Genetica molecolare dell’autismo
La ricerca dei fattori genetici di rischio
W W W.FISIOKINESITERAPIA.BIZ
Autismo infantilecaratterizzato da sintomi in 3 diverse aree:1. compromissione della comunicazione verbale e non
verbale2. problemi nell’interazione sociale3. attività, modalità di comportamento ed interessi
ristretti, ripetitivi e stereotipati» I sintomi insorgono nella prima infanzia (entro i 3 anni) e
perdurano per tutta la vita
Parte di uno spettro più ampio di disturbi fra cui la Sindrome di Asperger e altri Disturbi Generalizzati delloSviluppo (PDD)
Prevalenza nella popolazione• ~ 5/10000 ->stima generalmente riportata • Studi recenti hanno indicato una prevalenza più alta:
• 1-3/1000 definizione stringente di autismo• 6/1000 disturbi dello spettro autistico
La prevalenza dell’autismo sta aumentando?Cambiamento graduale nei criteri diagnostici e negli strumenti diagnosticiMaggiore conoscenza del disturbo
Rapporto maschi/femmine ~ 3-4:1Ritardo mentale presente in ~ 75%
Fattori genetici
La prima descrizione risale a L.Kanner (1943)L’importanza di fattori genetici alla base dell’autismo non venne riconosciuta fino alla metà anni ‘70
»Assenza di trasmissione verticale»Basso tasso di autismo nei fratelli di individui affetti (≈ 3%)
Importanza di fattori genetici:
STUDI DI RICORRENZA FAMILIARE: RISCHIO RELATIVO λREsprime il grado di aggregazione familiare di un carattere
λs = rischio nei fratelli/sorelle di un affettorischio nella popolazione generale
CONCORDANZA IN GEMELLI MONOZIGOTICI/DIZIGOTICIPermettono di stabilire se l’aggregazione familiare e’ dovuta all’ambiente familiare in comuneoppure a fattori geneticiMZ = 100% geni in comuneDZ = 50% geni in comuneUna maggiore concordanza in gemelli MZ e’ indice di fattori genetici. Tuttavia:
• Tendenza a trattare i gemelli MZ in modo piu’ simile dei DZ• Differenze genetiche fra gemelli MZ (geni sistema immunitario, mutazioni somatiche,
pattern inattivazione X)
STUDIO DI INDIVIDUI ADOTTATIAltro metodo per individuare il contributo di fattori ambientali ed effetti genetici
Studi di gemelli
•grossa disparità fra i tassi di concordanza dei gem. MZ e DZ: importanza di fattori genetici
•Concordanza molto bassa nei DZ: azione epistatica di più geni
•Concordanza per un più ampio spettro di disturbi socio-cognitivi in forma meno grave che nell’autismo: “broader phenotype”
•Eterogeneità clinica
Bailey et al, 1995
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
MZ (n=25) DZ (n=20)
Con
cord
ance
rate
Cognitive disorder
Social disorder
Social and cognitivedisorderAutism
(same sex)
Studi di ricorrenza familiare
•Frequenza nei fratelli di probandi ≈ 3% (~ 6% per PDD)
•Maggiore rischio di ricorrenza rispetto alla prevalenza nella popolazione
• λs = 10-50•“broader phenotype”•Relazione diretta fra gravitàdell’autismo e broader phenotype nei familiari
Bolton et al, 1994
0
5
10
15
20
25
AUTISM DOWN'S
% in
sib
lings
of p
roba
nd
Any one of three keyaereasAny two of the three keyareasCommunication and socialdeficitAsperger's/PDD
Autism
Studi epidemiologici: conclusioni
• Forte componente genetica • La predisposizione genetica si estende oltre la
diagnosi classica di autismo, includendo il broader phenotype
• Escluso modello Mendeliano monogenico• L’autismo è un disturbo genetico multifattoriale,
cioè non riconducibile a mutazioni di un singolo gene, ma dovuto all’azione di varianti in più geni e all’interzione e con l’ambiente
Mutazioni e polimorfismiactcgggctaaactttcggggcccaaactacgactagctagctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc
actcgggctaaactttcggggccTaaactacgactagctagctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc
actcgAgctaaactttcggggcccaaactacgactagctaCctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc
Polimorfismi varianti di 1 tratto di DNA presenti nella popolazione con frequenze non trascurabili (>1%). In genere non patogeniche
DNA
proteina
Mutazioni varianti rare di 1 tratto di DNA che hanno un effetto sul fenotipo
STOP
Caratteri genetici complessi
SUSCEPTIBILITY ALLELES
Numero di Fattori di RischioFr
eque
nza
Valore soglia
•Il carattere è influenzato da un certo numero di fattori di rischio•Individualmente ciascun fatt. di rischio ha un effetto moderato. La piena manifestazione del carattere è la risultante dell’azione combinata dei vari fattori di rischio
Caratteri genetici complessi
EterogeneitàA B C
Fenotipo
Patologie geneticheSclerosi tuberosaSindrome X-Fragile
Anomalie cromosomiche15q11-q13
1-3 %Duplicazioni interstiziali o [inv-dup 15] Ereditate per via materna
Associazione con condizioni genetiche conosciute
Non sappiamo ancora quanti siano i geni implicati nell’autismo e come questi interagiscano fra di loro e con altri fattori non genetici.
Solo in una minoranza dei casi (<10%) l’autismo è riconducibile ad una causa nota:
Fattori ambientali
Fattori di rischio prenatali» Esposizione in utero a talidomide o acido valproico» Infezione da virus rosolia
Fattori di rischio ambientali» Infezioni (cytomegalovirus, herpes)» Mercurio» Fattori nutrizionali» Vaccino trivalente (MMR)
Come identificare i geni?
• Screening dell’intero genoma umano analizzando un elevato numero di famiglie con almeno 2 individui affetti (multiplex) con metodi di LINKAGE non parametrici
• ASSOCIAZIONE ALLELICA (linkage disequilibrium mapping)
• Geni CANDIDATI
• Anomalie citogenetiche
Analisi di LINKAGE “tradizionale”(Metodi “parametrici” )
D1
+1
+2
+2
D1
+2
+3
+4
D2
+4
+2
+4
+1
+3
D1
+3
NR R RNR
• Dipende dalla specificazione di un modello di ereditarietà• Si contano gli eventi di ricombinazione fra due loci• Test: frazione di ricombinazione (θ) < 0.5
A,C B,D A,C E,G F,G F,H
A,B C,D E,F G,H
A,D A,H E,D
A,E D,H
Metodi di linkage ‘Non-parametrici’
2 alleli in comune
25%
40%
1 allele in comune
50%
55%
0 alleli in comune
25%
5%
Regione qualsiasi
Regione vicina ad un gene di “suscettibilità”
Si basano sulla condivisione di alleli di un marcatore da parte di individui affetti all’interno di una stessa famiglia
Famiglie con almeno 2 fratelli affetti
IMGSAC: International Molecular Genetic Study of Autism Consortium
Gran Bretagna, Olanda, Danimarca, Germania, Francia, Italia, U.S.A.Raccolta di >200 famiglie con almeno 2 fratelli (o altro tipo di parenti) affettiStrategia scelta: screening genomico con metodi non-parametriciIncertezza su quanto allargare i confini diagnostici del fenotipo -> criteri di inclusione stringenti
IMGSAC Genome scan / 152 sib-pairs
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
Chromosome number
D2S
2188
D7S
477
D16
S310
2
HTT
INT2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X
Chromosome 2
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Morgans
markersall sib-pairs (n=152)strict criteria only(n=127)
Problemi negli studi di linkage di malattie complesse
• Difficile stabilire la soglia di significativitàMLS > 3.6?
• Replicazione indipendente dei risultati positiviPer replicare un risultato positivo è necessario un campione di famiglie di dimensioni molto maggiori rispetto al campione originario
• Picchi di linkage molto larghi ed imprecisi rispetto alla posizione del locus malattia
Summary of genome screen results
Chr cM MLS cM MLS cM MLS cM HLOD cM NPL/GH cM MLS cM MLS cM HLOD1p 149 2.15 149 2.632q 206 3.74 192 0.64 192 2.39 * 198 1.303p 36 1.513q 190 4.315q 45 2.55(B)6q 109 2.237p 42 1.017q 104 2.27q 120 3.20 125 0.83 138 0.93 150 0.8 128 1.7 123 1.02* 170 3.04(B)7q 165 2.13*8q 1.66(B)13q 55 0.68 55 3.0015q 32 1.1 32 0.5416p 23 2.93 21 0.74 20 1.9117p 11 1.2117q 45 2.34 117 2.16(B)18q 94 0.62 100 1.0019q 41 1.37 59 1.2 52 2.4622qXq 60 2.5 82 2.67 52 1.89
cM: position in Kosambi centiMorgans based on the Genethon linkage map; * results from follow-up studies
FINLAND(Auranen etal
2002)(Barrett et
al 1999)(Buxbaum et
al2001)(Shao et al 2002)
(Liu et al 2001)
CLSA M.SINAI DUKE AGREIMGSAC PARIS STANFORD
2001(Philippe 1999)
(Risch etal 1999)
Convergenza dei risultati di linkage sul crom. 7
The shaded bars represent the linkage findings of different research groups.
Dagli studi di linkage all’identificazione dei geni di suscettibiltà…E’ probabile la presenza di fattori genetici di rischio per l’autismo sui cromosomi 2, 7, 16, 17, 15, …
Esame più in dettaglio delle regioni cromosomiche identificate:sono molto ampie e contengono centinaia di geni: ciascuno di essi potrebbe essere ilresponsabile
Aumentare il numero di famiglie studiateAnalisi combinata dei dati di diversi gruppi di ricerca
Studio di individui affetti con anomalie cromosomiche che coinvolgono queste regioni
Studio di geni candidatiStudi di associazione allelica / Linkage disequilibrium
mapping
Studi di associazione allelica
Casi-controlli
Studio se un particolare allele è piùfrequente nei casi rispetto ai controlli, scelti dalla stessa popolazione
Alleli dei genitori:Trasmessi -> A CNon trasmessi -> B D
A B C D
A C
Transmission Disequilibrium TestTDT
Studio se un particolare allele ètrasmesso dai genitori al figlio affetto più frequentemente del 50%
Cause di associazione allelica1. Effetto diretto della variante
genetica sul fenotipo
2. Linkage disequilibrium(dovuto alla vicinanza di due loci sul cromosoma)
3. Associazioni “spurie” dovute a diversi eventi: per es. presenza di stratificazione nella popolazione
Linkage Associazione
marcatore
Allele di suscettibilità
Linkage Disequilibrium
LD = associazione non casuale degli alleli appartenenti a due loci vicini fra loro sul cromosoma
A
B
a
b
A
b
a
B
D = f(AB) - f(A) x f(B) D’ = |D | Dmax
Linkage Disequilibrium
NF1E1D1C1B1A1
G1H1I1J1K1
Mutazione N -> D
DF1E1D1C1B1A1
G1H1I1J1K1
DF1E1D1C2B2A2
G1H1I2J2K2
DF1E1D1C1B1A1
G1H1I1J1K1
10generaz.
90generaz.
In una popolazione il LD decresce in funzione del num di generazioni (t) e della frazione di ricombinazione (r) Pattern di LD lungo il genoma è variabile e complesso e influenzato da un insieme di fattori demografici, molecolari ed evolutivi. Ancora oggetto di studio
Geni candidatiGeni candidati
Che tipo di geni possono essere coinvolti nell’autismo?Geni che sono attivi nel cervelloGeni coinvolti nello sviluppo del cervello, nella migrazione neuronale, nel metabolismo dei neurotrasmettitori…
Attualmente diversi gruppi di ricerca stanno esaminando alcuni di questi geni per identificare varianti della sequenza di DNA che costituiscanodei fattori di rischio per l’autismo
METODO:•Screening di varianti di sequenza in individui affetti (DHPLC)•Test delle varianti identificate:
•Casi-controlli•TDT
DHPLC
DNA sample is heated and cooled, but by cooling slowly under optimal hybridization conditions, bothhomoduplex and heteroduplex PCR products will form. The sample is then run through a high permformance liquid chromatography (HPLC) system, and OD260 peaks are resolved as they are elutedfrom the column under gradient conditions.
Geni candidati analizzati da IMGSACA. NEURONAL DEVELOPMENT C. BRAIN INVOLVEMENTChromosome 2 Chromosome 2CAMP-GEFII cAMP-regulated guanine nucleotide
exchange factorCHN1 Chimerin 1
HOXD1 Homeo box D1 GAD1 Glutamate decarboxylase 1 (brain, 67kDa)Chromosome 7 Chromosome 7NCAM Neuronal cell adhesion molecule CHRM2 Cholinergic receptor, muscarinic 2RELN Reelin COPG2 Coatamer protein complex, subunit gamma 2VGF Nerve growth factor inducible SRPK2 Serine/Arginine rich protein kinase 2LAMB1 Laminin beta-1 chain precursor SYPL Synaptophysin-like proteinLRNN1 Leucine-rich repeat protein, neuronal 1 GRM8 Glutamate receptor, metabotropic 8
PTPRZ1 Protein tyrosine phosphatase receptor-type Z, polypeptide 1
KCND2 Potassium voltage-gated channel, Shal-related subfamily, member 2
WNT2 & WNT16 Wingless-type MMTV integration site family members 2 and 16 Chromosome 16
A2BP1 Ataxin 2-binding protein
B. TRANSCRIPTION FACTORS ABAT 4-Aminobutyrate aminotransferase
Chromosome 2 CREBBP CREB binding protein ATF2 Activating transcription factor 2 GRIN2A Glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-
aspartate 2ADLX1 & DLX2 Distal-less homeobox genes 1 & 2 KIAA1243 KIAA1243 proteinNEUROD1 Neurogenic differentiation 1 D. HOUSEKEEPINGTBR1 T-box, brain, 1 Chromosome 2Chromosome 7 FRZB Frizzled-related proteinCUTL1 Cut-like 1 CED-6 CED-6 proteinDLX5 & DLX6 Distal-less homeobox genes 5 & 6 Chromosome 7FOXP2 Forkhead box P2 CPA1 & CPA5 Carboxypeptidase isoform 1 & 5Chromosome 16 MEST Mesoderm specific transcript homologTBX6 T-box 6 Chromosome 16UBN1 Ubinuclein 1 BFAR Bifunctional apoptosis regulator
EMP2 Epithelial membrane protein 2SSTR5 Somatostatin receptor 5
ReelinRuolo fondamentale nella regolazione della migrazione di diversi tipi di neuroni durante lo sviluppo del cervello. Espressa anche nel cervello adulto, dove puo’ avere un ruolo nella plasticità sinaptica
Topi reeler (reln-/reln-):sintomi neurologici (atassia, tremore) ealterazioni citoarchitettoniche in diverse aree del cervello (corteccia, ippocampo e cervelletto) simili a quelle descritti in studi post-mortem di indiv. autisticiTopi eterozigoti reeler (reln-/+): deficit in alcuni test comportamentali; ridotta densità spine dendridiche, deficit di GAD67, riduzione post-natale del num di cell Purkinje solo nei maschi Nell’uomo: mutazioni recessive causano lissencefalia
Reelin
I II III IV V VI VII VIIIF-spondin-like charged C-terminus
Reelin domain
5’UTR 3’UTR
AAAAAA m RNA
(GGC)n
IMGSAC families (Bonora et al, Mol Psych 2003)Ex 25 N1159KEx 35 V1762I Ex 35 V1762I Ex 44 R2290H Ex 51 T2718A
Ex25 Ex35 Ex44 Ex51
protein
Trinucleotide (GGC): trasmissione preferenziale degli alleli ‘lunghi’(Persico et al, 2001)
The search for susceptibility genes…
Conclusioni e prospettive
L’identificazione di fattori genetici di rischio:• Permetterà di comprendere i meccanismi patofisiologici alla base dei disturbi dello
spettro autistico e dei fattori che ne influenzano l’espressività.• Permetterà l’identificazione di target per interventi farmacologici• Costiturà la base per lo sviluppo di nuovi approcci di diagnosi ed intervento, e
forse anche di prevenzione e cura.
Progressi nell’identificazione di regioni cromosomiche dove sono probabilmente localizzati fattori genetici di rischio per i disturbi dello spettro autisticoLa complessità genetica ha reso difficile l’identificazione di geni. Fino ad oggi, un significativo coinvolgimento nell’autismo non è stato ancoradimostrato per nessun gene
•Meta-analisi•Studio del ‘broader phenotype’ nei parenti di individui affetti
Acknowledgements
Wellcome Trust Centre forHuman Genetics - Oxford
Janine LambGabrielle CookeElena BonoraAngela MarlowAnthony Monaco
Dipartimento di Biologia Evol. Sper.Bologna
Francesca BlasiElena BacchelliElena Maestrini
THE INTERNATIONAL MOLECULAR GENETIC STUDY OF AUTISMCONSORTIUM
http://www.well.ox.ac.uk/~maestrin/iat.html
Department of Psychiatry, University of OxfordAnthony Bailey