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ICH
E
METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI
Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano sulla
interazione di radiazione elettromagnetica con la materia
Da tempo sono tra i metodi di rivelazione e quantificazione più
impiegati in Chimica Analitica Clinica
Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su interazioni con specie
molecolari che atomiche
• Assorbimento
• Emissione
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E
METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI
• Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano
sulla interazione di una radiazione elettromagnetica
con la materia
• Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su
interazioni con specie molecolari che atomiche
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E
MECCANISMO DELL’INTERAZIONE
• Assorbimento: la luce viene assorbita da un atomo,
ione o molecola portandoli ad un più alto stato di energia
• Emissione: rilascio di un fotone da parte di un atomo,
ione o molecola portandoli ad un più basso stato di
energia
In funzione del tipo di interazione utilizzato, possiamo
distinguere metodi di assorbimento e di emissione.
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E
LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE (I)
Energia del fotone = h
h = costante di Planck (6,626 x 10-34 J s) = frequenza (s-1)
All’aumentare di la frequenza e l’energia del fotone diminuiscono
= cc = velocità della luce
Unità di più comuni:
nm = 10-9 mÅ = 10-10 m
m = 10-6 m
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LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE (II)
Tipo Lunghezza d’onda Energia Interazione
< 0,1 nm emissione nucleare
raggi X 0,1-10 nm transizioni elettroniche (elettroni interni)
UV 10-380 nm transizioni elettroniche(elettroni di valenza)
Vis 380-800 nm transizioni elettroniche(elettroni di valenza)
IR 800 nm-100 m transizioni vibrazionali
Microonde 100 m- 1 cm transizioni rotazionali
onde radio 1 cm- metri assorbimento nucleare
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E
LO SPETTRO ELETTROMAGNETICO
= c / = c / E = hE = h
Energia
10-14 10-12 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 1 102 104 106 108 1010
1022 1019 1017 1015 1014 1010 106 103 1 10-3
Ultravioletto Visibile Infrarosso
Ra
gg
i c
os
mic
i
Ra
gg
i g
am
ma
Ra
gg
i X
Ult
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tto
Vis
ibil
e
Infr
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Su
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dib
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)
Infr
as
uo
ni
Frequenza [Hz]
Lunghezza d’onda [m]
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E
IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO
Una sostanza assorbe la luce solo quando l’energia della radiazione corrisponde a quella necessaria per far avvenire una transizione
Le transizioni possono essere:
• Elettroniche
• Vibrazionali
• Rotazionali
Le ultime due riguardano solo le molecole
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I C
LIN
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E
Transizioni elettroniche
Provocano modifiche nella distribuzione degli elettroni di un atomo o
di una molecola:
• Molecola (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali molecolari)
* n n*
• Atomo (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali atomici)
IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO
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I C
LIN
ICH
E
TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO ATOMICO
S2
S1
S0
E E
S0 S2
S0 S1
S0 S2 S0 S1
I
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I C
LIN
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E
SPETTRO DI ASSORBIMENTO ATOMICO
Anche con atomi, che è il caso più semplice, si ha un processo di assorbimento relativamente complesso.
L’atomo di idrogeno presenta uno spettro di assorbimento “a righe” complesso dovuto a transizioni elettroniche all’interno dei sottolivelli s,p,d,f
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E
Transizioni vibrazionaliCausano modifiche nella lunghezza di un legame e quindi nella separazione media di due nuclei (IR)
A B A B
Transizioni rotazionaliCausano modifiche dell’energia di una molecola quando essa ruota rispetto al suo centro di gravità (microonde)
A----B A----B
IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO
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E
L’assorbimento della luce da parte delle molecole è un processo molto complesso
• In una molecola ogni livello di energia elettronica è suddiviso in un certo numero di sottolivelli vibrazionali
• In aggiunta ciascun sottolivello vibrazionale è ulteriormente suddiviso in sottolivelli rotazionali
IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO
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IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO
Livelli Elettronici(interazioni UV)
Sotto-livelli Vibrazionali(interazioni IR)
Sotto-livelli Rotazionali(interazioni microonde)
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E
• L’interazione con una molecola e l’assorbimento coinvolgono quindi non solo livelli elettronici, ma anche sotto-livelli vibrazionali e rotazionali.
• Le interazioni con altre molecole avranno anch’esse un effetto, con il risultato che lo spettro di assorbimento sarà a “bande” (ci saranno talmente tante transizioni che sarà impossibile distinguere le une dalle altre).
ASSORBIMENTO MOLECOLARE
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E
TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE
ASSORBIMENTO MOLECOLARE
E
S0
S1
S2
I
Energia dei livelli elettroniciEnergia dei livelli vibrazionaliEnergia dei livelli rotazionali
Transizioni elettroniche
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AZ
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ICH
E
ASSORBIMENTO MOLECOLARE
TRANSIZIONI ELETTRONICHE NELLA FORMALDEIDE
Transizione
n *Transizione
n *(285 nm)
Transizione
*Transizione
*(187 nm)
H
C O
H
H
C O
H
H
C O
H
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I C
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UV/Vis, IR
• La identificazione di un composto si può effettuare sulla base del suo spettro di assorbimento, mediante confronto con lo spettro di un materiale noto o di uno standard di riferimento.
• Ciò viene fatto principalmente con la tecnica IR poiché lo spettro IR contiene più informazioni rispetto a quello UV e Vis.
ANALISI QUALITATIVA
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• L’assorbimento di radiazioni nel UV, Vis e IR copre un ampio range di lunghezze d’onda.
• Eseguendo una scansione, cioè misurando l’assorbimento alle diverse lunghezze d’onda, si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza in esame
SPETTRI UV/Vis, IR
Esempio di spettro di assorbimento molecolare:
Lunghezza d’onda
UV VisibleNear
IRIR
ANALISI QUALITATIVA
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I C
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E
UV/Vis - Transizioni elettroniche
IR - Transizioni vibrazionali (interazioni di legame)
Gli spettri UV e Vis si ottengono con lo stesso strumento
mentre quelli IR, a causa soprattutto dei differenti materiali e
sorgenti necessari, richiedono un altro tipo di
strumentazione.
Le informazioni che si ottengono sono diverse:
ANALISI QUALITATIVA
SPETTRI UV/Vis, IR
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L’occhio umano vede il colore complementare di quello assorbito
COLORE E TRASMISSIONE DELLA LUCE
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ICH
E
ASSORBIMENTO E COLORE COMPLEMENTARE
650-780
595-650
560-595
500-560
490-500
480-490
435-480
380-435
rosso
arancio
giallo-verde
verde
verde-bluastro
blu-verdastro
blu
violetto
blu-verde
blu-verdastro
porpora
rosso-porpora
rosso
arancio
giallo
giallo-verde
Lunghezza d’onda (nm) Colore assorbito Colore complementare
800
700
600
500
400
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I C
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E
La legge fondamentale su cui si basano i metodi di
assorbimento è quella di Lambert e Beer
la quantità di luce assorbita da una soluzione è
funzione della concentrazione della sostanza
assorbente e della lunghezza del cammino ottico
ANALISI QUANTITATIVA
KPdN
dP
P P - dP
dN
P = potenza della radiazione incidente
N = numero di molecole che assorbono nel cammino ottico
K = costante di proporzionalità
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ICH
E
ANALISI QUANTITATIVA
N
0
P
P
dNKP
dP
0
KNP
Pln
0
Poiché N dipende sia dalla concentrazione c che dal
cammino ottico b si ha:
abcP
Plog
0
bc'KKN
a è comunemente definita come “assorbività” ed include anche il termine di conversione dei logaritmi da base e a base 10:
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I C
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E
KNP
Pln
0
abcP
Plog
0
abcP
Plog 0 T= P/P0
abc)Tlog( abcA
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PP
LIC
AZ
ION
I C
LIN
ICH
E
P/P0 è anche denominata
Trasmittanza (T)
-logT = A
dove A viene definita
Assorbanza
A = bc
Il rapporto P/P0 è la misura della luce che passa attraverso la soluzione e non viene assorbita
ANALISI QUANTITATIVA
P0
c
bP
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LIC
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I C
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ICH
E
cbP/PlogP/PlogTlogA 00
LA LEGGE DI LAMBERT E BEER
Concentrazione
Ass
orb
anza
1.5
0.0
0.5
1.0
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ICH
E
EQUAZIONI FONDAMENTALI
abcP
Plog
0
abcP
Plog 0
abc)Tlog(
A)Tlog(
abcA
bcA
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I C
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E
• Ogni strumento presenta caratteristiche diverse quindi è
meglio determinare l’assorbività utilizzando standard
• E’ possibile utilizzare qualsiasi unità di concentrazione:
Molarità, Normalità, ppm, ecc.
• Se la concentrazione viene espressa in Molarità ed il
cammino ottico in cm, l’assorbività viene definita come
assorbività molare () ed ha unità M-1cm-1
DETERMINAZIONE DELLA ASSORBIVITA’
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PP
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I C
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ICH
E Se si ha una piccola variazione di durante le misure e non si è al
valore di max si potrebbe ottenere una notevole variazione nella
risposta
MISURA DELL’ ASSORBANZA
Piccolo errorePiccolo errore
Grande erroreGrande errore
Stessa variazione di lunghezza d’ondaStessa variazione di lunghezza d’onda
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PP
LIC
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MISURA DELL’ ASSORBANZA
La determinazione della concentrazione di una soluzione può
essere effettuata mediante due approcci di base:
1. L’assorbività della sostanza è nota o è stata già
determinata mediante standard
2. Metodo del rapporto: si basa sulla misura dell’assorbanza
di uno standard noto e del campione incognito
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PP
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ICH
E
1:
Una soluzione di Co(H2O)2+ presenta un’assorbanza a 530
nm in una cella di 1.00 cm. Il valore dell’assorbività molare e è 10 Ln-1cm-1.Qual è la sua concentrazione?
A = bc c = A / b
C = 0.20 / 10 x 1 = 0.020 M
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E 2:L’assorbanza di una soluzione di MnO4
- è 0.500 a 525 nm. Una
soluzione 1.0x10-4 M di MnO4- presenta un’assorbanza di 0.200
quando è stata misurata alle stesse condizioni.Determinare la concentrazione della soluzione a concentrazioni non nota. In questo esempio non si conosce la lungehzza della cella, ma
siccome è la stessa per le due misure, non è necessario conoscerla.
nota
x
nota
x
bc
bc
A
A
nota
x
nota
x
c
c
A
A
notanota
xx cA
Ac
Quindi è facile calcolare il valore della concentrazione incognita:
Cx = (0.500/0.200) 1.0x10-4 = 2.5x10-4 MQuesto metodo considera che si lavora nel range lineare.
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Sebbene nella legge di Lambert e Beer compaia l’assorbanza
della soluzione, la grandezza fisica che viene effettivamente
misurata è la trasmittanza.
L’errore nella determinazione di una concentrazione mediante una
misura spettrofotometrica (c) è quindi legato all’errore che si ha
nella misura della trasmittanza (T).
Applicando la legge sulla propagazione degli errori alla legge di
Lambert e Beer si ha:
c/c = (0.4343 / TlogT) T
ERRORE NELLA MISURA DELL’ ASSORBANZA
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ICH
E L’andamento di c/c in funzione di T è il seguente:
Errore relativo in funzione della %TE
rro r
e re
lativ
o s u
co n
c .
80% 20%
%T
ERRORE NELLA MISURA DELL’ ASSORBANZA
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MISURA DELL’ ASSORBANZA
Questa deviazione potrebbe essere dovuta al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità
Questa deviazione potrebbe essere dovuta al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità
Questa deviazione potrebbe essere dovuta ad un auto-assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzione
Questa deviazione potrebbe essere dovuta ad un auto-assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzione
Ambit
o lin
eare
Ambit
o lin
eare
Deviazione dalla relazione lineare
Molte sostanze danno una risposta lineare solo in un certo
intervallo di concentrazione
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Con il termine luminescenza si indicano tutti quei processi (fluorescenza, fosforescenza) che comportano l’emissione di radiazione da parte delle molecole.
La luminescenza può essere indotta da diversi processi, fra i quali l’assorbimento di radiazione. In tal caso si parla di fluorescenza e fosforescenza, che si verificano ad una energia inferiore a quella alla quale la radiazione viene assorbita, e lo spettro di emissione è approssimativamente l’immagine speculare di quello di assorbimento.
Int e
nsit à
di e
mi s
sion
e
( M-1cm
-1)
assorbimento emissione
SPETTROFLUORIMETRIA-LUMINESCENZA
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E’ possibile dimostrare che, quando l’assorbanza della soluzione è sufficientemente bassa (A 0,05) esiste una proporzionalità diretta fra l’intensità dell’emissione PF e la concentrazione:
dove P0 è la potenza della radiazione incidente e k è una costante che contiene, fra l’altro, il valore della resa quantica di emissione dell’analita
Le misure di emissione non sono misure assolute:Per effettuare misure quantitative è quindi indispensabile utilizzare una curva di calibrazione
ckPPF 0
concentrazione
PF
A 0,05
ASPETTI QUANTITATIVI
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SPETTROFLUORIMETRIA vs. SPETTROFOTOMETRIA
Spettrofotometria Spettrofluorimetria
Applicabilità Ampia Ristretta(relativamente poche sostanze
emettono)
Intervallo di linearità Ampio Ristretto
Sensibilità (oppure Media Elevatalimite di rivelazione) (è possibile utilizzare rivelatori più
sensibili o aumentare P0)
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BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA
• La luminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica
nell’UV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della
transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello
energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale
• La chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui
l’energia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una
reazione chimica
• La bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel
visibile che si verifica in organismi viventi
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Si parla di chemiluminescenza quando l’emissione non è indotta da assorbimento di radiazione ma da una reazione chimica. Il numero di analiti naturalmente luminescenti è relativamente ristretto.
In molti casi è però possibile rendere luminescenti analiti non emittenti mediante derivatizzazione, ovvero attraverso una reazione chimica indicatrice che comporta il legame dell’analita ad una specie luminescente.
APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA
A + B C* C + h
C
NH
NH
C
NH2 O
O
O2/OH-
NH2
COO-
COO-
+ h + N2 + H2O
- Luminol (used to detect blood)
- phenyl oxalate ester (glow sticks)
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Luciferin + O2
LuciferaseO C
O O
C R2
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SpontaneousCO2 + O C*
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Light
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Luciferin (firefly)
“Glowing” PlantsLuciferase gene cloned into plants
Bioluminescenza
APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA
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STRUMENTAZIONE PER SPETTROFOTOMETRIA
• I componenti principali della strumentazione UV/Vis e IR sono simili, indipendentemente dalla radiazione che deve essere misurata
• Ogni strumento comprenderà i seguenti componenti:
sorgente di luce cella per il campione selettore di lunghezza d’onda rivelatore
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STRUMENTAZIONE
Schema a blocchi di un tipico spettrofotometro UV/ Vis per assorbanza
rispostaCampioneSorgenteSelettore
di Rivelatore
Chemiluminometro
Nelle misure di luminescenza l’emissione di
radiazione da parte del campione è ottenuta o
mediante eccitazione del campione stesso con
radiazione di un’opportuna lunghezza d’onda o
per reazione chimica
risposta
Sorgente
Selettore di
RivelatoreSelettore di Campione
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CONTENITORI PER IL CAMPIONE (CUVETTE)
• Devono essere trasparenti a tutte le che si utilizzano • Devono essere di geometria (cammino ottico) definita
Quelle più comunemente utilizzate per analisi quantitative sono
parallelepipedi con cammino ottico di 1 cm
Intervallo di trasparenza: Silice
150-3000 nm Vetro
375-2000 nm Plastica
380-800 nm
quarzo o silice fusa
vetro o plastica
KBr, NaCl
UV Visibile IR
Cuvette standarda) volume complessivo 2-3 ml b) volume complessivo 0,2-1 ml
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RIVELATORI
• In questi rivelatori la radiazione colpisce
un catodo iniziale, provocando
l’emissione di elettroni: effetto
fotoelettrico
• Gli elettroni prodotti vengono moltiplicati
attraverso la collisione con una serie di
catodi intermedi
• La corrente misurata è così amplificata,
rispetto a quella iniziale, di un fattore
molto elevato (106 – 107)
anodo
catodo
catodiintermedi
Fotomoltiplicatori (PM)
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SPETTROFOTOMETRO A SINGOLO RAGGIO
monocromatore
fenditura di ingresso
fenditura di uscita
cella porta campione
rivelatore
sorgente
elemento disperdente (prisma/reticolo)
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RIVELATORI
Rivelatori a stato solido: fotodiodo
• Quando si applica un opportuno potenziale ad un cristallo di Si drogato si ottengono due aree:
• In condizioni di riposo non si ha passaggio di corrente
regione p regione n
n - ricche di elettroni p - ricche di cariche positive
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RIVELATORI
Rivelatori a stato solido: fotodiodo
• Quando il fotodiodo viene esposto alla luce, la radiazione
incidente produce nuove coppie di cariche positive e negative
all’interno del materiale, permettendo il passaggio della corrente.
• L’intensità di corrente è
proporzionale alla quantità
di luce incidente.
• Un fotodiodo costa meno
di un fotomoltiplicatore.
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RIVELATORI
Array di fotodiodi
• E’ costituito da una serie di fotodiodi, ricavati ad intervalli
di spazio regolari su di un microchip. Ciascuno fotodiodo
risponde ad una data lunghezza d’onda
• Inserito in uno strumento con una ottica opportuna, questo
tipo di rivelatore permette di misurare simultaneamente
radiazioni di diverse lunghezze d’onda
reticolo
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SPETTROFOTOMETRO A SINGOLO RAGGIO A SERIE DI DIODI
reticolo
lampada adeuterio
fenditura
cella porta campione
otturatore
lampada atungsteno
rivelatore a serie di diodi
lente
lente
• Questi strumenti sono in grado di effettuare la misura in un tempo brevissimo (anche meno
di un secondo), permettendo quindi di studiare anche variazioni spettrali che
avvengono in tempi molto brevi.
• Possiedono però certe limitazioni: ad esempio, la risoluzione è limitata dal numero degli
elementi del rivelatore a serie di fotodiodi, e di solito non è minore di 0,5-1 m.
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SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO
• Uno spettrofotometro a doppio raggio misura
contemporaneamente l’assorbimento della
radiazione da parte del campione e del riferimento
• Il rapporto fra queste due grandezze rappresenta
l’assorbimento dovuto all’analita, ed è indipendente
da tutte le altre variabili legate alla variazione della
lunghezza d’onda
• Esistono due tipi di spettrofotometri a doppio raggio:
spettrofotometri a doppio raggio nel tempo
spettrofotometri a doppio raggio nello spazio
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SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NEL TEMPO
chopper
sorgente
monocromatore
fenditura diingresso
fendituradi uscita
campione
rivelatore
elementodisperdente
riferimento
• Uno spettrofotometro a doppio raggio nel tempo utilizza un “chopper” (di solito
uno specchio rotante) per inviare alternativamente la radiazione attraverso il
campione ed attraverso il riferimento
• La radiazione alternativamente trasmessa da campione e riferimento viene poi
misurata da un unico rivelatore
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SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NELLO SPAZIO
• Esistono limitazioni applicative per gli spettrofotometri a doppio raggio
nel tempo: ad esempio non è possibile misurare correttamente
variazioni di assorbanza che avvengono a velocità confrontabili o
maggiori di quella di rotazione del chopper. Non è quindi possibile
effettuare studi cinetici che coinvolgono reazioni veloci
• In uno strumento a doppio raggio nello spazio il fascio di radiazione
viene diviso in due parti mediante uno specchio fisso, ed i due fasci
vengono inviati rispettivamente sul campione e sul riferimento
• Non esistono parti mobili, ed è possibile studiare anche processi
molto veloci
• Sono però necessari due rivelatori distinti, che devono possedere
caratteristiche simili
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SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NELLO SPAZIO
specchio divisoredi fasciosorgente
monocromatore
fenditura diingresso
fendituradi uscita
campione
rivelatoreelementodisperdente riferimento
rivelatore
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CRITERI DI SCELTA DI UN METODO COLORIMETRICO
• Specificità della reazione• Campo di proporzionalità A/[C]• Stabilità del colore• Riproducibilità• Limpidità della soluzione• Sensibilità • Convenienza (tempo/costo)
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METODI DI DOSAGGIO DELLE PROTEINE
• Assorbimento diretto a 280 nm• Kjeldahl (idrolisi e det. dell’azoto)• Biureto (reattivo al rame)• Lowry (rame + reattivo di Folin)• Bradford (Coomassie Blu)• (Fluorescamina)
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DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
Cromofori di una proteina:legame peptidicoTyr max a 276 nmTrp max a 280 nmPhe max a 256-260 nm (poco)
ci si riferisceall’ aminoacido libero
Metodo gravimetrico (pesata)Bisogna avere molto campione a disposizione ed allo stato puro altrimenti l’errore può essere molto elevato.Ha siti che possono reagire con altri gruppi, molecole,...
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Cromofori nelle proteineCromofori nelle proteine
Il legame peptidico (210
nm)
Ponte disolfuro(250 nm)
Centrato a 280 nm
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
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DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
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Metodo diretto E’ necessario avere a disposizione molta proteina (metodo assoluto).A 280 nm qual è il contributo di ciascun aa all’Assorbanza totale? Phe Tyr Trp cambia da proteina a proteinaNon c’è solo un problema di composizione ma di interazione fra anelli aromatici diversiSe ci sono più Tyr non è dato dalla somma, dipende dalla posizione che occupano sulla catena.
Metodo indiretto Ad es. Bradford sono metodi relativi Blu di Comassie legato alla proteina è blu se non è legato è marroncino. A 595 nm si misura l’Assorbanza del complesso PD e non D.
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
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E METODI INDIRETTIMETODI INDIRETTI
Molto spesso non è importante sapere la quantità assoluta,ma avere un metodo riproducibile che sia sensibile e che permettadi valutare la quantità in maniera relativa (avendo a disposizione uno standard).Blu di Comassie si lega alle proteine, ma a tutte in egual misura?
P + C PC
L’equilibrio deve essere tutto spostato a destraDeve essere completa, bisogna usare cioè un largo eccesso di colorante.
Riassumendo:1) la quantità che si lega deve essere la stessa per tutte le proteine;2) la reazione deve essere completa;3) il colorante libero non deve assorbire.
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
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EMetodo di Lowry Metodo di Lowry sensibilità: qtà inferiori a 10 g/mlQuando si mescola alla soluzione proteica il reagente di Folin (tungstato, molibdato e fosfato di sodio) ed una soluzione di solfato di rame si sviluppa un colore blu-porpora che può essereletto a 600 nm. Tris e tamponi zwitterionici (PIPES, HEPES) interferiscono. Il colore sviluppato dipende dal contenuto di tirosina e triptofano.
Reaction schematic for the Modified Lowry Protein Assay.
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
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E Metodi dell’acido bicinconinico (BCA).
Simile al Lowry, dipende dalla conversione di Cu++ in Cu+ in condizioni alcaline che viene poi rilevato mediante reazione con il BCA per ottenere un color porpora letto a 562 nm. E’più sensibile rispetto al Lowry (qtà inferiori a 0.5g/ml) e più tollerante per la presenza di altri composti.
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
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E Bradford Protein AssayBradford Protein Assay
The Bradford assay is a protein determination method that involves the binding of Coomassie Brilliant Blue G-250 dye to proteins.
The dye exists in three forms: cationic(red), neutral (green), and anionic (blue).
Under acidic conditions, the dye is predominantly in the doubly protonated redcationic form (Amax = 470 nm). However, when the dye binds to protein, it is converted to a stable unprotonated blue form (Amax = 595 nm).
It is this blue protein-dye form that is detected at 595 nm in theassay using a spectrophotometer or microplate reader.
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
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Work with synthetic polyamino acids indicates that Coomassie Brilliant Blue G-250 dye binds primarily to basic (especially arginine) and aromatic amino acid residues.
The extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is constant over a 10-fold concentration range. Thus, Beer's law may be applied for quantitation of protein.
Certain chemical-protein and chemical-dye interactions interfere with the assay. Interference from non-protein compounds is due to their ability to shift the equilibrium levels of the dye among the three colored species.
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
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Metodo di Bradford
Tietz
max = 595 nm
Tietz
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Selezione della proteina standard
La proteina ideale da usare come standard è la forma assolutamente pura della proteina da dosare. In assenza di tale proteina si può usare un’altra proteina come standard relativo. Il miglior standard relativo deve dare una colorazione simile a quella della proteina da saggiare. Le proteine più usate come standars sono il BSA e la gamma-globulina
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
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NH2
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Creatina
NH
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CH3
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Creatinina Picrato
NO2 NO2
NO2
O-
NO2 NO2
NO2
O-
APPLICAZIONI CLINICHE: SPETTROFOTOMETRIA DIRETTA
+ H2O
- H2O
+
La creatinina è il prodotto di eliminazione per via renale della creatina: il tasso di creatinina è quindi un indice della funzionalità renale
Possibili interferenze con composti chetonici, glucosio, proteine
Complessogiallo
=520 nm
Reazione di Jaffe
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NHNH
N HNH
O
O
METODI SPETTROFOTOMETRICI DIRETTI
NH C NH 2
O
NH
O
NH
Ouricasi
Determinazione dell’acido urico nel siero
3. L’allantoina non assorbe a 290 nm quindi la concentrazione dell’acido urico si ottiene per differenza
b
Ac
1. Misura di assorbanza a 290 nm: assorbono altri costituenti
2. Aggiunta di uricasi: decomposizione del solo acido urico
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SPETTROFOTOMETRIA INDIRETTA
I metodi spettrofotometrici indiretti fanno uso di reazioni enzimatiche
Questi metodi coprono dal 50% al 70% delle analisi di un laboratorio clinico
Sono molto sensibili perché sfruttano come risposta il turn-over del substrato
Sono basati su reazioni primarie e reazioni indicatrici
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NOCH3
CH3 NH2
N
NOCH3
CH3 N
O
H2O2 + +HRP
Reazione indicatrice
fenolo
4-amminofenazoneReattivo di Trinder
Composto chinoiderosso-aranciomax=510 nm
SPETTROFOTOMETRIA INDIRETTA
Determinazione del Glucosio con Glucosio Ossidasi (GOD)
Reazione primaria
C6H12O6 + H2O + O2 Acido gluconico + H2O2
GOD
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TEST OTTICO DI WARBURG
N+
R
NH2
O
NR
NH2
O
..+ H+ + 2e- + H+
200 400
lunghezza d'onda (nm)
Ass
orb
anza
NAD
NADH
260 340
NAD NADH
E’ la reazione indicatricepiu’ impiegata in spettrofotometriaindiretta per applicazioni cliniche:Massimi di assorbanza separati permettono misure cinetiche
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DENATURAZIONE DEL DNA