identificare
Le caratteristiche fenotipiche vengono studiate in un secondo tempo, solo sugli isolati di interesse, per permetterne il riconoscimento a livello di biotipo
Criteri di identificazione tradizionale
Il codice genetico
64 possibili triplette
Codone AA Codone
AA
UUU Fenilalanina
ACU Treonina
UUC Fenilalanina
ACC Treonina
UCU Serina ACG Treonina
UCC Serina ACA Treonina
UCG Serina GGU GlicinaUCA Serina GGC GlicinaCCU Prolina GGG GlicinaCCC Prolina GGA GlicinaCCG Prolina CAU IstidinaCCA Prolina CAC Istidina
Alcuni AA sono specificati da più di un codone
DEGENERAZIONE DEL CODICE GENETICO per minimizzare gli effetti delle mutazioni
STOP TAA TAG TGA
Promotore della trascrizione
INIZIO ATG GTG TTG CTG
GENEOPERONE
Un gene è una sequenza di nucleotidi delimitata da una tripletta di inizio e di fine, che codifica per un prodotto. La sua trascrizione e regolazione avviene ad opera di una regione promotrice e regolatrice , situata a monte della sequenza genica.Ogni gene possiede un proprio sito promotore e regolatore.
Un operone è un insieme di geni, ognuno codificante un diverso prodotto, ma regolati e trascritti da un unico promotore e regolatore, a monte del primo gene dell’operone. In questo modo la cellula risparmia…in un operone sono raggruppati geni che codificano per prodotti di cui la cellula ha bisogno nello stesso momento
Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche
Raccolta e lavaggio delle celluleRisospensione in tampone + saccarosio (6%)Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C per 30 min)Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20%Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi: fenolo, CHF/isoamilicoCentrifugazione e raccolta del surnatante
Fase acquosa contenente il DNA Interfase
SolventeUlteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatanteTrattamenti enzimatici con RNAsi e ProteinasiPrecipitazione del DNA con 2 vol. di EtOHScioglimento del DNA in tampone
una molecola carica posta all’interno di un campo elettrico migra in direzione del polo di carica opposta
in un gel costituito da un polimero organico molecole di dimensioni diverse (ma di uguale carica) migrano con velocità diverse, perché le molecole di dimensioni maggiori incontrano maggiore resistenza tra le maglie di un gel
È così possibile visualizzare il DNA facendolo migrare all’interno di un supporto solido (gel) e colorandolo opportunamente
Visualizzazione per via elettroforetica
I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI:Tampone : crea continuità nella vaschettaAGAROSIO: polimero che costituisce il gelIndicatore DI CORSA: permette di visualizzare la corsa ed aumenta la densità della soluzione di DNA da inserire nelle taschine del gelBROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi azotate delle molecole di DNA e lo ‘colora’
LA STRUMENTAZIONE DELL’ELETTROFORESI:
1) ALIMENTATORE:crea la differenza di potenziale
2) VASSOIO e VASCHETTA ELETTROFORETICA:vi si alloggia il gel, vi si instaura il campo elettrico
Il caricamento del gel
VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE A LUCE ULTRAVIOLETTA (254-312nm)
POLO -
POLO +
] bande di DNA
frammenti di lunghezza maggiore
frammenti di lunghezza minore
IL RISULTATO DI UNA CORSA ELETTROFORETICA
La replicazione in vivo
20
INTERVENGONO PER LA FORMAZIONE DELLA FORCELLA = DENATURAZIONE
SINTETIZZANO I PRIMERS
La replicazione in vitro: Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosomaPCR Polymerase chain reaction
DNA totale estratto dalle cellule = DNA stampo o templato (in opportuno tampone di reazione
5’3’
3’5’
Separazione dei filamenti mediante DENATURAZIONE (95°C 3-5 min)
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
FASE DI APPAIAMENTO = T di appaiamento per 30-60 ‘’ T app. =Tm (primer) – 3°CTm = 4 x (G+C) + 2 x (A+T)
Oligonucleotidi (INIZIATORI o PRIMERS) di 15-20bp
+
=DNA polimerasi termostabile = dNTP
+ +
3’
5’
5’
3’
FASE DI ALLUNGAMENTO = T di AZIONE DELL’E = 72-75°c per 30-60 ‘’
Fase di denaturazioneFase di appaiamentoFase di allungamento
1 ciclo
25-30 cicli = 106-107 copie
3’
5’
5’
3’
Verifica dell’avvenuta amplificazione:
•gel elettroforesi•Controllo negativo
Costruzione dei primers
5’ TAATACTTTTT------------------------GAGATGTT 3’
1° FORWARD 5’ TAATACTTTTT 3’
2° REVERSE 5’GAGATGTT3’
3’CTCTACAA5’ 5’ AACATCTC3’
APPAIAMENTO
5’ TAATACTTTTT--------------GAGATGTT3’3’CTCTACAAA5’
5’ TAATACTTTTT3’3’ ATTATGAAAAA---------------CTCTACAA5’
Se una specie batterica possiede nel suo cromosoma un gene o una regione specifici, allora posso costruire una
•Devo conoscere la sequenza nucleotidica agli estremi del gene o regione specifica•Devo costruire i primers idonei•Devo estrarre il DNA batterico totale dal campione in cui devo ricercare la presenza di quella determinata specie•Devo condurre una amplificazione specie-specifica•Devo conoscere il PM dell’amplificato che mi aspetto e l’eventuale numero di copie presenti lungo il cromosoma
Lactococcus lactis (933 bp) e cremoris (933 + “n” 59)
lactis
Lactococcus garvieae (1100 bp)
Gene his
16S rDNA
lacZ
reg. conserv.
Gene ddl (Ala-Ala ligasi)
Streptococcus thermophilus (950 bp)
Enterococcus faecium (650 bp)Enterococcus faecalis (940 bp)
Se non conosco la sequenza, e non ho indicazioni sull’appartenenza a una determinata specie:.
devo avvalermi di primers UNIVERSALI
Geni conservati in tutti i procarioti
Gene 16S rRNA
il sequenziamento del gene 16SrDNA
Il sequenziamento viene generalmente condotto da tecnici specializzati e fornito sotto forma di cromatogramma. Una sequenza parziale delle prime 500 bp del gene, può essere sufficiente per determinare la specie di appartenenza del ceppo allo studio, tramite comparazione in banca dati con le sequenze note riportate.Ricordiamo che due ceppi appartenenti alla stessa specie devono possedere una % omologia 16S rDNA >97-98%
Il gene 16S rRNA si trova all’interno dell’OPERONE RIBOSOMALE
P16S 23S
T
Regione spaziatrice
Posso usare sempre Primers Universali
La RS è la parte più variabile dell’operone ribosomale posso distinguere generi e specie diverse in funzione del numero e del peso molecolare degli amplificati ottenuti
Ci possono essere sul cromosoma più operoni ribosomali
La lunghezza della RS può essere differente sia nell’ambito dello stesso ceppo che tra ceppi diversi
Enterococcus sp.E. faecalis
E. duransE. faecium
E. sulfureus
E. avium
E. gallinarum
nell’ambito lattiero-caseario:1 380 bp L. lactis2 410 bp L. garvieae3 350 bp S. thermophilus4 500 bp ??5 a) b) c) d) 2 amplificati
300-500 bp Enterococcus spp.
1 2 3 4 5a 5b 5c 5d MRSA
I risultati vanno verificati con sonde specie-specifiche o con riassociazione
molecolare DNA/DNA o con il sequenziamento del gene 16S rRNA.