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R. Carrozzo, D. Verrigni
Unità di Malattie Muscolari e Neurodegenerative Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Roma
Efficienza diagnostica dei pannelli NGS per la diagnosi genetica delle malattie mitocondriali:
risultati di 3 anni di attività
6° Convegno Nazionale Malattie Mitocondriali Roma, 27-28-29 Maggio 2016
www.mitocon.it
PROGRAMMA SESSIONI SCIENTIFICHE (ECM)
Programme Scientific Sessions
VENERDÌ 27 MAGGIO 2016 8:45
Registrazione partecipanti - Registration of participants Intervento di Apertura - Opening speech
1° Sessione – DALLA RICERCA DI BASE ALLA CLINICA DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI 1st Session – From basic research to the clinical comprehension of mitochondrial disease
Moderatori: Gabriele Siciliano Università di Pisa – Università Milano P. Santantonio – Mitocon
09.00 09:15 09:40 10:05 10:30 10:55
Mitochondrial disease: a story - Cristina Sarra - mito-mamma Getting ready to clinical trials: the importance of registry, natural history, biomarkers and outcome measures - Micho Hirano – Columbia University – New York USA Resolving the genetic basis of mitochondrial disorders Patrick Chinnery – Cambridge University - UK Metabolomi e Biomarkers Marilena D’Aurelio – Cornell University - New York USA New therapeutic perspectives: state of the art in general and specific treatments Massimo Zeviani – MRC Cambridge, UK Coffee Break
2° Sessione – Genotipi – Fenotipi 2nd Session – Genotypes – Phenotypes
Moderatori: Enrico Bertini IRCCS Bambino Gesù - Roma - Paola Desideri – Mitocon
11:20 11:45 12:10 12:35 13:00
Efficienza diagnostica dei pannelli NGS per la diagnosi genetica delle malattie mitocondriali: risultati di 3 anni di attività Rosalba Carrozzo, Daniela Verrigni - IRCCS Bambino Gesù -Roma Encefalopatie associate a Difetto di PDH in età pediatrica: correlazioni clinico-genetiche e possibili prospettive terapeutiche Anna Ardissone – Isabella Moroni – IRCSS C. Besta - Milano Storia Naturale di patologie mitocondriali dell’adulto Serenella Servidei – Università Cattolica “A. Gemelli” - Roma Malattie Mitocondriali senza coinvolgimento neuromuscolari Carlo Dionisi Vici – IRCSS Bambino Gesù – Roma Expanding the ocular envolment in mitochondrial disorders Valerio Carelli – Università di Bologna
13:25
Pranzo – Lunch
Ampio spettro di presentazioni cliniche: qualsiasi sintomo,
qualsiasi organo o tessuto, qualsiasi età.
Gli organi più colpiti sono quelli che hanno maggior fabbisogno energetico
(cervello, muscolo, cuore)
FENOTIPO CLINICO
Le Malattie Mitocondriali sono considerate il disordine metabolico
più frequente con una prevalenza pari a 1:5000-1:8500 nati
VARIABILITA’ GENETICA
W.J.H. Koopman et al., Embo Mol Med, 2016 S. DiMauro et al., Nat Rev Neurol, 2013
Geni codificanti subunità strutturali OXPHOS
Geni codificanti fattori di assemblaggio OXPHOS
Geni codificanti fattori coinvolti nel mantenimento e/o replicazione del mtDNA
Geni codificanti fattori coinvolti nella sintesi proteica
Geni codificanti per fattori della biosintesi dei lipidi e cofattori
H+ ATP H+
H+
H+
H+
1500 GENI NUCLEARI
REPLICAZIONE
FORMA DIMENSIONE
BIOSINTESI/TURN-OVER COMPLESSI RESPIRATORI
MITOFAGIA BIOGENESI
DINAMICA
CA 2+
BIOGENESI CENTRI FE/S MITOCONDRIALI
200 GENI-MALATTIA
Istochimica su sezioni di biopsia muscolare
Biochimica degli complessi enzimatici I-IV della catena respiratoria su omogenato di biopsia muscolare
Test biochimici e citochimici su fibroblasti ottenuti da biopsia cutanea
Ricerca di alterazioni genetiche
PROCESSO DIAGNOSTICO
INDAGINI GENETICHE
qRT-PCR: DEPLEZIONE DEL mtDNA
LONG-PCR: Delezioni singole del mtDNA, o Delezioni Multiple
Sequenziamento “Sanger” Sindrome (mtDNA o nDNA) Eredità materna (intero mtDNA) Clinica Eterogenea (gene 1-?, gene 2-?, etc)
PCR di sequenza
………2 giorni di lavoro……….
PCR PCR PCR PCR PURIFICA DELLE PCR
3’
SINGOLO GENE
PCR
SANGER NGS
+ Pazienti +Geni
……… 2 giorni di lavoro………
Sequenziamento + allineamento + chiamata varianti
Librerie genomiche
FENOTIPO GENOTIPO
NEXT–GENERATION-SEQUENCING
NGS
? Pazienti mitocondriali
?
? ? ?
? DIAGNOSI GENETICA
Frequenza nella popolazione (>1%)
Patogenicità delle varianti (sift/polyphen)
Fenotipo=Genotipo
Tipo di Ereditarietà
1381 geni nucleari mitocondriali ASSOCIATI/NON
ASSOCIATI MALATTIA
TARGETING RESEQUENCING 47 pazienti
5 NON ASSOCIATI A MALATTIA 18 GENI
Positivi
43% Negativi
57%
DIAGNOSI GENETICA (20 pazienti)
MITOEXOMA BGI
NGS si basa su 2 Approcci Whole-Exome-Sequencing (WES)
Targeting Resequencing
Kopajtich R, … Prokisch H. Mutations in GTPBP3 cause a mitochondrial translation defect associated with hypertrophic cardiomyopathy, lactic acidosis, and encephalopathy. Am J Hum Genet. 2014; 95(6):708-20. doi: 10.1016/j.ajhg.2014.10.017.
Brea-Calvo G, … Ghezzi D. COQ4 mutations cause a broad spectrum of mitochondrial disorders associated with CoQ10 deficiency. Am J Hum Genet. 2015; 96(2):309-17. doi: 10.1016/j.ajhg.2014.12.023.
Dallabona C, ... Bertini E. LYRM7 mutations cause a multifocal cavitating leukoencephalopathy with distinct MRI appearance. Brain. 2016 Mar;139(Pt 3):782-94. doi: 10.1093/brain/awv392.
Torraco A, … Carrozzo R. A novel mutation in NDUFB11 unveils a new clinical phenotype associated with lactic acidosis and sideroblastic anemia. Clin Genet. 2016 Apr 21. doi: 10.1111/cge.12790.
Di Nottia M., ... Carrozzo R. DJ-1 modulates mitochondrial response to oxidative stress: clues from a novel diagnosis of PARK7. Submitted to Clinical Genetics
Di Nottia M., … Carrozzo R. Novel homozygous mutation in mitochondrial Elongation Factor EF-Tu associated to leukodystrophy and defective mitochondrial DNA translation. Ready for submission
Torraco A, Ardissone A., … Ghezzi D, Carrozzo R. Novel mutations in IBA57 are associated with leukodystrophy and variable clinical phenotypes. Ready for submission
WHOLE-EXOME-SEQUENCING (WES) 13 PAZIENTI
SEQUENZIAMENTO DELL’INTERA PORZIONE CODIFICANTE IL GENOMA UMANO
BGI
Positivi
38%
In esame
62%
DIAGNOSI GENETICA (5 pazienti)
ACAD9
ELAC2
IBA57
FOXRED1
SLC16A2
File xls con elenco varianti Dati grezzi (Unità di Genomica; Dr. M. Tartaglia)
? ?
? ? Diagnostica “in house” Pannelli Targettati
Positivi
25%
Negativi
75%
PANNELLO mtDNA
PANNELLO mtDNA
16569 bp
“in house” DIAGNOSI GENETICA (8 pazienti analizzati)
POLG1, TWINKLE, RRMB2, TYMP, DGUOK
? ?
? ? Diagnostica “in house” Pannelli Targettati
PANNELLO mtDNA
PANNELLO nDNA
PANNELLO nDNA
“in house” GENI DELEZIONI
/DEPLEZIONE
DIAGNOSI GENETICA (40 pazienti)
Positivi
17%
Negativi
26% In esame
57%
? ?
? ? Diagnostica “in house” Pannelli Targettati
PANNELLO mtDNA
PANNELLO nDNA
TRUSIGHT-ONE
4813 GENI OMIM 400 GENI MITOCONDRIALI TRUSIGHT-ONE “in house”
- CI e CIV
1°es.
Fenotipo mitocondriale
- Cardiomiopatia
- Lieve ritardo psicomotorio
- Sintesi ATP normale nei fibro
KARS Lysil
tRNA-Synthase
FENOTIPI NEUROLOGICI
MAI A MALATTIA
MITOCONDRIALE
Ribonucleasi RNASEH2B SINDROME DI
AICARDI-GOUTIERES
GENOTIPO ..FENOTIPO
FENOTIPO ..GENOTIPO
2°es.
Fenotipo mitocondriale?
- Episodi febbrili simil-encefalitici
- Regresso psicomotorio - Tetraparesi spastica
Trusight-One Associata a…
Trusight one Associata a…
NGS => Improvement nella diagnostica
+ Accuratezza/efficienza
NGS => Improvement nella ricerca
Scoperta di nuove mutazioni in geni noti
Scoperta di mutazioni in nuovi geni
NUOVI TARGET
TERAPEUTICI
CONCLUSIONI
Riduzione dei costi
Velocizzare la diagnostica
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Settore Clinico - Enrico Bertini - Daria Diodato - Michela Catteruccia
Settore Istomorfologia
- Adele D’Amico - Margherita Verardo
Settore Enzimologia
- Fiorella Piemonte - Giulia Tozzi
GRUPPO MALATTIE MITOCONDRIALI
- Daniela Verrigni - Alessandra Torraco -Teresa Rizza - Michela Di Nottia - Daria Diodato - Rosalba Carrozzo
Unità di Malattie Muscolari e Neurodegenerative