Questo umore…….immediatamente si solidifica non solo al di fuori del corpo,
ma addirittura all’interno dei suoi naturali contenitori: questa
solidificazione termina con la formazione di un “thrombus”, termine con il quale i Greci chiamano il sangue solidificato.
Galeno (130-200 dC)
Galeno, La bile nera. Corpus medicorum Graecorum Quae Extant V: 106, Leipzig Cnoblock, 1823
Cosa è l’emostasi?Serie di reazioni biochimiche e cellulari, sequenziali e sinergiche, che hanno lo
scopo di impedire la perdita di sangue dai vasi.
E’ un meccanismo di difesa, finalizzato al mantenimento dell’integrità dei vasi sanguigni e della fluidità del sangue
Alterazioni Alterazioni dell’emostasidell’emostasi
Aumento RiduzioneAumento Riduzione
Trombosi EmorragiaTrombosi Emorragia
Fasi del processo emostatico
1- Vascolare contrazione Riduzione lume muscolatura vasale vascolare2- Piastrinica - adesione - risposta biochimica Formazione - shape change tappo - degranulazione piastrinico - aggregazione
3- Coagulativa attivazione di Formazione proteasi plasmatiche coagulo fibrina
4- fibrinolitica attivazione sistema Dissoluzione fibrinolitico coagulo
RIPARAZIONE LESIONE VASCOLARE
RUOLO DELL’ENDOTELIO NEL PROCESSO EMOSTATICO
L’endotelio veniva considerato, in passato, come una semplice barriera passiva, la cui unica funzione consisteva nel trasferimento
di nutrienti e nel regolare gli scambi di ossigeno e anidride carbonica tra sangue e tessuti.
L’endotelio è, invece, un tessuto metabolicamente attivo, che, a seconda del suo stato funzionale, può favorire
o inibire l’emostasi. Costituisce una superficie che modula il tono vascolare
e regola il sistema emostatico, mantenendo il sangue in stato di fluidità.
Questa proprietà si basa su numerose attività presenti sull’endotelio o secrete in circolo in condizioni di normalità,
che nel loro insieme definiscono la cosiddetta
BILANCIA EMOSTATICA ENDOTELIALE
BILANCIA BILANCIA EMOSTATICAEMOSTATICA ENDOTELIALEENDOTELIALE
Attività antitrombotiche Attività protrombotiche
Attività anti-aggreganti piastriniche:PGI2, ecto-ADPasiOssido Nitrico (NO)
Attivitàanti-coagulanti:TrombomodulinaEparan solfato
Attivitàfibrinolitiche: tPA, uPA
Attivitàpro-adesive epro-aggregantipiastriniche: PAF, vWF
Attivitàpro-coagulanti: TF, legame di Fatt V, IXa, Xa
Attività anti-fibrinolitiche: PAI
vasodilatazio
ne
vasocostrizione
FASE VASCOLARE – VASOCOSTRIZIONE
Il primo evento del processo emostatico è la vasocostrizione a livello della zona lesa utile
a ridurre momentaneamente la perdita di sangue
Risposta diretta (miogena) delle cellulemuscolari lisce della tunica media
Riflesso neurovegetativo vasomotore nerva vasorum
Rilascio endotelina (endotelio)
Rilascio serotonina piastrinica
ENDOTELINA-1 (ET-1)
Polipeptide di 21 animoacidi prodotto costitutivamente, in basse concentrazioni,dalle cellule endoteliali (ma anche da cellule muscolari lisce).
SINTESI: precursore inattivo, pre-pro-entotelina
“big endotelina” (38 aminoacidi)
endotelina matura, biologicamente attiva
taglio proteasico
ECE (ET-converting-enzyme)
2 tipi di recettori: ETA ed ETB, a sette domini transmembranaassociati a proteine G, che promuovono effetti diversi secondo il tipo
di cellule su cui si trovano (cellule muscolari lisce e cellule endoteliali).
Vasocostrizione
Proliferazione cellulareProduzione di citochine e fattori di crescitaDeposizione di ECM
In condizioni fisiologiche vi è un equilibrio dinamico tra vasocostrizione e vasodilatazione. In tale equilibrio l’ET gioca un ruolo importante
mediante la sua azione sui recettori specifici: l’interazione con i recettori presenti
sulla membrana delle cellule muscolari lisce della parete vascolare determina
la contrazione di queste cellule e conseguentemente vasocostrizione che
controbilancia l’effetto di vasodilatazione dovuto all’azione di NO e PGI2 prodotte dalle cellule endoteliali
i recettori ETB sonodown-regolati sulle cellule endoteliali
Ridotta produzione di NO e prostaciclina
i recettori ETB sono up-regolatisulle cellule muscolari lisce dei vasi
Aumentata contrazione e proliferazione vasocostrizione
ENDOTELINA IN CONDIZIONI PATOLOGICHE“ENDOTELIO ATTIVATO”
MECCANISMO D’AZIONE DI ENDOTELINA-1
Liberazione di ET-1 dalle cellule endoteliali
Legame di ET-1 ai recettori presentisulla membrana delle cellule muscolari lisce
(recettori a sette domini transmenbranalegati a proteine G)
Aumento di calcio citosolico
Contrazione delle cellule muscolari
RUOLO DELLA VASOCOSTRIZIONENEL PROCESSO EMOSTATICO
permette di ridurre il deflusso di sangue attraverso il vaso danneggiato, riducendo in tal modo l’entità dell’emorragia
(fase vascolare dell’emostasi)
favorisce, in seguito al rallentamento del flusso nel vaso leso,i fenomeni di marginazione delle piastrine, con
conseguente loro attivazione (fase piastrinica dell’emostasi)
favorisce l’accumulo locale dei fattori della coagulazione attivati in seguito alla esposizione del tessuto sottoendoteliale o in seguito alla liberazione, da parte dei tessuti danneggiati,
di materiale tromboplastinico (fase della coagulazione).
ENDOTELIO E FASE PIASTRINICA DELL’EMOSTASI
DANNO ENDOTELIALE conesposizione del sottoendotelio
Esposizione delle proteineadesive della ECM
Adesione piastrinica
Attivazione piastrinica
Aggregazione
Oltre alla vasocostrizione, che favorisce il fenomeno della marginazione delle piastrine, vengono alterati i normali rapporti fra parete vascolare e piastrine e
la parete vascolare, compreso l’endotelio, assume attività adesive ed aggreganti.La normale funzionalità dell’endotelio può risultare alterata in seguito a:
ATTIVAZIONE DELLE EC (DANNO BIOCHIMICO)
“perturbazione o disfunzione endoteliale”
produzione di fattori implicati in adesione (vWF, selectina P rotolamento) e
aggregazione piastrinica (PAF)
presenza di trombina (attività aggregante) sulle EC attivate in seguito ad esposizione di
fosfatidilserina che lega la trombina.
esposizione del TF sulla membrana cellulare via estrinseca della coagulazione formazione
di uno strato di fibrina, su cui aderiscono le piastrine attivate mediante GP IIb/IIIa
BFU-Mega CD34+ pro-megacarioblasto(Burst Forming Unit) (prima cellula riconoscibile)
megacarioblasto
megacariocita basofilo
megacariocita granuloso
emissione di prolungamenti che si allungano progressivamente da cui si distaccano le piastrine megacariocita ridotto a solo nucleo che viene fagocitato dai macrofagi midollari
PIASTRINE MATURE
Piastrine Reticolate Piastrine giovani nel sangue periferico con elevato contenuto in RNA.Sintesi di diverse proteine, quali: Glicoproteine Ib, IIb (CD41) /IIIa (CD61)
PIASTRINOPOIESI
Replicazione del DNA senza divisionedel citoplasma nucleo grosso, poliploide, da 4 a 64 N.Aumento della dimensione delle cellule da 20 a 100 diametro
Citoplasma basofilo, finemente granulosoGranuli che tendono a aumentare
Nucleo lobulato, numero di lobuli correlatoal grado di poliploidia. Cromatina addensatacitoplasma acidofilo con numerosegranulazioni basofile
Ogni megacriocita durante la suaVita genera circa 4000 piastrine
trombopoietina
FASE PIASTRINICA
LE PROTEINE DELLA SUPERFICIE PIASTRINICA CON FUNZIONE ADESIVA
FUNZIONE classif. elettroforetica classif. Integrinica
_________________________________________________
Rec. Collageno GpIa/IIa 2/1
Rec. Fibronectina GpIc/Iia 5/1
Rec. Vitronectina v/3
Rec. Fibrinogeno GpIIb/IIIa IIb/3
Rec. Laminina GpIc/IIa 6/1
Rec. vWF GpIb/IX/V non integrina
Rec. Collagenoo trombospondina GpIV non integrina
CONTENUTO DEI GRANULI PIASTRINICI
LISOSOMI enzimi lisosomiali
CORPI DENSI (granuli delta) agonisti della aggregazione:
ADP, ATP, Ca, Serotonina
GRANULI ALFA:
PROTEINE “SPECIFICHE” PIASTRINICHE: Fattore piastrinico 4 (PF4), β-tromboglobulina
PROTEINE ADESIVE: Fibrinogeno, fibronectina, fattore di von Willebrand, trombospondina, vitronectina
MODULATORI DI CRESCITA: PDGF, TGF-beta, trombospondina
FATTORI DELLA COAGULAZIONE: Fattore V, HMWK, C1-inibitore, Fibrinogeno, fattore XI, proteina S, PAI-1
ADESIONE PIASTRINICA
• L’endotelio integro e la superficie piastrinica si respingono in virtù delle loro cariche negative• La perdita dell’endotelio espone il collageno sottoendoteliale, che lega la GpIa. La GpIb si lega al vWF, a sua volta adeso al collageno
PiastrinaGpIa GpIb
= collageno
Piastrina
= fattore di Von Willebrand (multimero)
endotelio
Membrana basalelesione
ATTIVAZIONE PIASTRINICA
cambiamento di forma
degranulazione
In seguito all’adesione le piastrine attivano meccanismi di trasduzione che determinano il cambiamento di forma e la reazione didegranulazione
Esposizione di FP3
Centralizzazionedei granuli
GpIIb-IIIa GpIIb-IIIa
FibrinogenoL’aggregazione piastrinica siverifica perché il fibrinogenosi pone a ponte tra il GpIIb-IIIa di una piastrina e quello di altre piastrine. Il fibrinogeno è quindi il“collante” dell’aggregazione.Il cross-linking della trombospondina stabilizza illegame
AGGREGAZIONE PIASTRINICA
L’aggregazione piastrinica è un fenomeno bifasico e si può distinguere in primaria e secondaria.
L’aggregazione primaria (prima onda di aggregazione),
è un’aggregazione reversibile, indotta da piccole quantità di agonisti che interagiscono con i loro recettori sulla
membrana piastrinica (ADP, collageno, trombina, PAF, ecc.)TAPPO EMOSTATICO PRIMARIO O TEMPORANEO
L’aggregazione secondaria (seconda onda di aggregazione) è dovuta invece sia all’interazione di grosse quantità di agonisti
con i loro recettori, sia al rilascio di grosse quantità di ADP e quindi di TXA2 da parte delle piastrine attivate da piccole
quantità di agonisti. TAPPO EMOSTATICO SECONDARIO O TAPPO PIASTRINICO
AGGREGAZIONE PIASTRINICA
AGGREGAZIONE DA ADP E COLLAGENO STUDIATE CON L’AGGREGOMETRO
Periodo di latenza seguito da aggregazioneirreversibile le piastrine aderisconoal collagene, vengono attivate e rilascianoADP, che è il vero responsabile dell’aggregazione
AGONISTI E ANTAGONISTIDELLA AGGREGAZIONE PIASTRINICA
AGONISTI ANTAGONISTI
Collageno ++++ ProstaciclinaTrombossano A2 ++++ Ossido NitricoPAF * +++ Prostaglandina D2ADP ++ AdenosinaTrombina ++ Adrenalina (rec.beta)Adrenalina(rec. Alfa) ++Complessi immuni ++Vasopressina ++Serotonina ++Prostaglandina H2 +++__________________________________________________* PAF = Platelet Activating Factor
MECCANISMI DI TRASDUZIONE NELLA ATTIVAZIONE PIASTRINICA
Gli agonisti della aggregazione piastrinica possono essere classificati inbase alla capacità di indurre aggregazione da soli oppure in combinazione
fra loro agonisti deboli e agonisti forti
Esistono differenti meccanismi di trasduzione dello stimolo chedipendono dal tipo di agonista e dal recettore con cui questo interagisce
Gli agonisti possono interagire con 2 categorie di recettori:
-Recettori a sette domini transmembranaassociati a proteine G
-Recettori associati a proteinchinasi
1-RECETTORI ASSOCIATI A PROTEINE G
G-protein
Membrana piastrinaPLC
PIP2
IP3
DAG PKC
Ca++
Granulo deltaADP
Plekstrina Plekstrina-P
ADP
ADP
ADP
AttivazioneMLCK
Miosina-P
degranulazione
Schema 2
GpIIb/IIIa
AGONISTA
2- RECETTORI ASSOCIATI A PROTEINE G
L’ ADP interagisce per autocrinia e paracrinia su recettori specifici
ADP
PLA2
PL-AA
AA
TXA2
>[Ca++]
IP3(vedi schema 1)
PLC
Replica “potenziata” delle trasduzioni delloschema 1
GpIIbGpIIIa
GpIIb-IIIa
PKCGP
ADP
PLC
Schema 1
Esiste un’altra classe di recettori agonisti dell’aggregazione,associati a proteine di trasduzione Gi in grado di inibire
la attivazione della adenilato-ciclasi. Il blocco della formazione di cAMP favorisce la aggregazione piastrinica.
Questo meccanismo pro-aggregante è comunque meno ricorrente rispetto a quello correlato all’attivazione delle fosfolipasi C e A2
Le sostanze che si oppongono o inibiscono l’aggregazione piastrinica sidefiniscono ANTAGONISTI della aggregazione piastrinica. Tutti gli
antagonisti possiedono recettori piastrinici associati a proteine G confunzione stimolatrice (Gs) sulla attività della adenilato/guanilato ciclasidi membrana: l’ aumento di nucleotide ciclico inibisce l’aggregazione
Gs
Adenilato/guanilato-ciclasi
ATPGPT
cAMPcGMP
Recettore antagonista
Inibizione
cAMP: blocca il legame
degli agonisti ai loro recettori, inibisce
la fosfolipasi C,inibisce
la proteino-chinasi C ed
antagonizza le risposte
mediate dal calcio
IIb
y
y
PLC
Gq
Ca 2+Ca 2+
ADP
P2X1
ADP
P2Y1
ADP
P2Y12
Gi2AC
ATPcAMPMLC-kinase
MLC-P
SHAPE CHANGE
TRANSIENTAGGREGATION
SUSTAINEDAGGREGATION
-
ADPCOOPERAZIONE TRA RECETTORI P
TROMBINA
La trombina è un potente AGONISTA della aggregazione piastrinicae la sua attività proteasica è richiesta per svolgere tale azione
La trombina attiva un particolare recettore, PAR-1 (Protease-Activated Receptor-1) presente sulla superficie
piastrinica. Tale recettore appartiene alla famiglia di recettori associati a proteine G. L’attivazione di questo recettore da
parte della trombina avviene in seguito ad un taglio proteoliticodi 41 aminoacidi a livello della porzione N-terminale del recettorestesso. La rimozione di questo peptide determina la formazione di un nuovo terminale N, che si lega ad un’altra regione di PAR-1
ed agisce come agonista (“tethered ligand”).
PAR-1 è associato a diverse famiglie di proteine G e quindi puòattivare varie vie di trasduzione ruolo pleiotropico della trombina
TROMBINA
PARs: Protease-Activated Receptors
RECETTORI ASSOCIATI A PROTEINCHINASI
PLC-γ
PIP2
IP3
DAG PKC
Ca++
AGONISTA
TIROSIN-CHINASI
Vedi schema 1Alcuni agonisti, interagendo con
il proprio recettore, attivanotirosinchinasi, che, a loro voltaattivano PLC (vedi schema 1)
ATTIVAZIONE PIASTRINICA INDOTTA DA COLLAGENO
Complesso GPVI/FcRγ
fosforilazione di FcRγ (ad opera della tirosinchinasi Fyn)
legame di Syk al complesso fosforilato
fosforilazione e attivazione di Syk
fosforilazione e attivazione di BTK (Bruton’s tyrosine kinase)
Fosforilazione e attivazone di PLC
ATTIVITA’ PROCOAGULANTE DELLE PIASTRINE
Nelle membrana plasmatica delle piastrine non attivate i fosfolipidi hanno una disposizione asimmetrica: i fosfolipidi carichi negativamente (PS e PE) sono presenti quasi esclusivamente sul
lato interno del doppio strato lipidico meccanismo di controllo in grado di prevenire una inappropriata attivazione della coagulazione
L’asimmetria dei fosfolipidi di membrana è regolata da 3 enzimi:- TRASLOCASE, enzima ATP-dipendente trasporto rapido di amino-fosfolipidi dal lato esterno a quello interno. Attività inibita dal calcio- FLOPPASE, enzima ATP-dipendente, con attività non lipido-specifica trasporto lento di amino-fosfolipidi verso il lato esterno della membrana- SCRAMBLASE, enzima Ca++-dipendente, con attività non lipido-specifica permette il movimento casuale dei lipidi nella membrana
Nella piastrina non attivata, a concentrazioni fisiologiche di calcio, la asimmetria dei lipididi membrana è mantenuta in quanto l’enzima scramblase è inattivo, mentre sono attivi glienzimi traslocase e floppase.
Nelle piastrine attivate, l’aumento delle concentrazione di calcio inibisce l’attività dell’enzimatraslocase e contemporaneamente attiva l’enzima scramblase ridistribuzione dei lipidi dimembrana con perdita della asimmetria ed esposizione del fattore piastrinico 3
L’aumento del calcio citosolico, inoltre, attiva l’enzima calpaina con conseguente formazione dimicrovescicole con elevata concentrazione di PS una membrana piastrinica particolarmente
arricchita di fosfatidil-serina costituisce una superficie ottimale per l’assemblaggio dei complessi multimolecolari critici per l’avvio ed il mantenimento del processo di coagulazione
(complesso tenasico e complesso pro-trombinasico).
ATTIVITA’ PROCOAGULANTE DELLE PIASTRINE