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Epidemiologia
In Natura si distingue:
Vita saprofita: nell’ambiente a spese di materiale inanimato
Vita parassitaria: a carico di organismi superiori
Parassiti
Obbligati Facoltativi
(Maggioranza dei batteri)
(Minoranza)
1
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Parassiti
Rapporti tra batteri e ospite:Commensali (indifferenti)Simbionti (utili)Opportunisti (talvolta possono dare malattia)Patogeni (nocivi) (moltiplicazione in vivo e tossigenicità)
2
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3
Popolazione microbica normale
Esistono due gruppi di PMN: residente transito 1) Competizione con nutrienti (interferenza) 2) Competizione con i recettori sulle cellule (tropismo) 3) Produzione di batteriocine 4) Produzione di acidi grassi o altri metaboliti
(anaerobi) 5) Continua stimolazione del sistema immune
(macrofagi) 6) Stimolazione di fattori immuni protettivi (Ig)
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4
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Microrganismi acquisiti dalla nascita subiscono modifiche in numero e specie lungo tutto il decorso della vitaDipendono da•fattori genetici•abitudini alimentari e igieniche •situazioni di stress •fenomeni psicosomatici •età
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5
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Residenti, o popolazione microbica normalerappresentano circa l’1% del peso corporeo.10 volte il numero totale delle cellule somatiche Intestino: più di 500 (1000) specie diverse di batteri molte delle quali non coltivabili con le metodiche tradizionali Si stima che circa il 60% del materiale fecale sia costituito da batteri.
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PMN
CuteCavità orale e prime vie aereeTratto intestinaleUretraVaginaOcchio
6
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PMN Cute
PM transitoriaPieghe cutaneeSecrezioni sebaceeSudorazione e lavaggiDisinfezioneMedicazioni occlusive
7
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PMN cavità orale
Sterile alla nascita4-12 ore dopo si stabiliscono i viridanti (madre)Seguono stafilococchi, anaerobi, neisserie, moraxelle, difteroidi.Eruzione dei denti: spirochete anaerobie, prevotelle, fusobatteri, capnocytophagaActinomyces tonsille e gengive degli adultiMiceti: Candida
8
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PMN vie respiratorie
Faringe e trachea
simili
alla cavità oraleBronchi
pochi batteri
Bronchioli e alveoli sterili
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PMN vie respiratorie
10
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
La popolazione microbica dell’apparato gastro-enterico è
stata definita come "un insieme di microrganismi presenti nel lume
intestinale i quali, se convivono in un determinato equilibrio
contribuiscono allo stato di salute dell'ospite"
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Nello stomaco vi è un alto grado di acidità e il numero dei
microrganismi non supera le mille unità, mentre nell'ileo la
concentrazione aumenta arrivando nel colon a 1011-1012
batteri per g
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PMN intestinale
Duodeno: 103-106/grDigiuno-ileo: 105-108/grCieco-colon trasverso: 108-1010/grSigma-retto: 1011/gr
antibiotici
pHacido
basico
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Anche il numero e il tipo di specie di microorganismi
varia con il variare del sito anatomico
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PMN intestinale
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Portano milioni di geni (5), un numero di gran lunga superiore ai 20.000 stimati del genoma umano. Una gran varietà di composti che possono essere metabolizzati (è un organo aggiunto, bioreattore)Quando varia, si modifica anche l'assorbimento dei nutrienti Obesi e magri hanno profili batterici radicalmente diversi nei loro intestini
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
La degradazione nell’intestino crasso, in particolar modo della
lignina e della cellulosa, è incompleta portando a particelle di fibre vegetali che persistono fino all’intestino distale dove
possono esercitare un ruolo che favorisce il processo di eliminazione delle feci
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
E’ importante il ruolo dei batteri intestinali nella sintesi e nell'utilizzo delle vitamine.B1, B2, B6, B12, PP, H, acido pantotenico e acido folico. La vitamina K viene sintetizzata dall'Eucobacterium lentum che modifica degli steroidi a livello intestinaleI germi intestinali interagiscono con gli acidi biliari.
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Gli acidi biliari derivano dal metabolismo del colesterolo nel fegato, coniugati con glicina ed eliminati con la bile.
Il metabolismo degli ormoni steroidei (androgeni, estrogeni e corticosteroidi) avviene nel lume intestinale attraverso varie reazioni chimiche
Gli ormoni steroidei vengono modificati a livello del fegato ed escreti con la bile. Nell'intestino verranno deconiugati e sottoposti alle modificazioni enzimatiche per poi ritornare al fegato attraverso la vena porta.
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POPOLAZIONE MICROBICA INTESTINALE
A questo livello vi è una barriera protettiva costituita da uno strato di
muco denso che contiene IgA secretorie, peptidi antimicrobici e anche complessi giunzionali che tengono unite le cellule epiteliali adiacenti in modo da regolare la
permeabilità del tessuto intestinale e impedire che i microrganismi lascino
questa sede
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Gli enterociti esprimono recettori PAMP (pathogen-associated molecular pattern), comprese le proteine denominate TLR e NOD. Questi recettori captano la presenza di componenti batterici presenti e conservati in diverse specie microbiche e possono dare inizio ad una cascata pro infiammatoria per la difesa. I batteri possono presentare sulla superficie esterna delle strutture che sono individuate dalle cellule epiteliali e dalle cellule del sistema immunitario
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The commensal microbiota, intestinal epithelial cells, and intestinal immune cells engage in a complex crosstalk. Epithelial cells, M cells, and dendritic cells (DCs) can directly sense and sample the intestinal contents and communicate information about the microbiota to other subsets of immune cells. Toll-like receptors, expressed by epithelial cells, M cells and DCs, and NOD-like receptors, are classes of microbe-sensing molecules. Cytokines, chemokines, and host and microbial metabolites are key molecular mediators of intestinal homeostasis that influence responses of both host and microbe. l
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PMN vagina
Alla nascita pH acido: lattobacilliDopo alcune settimane fino a pubertà pH neutro: PMN mista cocchi e bacilliPubertà pH acido: lattobacilliDopo la menopausa pH neutro: PMN mista cocchi e bacilli
IMPORTANTE IL LIVELLO DEGLI ESTROGENI
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Batteri a circolazione interumana: Infezioni esogene ed endogene
Portatore sano
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Possibili vie d’accesso per i microorganismi
Vie respiratorietratto gastro-entericogenito-urinario
Canali naturali
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Possibili vie d’accesso per i microorganismi
Via Esempi
Ingestione Salmonella, Shigella, E. coli, V. cholerae, C. botulinum ecc..
Inalazione Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella Chlamydia ecc…
Penetrazione diretta (aghi, ferite)
C. tetani, S. aureus ecc..
Punture d’artropodi
Rickettsia, Francisella, Y. Pestis ecc..
Sessuale N. gonorrhoeae, T. pallidum, C. trachomatis
transplacentare
T. pallidum
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Possibili vie d’accesso per i microorganismi
Inserzioni di: cateteri (urinari, vascolari ecc.)
tubi per ventilazione sondini di drenaggioSomministrazione di farmaci che deprimono la risposta immunitaria o che alterano il microambiente di alcuni distretti dell’organismo (es. antiacidi) interruzioni dell’integrità della superficie della mucosa e della pelle
Canali occasionali
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Meccanismi di difesa naturale e barriere
L’ambiente in vivo è molto sfavorevole per i batteri: pH, T, O2, flusso dei liquidi organici, cellule ciliate, macrofagi, integrità e composizione biochimica dei tessuti, infiammazione, febbreStrato corneo della pelle
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Meccanismi di difesa naturale e barriere
Mucose: muco, lisozima, IgA, epiteli ciliati, movimento del contenuto del lume del canale mucoso (intestino, uretra)…PMN residenteCellule di sfaldamento
Colonizzazione della cute e delle mucose
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Meccanismi di difesa naturale
FagocitosiFunzioni dei fagociti: chemiotassi, ingestione e uccisione. I batteri elaborano sostanze che attraggono i fagociti, la fagocitosi è favorita dalle opsonine-anticorpi che rivestono la superficie battericaa) l’anticorpo agisce da opsoninab) l’anticorpo + antigene attiva il complementoc) opsonine possono essere prodotte da sistemi termolabili che attivano il complementoLa fagocitosi richiede consumo di energia. E’ posseduta dai granulociti e macrofagi, il meccanismo non è del tutto noto, è stato osservato un aumento della produzione di acqua ossigenata e liberazione di lisozima nei vacuoli (fagosoma, proteine antibatteriche, lisozima, pH, fosfatasi, lactoferrina, perossidasi)
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Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)
Variazione antigenica (shift)Inibizione della fusione lisosomialeElusione dei lisosomi e moltiplicazione nel citoplasmaProduzione di catalasi che scinde lo ione superossidoResistenza agli enzimi lisosomialiProduzione di IgA proteasi
Strategie batteriche
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Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)
La resistenza ai macrofagi può aversi mediante:1. produzione di leucocidine che uccidono i macrofagi2. capsula che impedisce la fagocitosi3. produzione di superossidismutasi che sequestra l’ossigeno che serve ai macrofagi per la produzione di ATP che è necessario per la fagocitosi4. mimetismo antigenico
Strategie batteriche
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Mimetismo antigene
È la presenza di componenti strutturali che presentano notevoli analogie di composizione con materiali presenti nei tessuti dell’organismo ospite che vengono quindi difficilmente individuati come non-self
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Mimetismo antigene
S.pyogenes possiede diversi materiali antigenici (proteina M, antigeni di
membrana, carboidrati di gruppo) che presentano analogie molecolari ed
antigeniche con strutture molecolari presenti nel miocardio, cute,
nell’encefalo e nelle articolazioni e la risposta autoimmune che si mette in
opera durante l’infezione da S. pyogenes, potrebbe rappresentare un
elemento di rilievo nella patogenesi della febbre reumatica a della
cardiomiopatia reumatica. 37
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Mimetismo antigene
Le Chlamydie presentano negli involucri esterni alcune proteine
ricche in cisteina che hanno analogie antigenetiche con la
catena pesante dell’alfa-miosina specifica del muscolo cardiaco ed è stata quindi ipotizzata una base
autoimmune nella patologia cardiaca correlata alla infezione di
Chlamydia (C. pneumoniae soprattutto).
38
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Molecular mimicry by Neisseria meningitidis.
a | Glucose catabolism in N. meningitidis proceeds by the Entner–Doudoroff pathway and lactate catabolism feeds directly into the sialic acid pathway. Note the relative number of metabolic steps from glucose to phosphoenolpyruvate compared with that from lactate to phosphoenolpyruvate. b | Sialylated lipopolysaccharide (LPS) on the N. meningitidis surface mimics the surface of eukaryotic cells, preventing deposition of the complement molecule C3. Inactivation of the lactate permease gene lctP results in C3-mediated cell lysis.
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Quando un microorganismo invade l’ospite
E’ in grado di superare le difese di un individuo sano
PATOGENO
Sfrutta alcune situazioni di debolezza dell’ospiteOPPORTUNISTA
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Attributi dei microorganismi che causano malattia
Abilità di causare malattia o produrre lesioni progressive (Patogenicità) Grado di patogenicità, ovvero, malattia causata anche da batteri in numero piuttosto limitato (Virulenza).Queste proprietà possono essere suddivise in tossicità: abilità nel produrre sostanze tossiche ed invasività: abilità nel penetrare i tessuti e di diffondere.Molti di questi caratteri sono controllati da plasmidi.
43
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Isole di patogenicità (PAI)
I geni per i fattori di patogenicità, soprattutto se localizzati a livello cromosomico, possono essere (Gram-) riuniti in segmenti di DNA: PAII PAI probabilmente sono segmenti di DNA acquisiti orizzontalmente che differenziano i batteri che li posseggono dagli altri della stessa specie
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Infezione
L’infezione è il processo attraverso il
quale un microorganismo entra in relazione con l’ospite
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Infezioni
Monomicrobica: un singolo patogenoPolimicrobica: da più patogeni aerobi o anaerobiMista: aerobi ed anaerobi insiemeComunitaria: acquisita in ambiente non ospedalieroNosocomiale: acquisita dopo 72 ore dal ricovero
46
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Fasi di una proliferazione batterica
1) Adesione 2) Invasione 3) Produzione di metaboliti (crescita) 4) Produzione di tossine: enzimi degradativi tossine tipo A-B 5) Endotossine 6) Induzione di infiammazione 7) Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig) 8) Resistenza agli antibiotici
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Fattori che caratterizzano un microorganismo patogeno
Adesività mediata da strutture specializzate ac. lipoteicoici nei gram-positivi proteine nei gram-negativi (fimbrie, pili ecc.)produzione di capsula (slime)capacità biochimica di metabolizzare nelle condizioni nutrizionali fornite dai tessuti dell’ospitecapacità di penetrare e moltiplicarsi in tessuti profondi (invasività)capacità di contrastare i meccanismi difensivi dell’ospiteproduzione di esotossine
48
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Adesione
Uno dei principali eventi che promuovono l’infezione.Il processo è mediato da strutture poste sulla superficie esterna dei batteri note come adesine, per esempio l’antigene K88 dell’Escherichia coli enteropatogeno, gli acidi lipoteicoici (streptococchi) e altre. Le cellule epiteliali hanno a loro volta, come già detto, strutture che legano le adesine ad esempio fibronectina disposta sulla superficie dell’epitelio orale.(Batteri isogenici privi di adesine non danno infezione)
49
Perchè i batteri aderiscono?
• I batteri non adesi verrebbero eliminati
• Adesione: prima tappa della colonizzazione e della formazione del biofilm
3: Fase di adesione reversibile e irreversibile
50
Evidenze sperimentalidel ruolo dell’adesione nella
colonizzazione• I batteri legano recettori isolati o analoghi
dei recettori• L’adesina purificata o un suo analogo lega il
recettore • L’adesione è inibita da:
• Analoghi dei recettori e delle adesine• Enzimi che distruggono l’adesina o il recettore• Anticorpi specifici diretti contro l’adesina o il
recettore51
Cosa utilizzano i batteri per aderire? Adesine batteriche
• Proteine espresse sulla superficie• Fimbrie• Glicocalice, Lipopolisaccaride (G-), Acidi
teicoici (G+)• Enzimi
• Enzimi batterici ancorano la cellula al substrato
• Enzimi batterici possono esporre recettori criptici 52
Morfologia delle adesine
Type IV fimbriae (= bundle forming pilus)
Type I fimbriaeAfimbrial adhesin
Curli
53
ADESINE BATTERICHE
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Epidemiologia
Adesività
Ogni specie batterica interagisce con recettori presenti su determinati epiteli: Esiste uno spettro
S. mitis tutta la mucosa buccale S. salivarius lingua e gengiveS. pyogenes faringe e tonsilleN. gonorrhoeae uretraV. cholerae intestino tenueE. coli ileo, colon,tratto urogenitale, ecc.
Tossine ciliostatiche
Colonizzazione delle mucose
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Fibronectina
Sulla superficie delle cellule epiteliali vi è una proteina, la fibronectina, con cui interagiscono le adesine dei batteri gram-positivi, prevenendo così l’adesione dei gram-negativi. La fibronectina è una glicoproteina prodotta dagli epatociti e distribuita in forma solubile in tutti i liquidi organici, viene escreta nelle cavità naturali dell’organismo dove si deposita sulla superficie delle mucose ed è inoltre presente nei tessuti dove forma un reticolo fibrillare. La fibronectina è coinvolta in alcuni processi biologici tra cui la fagocitosi, la rigenerazione dei tessuti e nella differenziazione cellulare.
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Acquisizione di patogeni potenziali: malattia di base
Durante il decorso di varie affezioni si determinano variazioni nelle cellule di rivestimento (cute e mucose) con colonizzazione da parte dei bacilli gram-negativi e riduzione della popolazione batterica gram-positiva
Volontari o pazienti ricoverati in clinica psichiatrica non hanno dimostrato variazioni della popolazione batterica normale dell’orofaringeVariazioni con la durata della degenza (stesso reparto)
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FIBRONECTINA: ALTRI EFFETTI SULLA POPOLAZIONE
BATTERICA RESIDENTE
La presenza di fibronectina in:ferite accidentali o causate da strumenti, sulla superficie di cateteripredispone all’invasività di cocchi gram-positivi (stafilococchi, streptococchi) che possiedono sulla loro superficie recettori per la fibronectina con la quale creano un legame molto stabile.
La colonizzazione dei cateteri avviene con batteri gram-positivi produttori di slime che li rende immuni da qualsiasi trattamento con farmaci e dall’azione dei macrofagi.
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Fibronectina: un modulatore della popolazione batterica residente
Pazienti affetti da malattie organiche o ustioni, traumi ecc. dimostrano un ridotto tasso di fibronectina nel plasma
ConseguenzeRiduzione di fibronectina dalla superficie cellulare scomparsa dei microorganismi (cocchi) gram-positivi colonizzazione da parte di bacilli gram-negativiProduzione di proteasi batterica e dell’ospite?Ulteriore riduzione del tasso di fibronectina nel sito di colonizzazione.
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Immunità attiva e Immunità umorale
Immunità attivadovuta al contatto con un antigene, produzione di anticorpi richiede tempi di sviluppo anche lungo ma può dare protezione permanente
Immunità umoraleproduzione attiva di anticorpineutralizzano tossine e prodotti cellularieffetto battericida diretto o litico con il complementobloccano l’abilità infettiva dell’agenteagglutinano i batteri facilita la fagocitosiopsonizzazione, interagiscono con le componenti di superficie che possono limitare la fagocitosi
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Sopravvivenza alla superficie delle mucose
Una volta ancorati alla superficie di un epitelio (ma questo anche nei tessuti profondi) i batteri si moltiplicano e interagiscono con le cellule superiori attraverso la produzione di sostanze variamente tossiche. Queste proteine vengono secrete da appositi sistemi secretori grazie al quale i batteri possono traslocare nel citosol della cellula eucariotica le proteine effettrici che interferiscono con il signalling eucariotico, compromettendo le funzioni cellulari e attivando il processo di apoptosi o alterano strutture particolari e causano necrosi
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Invasione Produzione di enzimi extracellulari o attivi all’esterno dei batteri: collagenasi: distrugge il collageno coagulasi: causa la coagulazione del plasma S.aureus ialuronidasi: idrolizza l’acido ialuronico (tessuto connettivo) streptochinasi: (fibrinolisina) promuove la formazione di plasmina dal plasminogeno, dissolve i coaguli emolisine: lisano i globuli rossi proteasi: idrolizzano le immunoglobuline o altre proteine dell’ospite. La tossicità gioca un ruolo importante nell’invasività ma non è un fattore diretto (capsula polisaccaridica o di acidi ialuronici, proteina M, polipeptidi di superficie, resistenza agli enzimi dei fagociti).
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Penetrazione nei tessuti profondi
Il danneggiamento dell’epitelio mucoso è per molti batteri la
strada per raggiungere la sottomucosa, altri quali
Salmonelle e Shigelle utilizzano peculiari meccanismi invasivi che
consentono di penetrare direttamente nelle cellule
dell’epitelio mucoso. 66
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Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi
Sfuggire alle difese immunitarie (capsula o resistenza al killing dei fagociti)
moltiplicazioneTempo di moltiplicazione in vivo (8-10h ?) (situazione simile a chemostato*, ma effetto del s.i.)Siderofori ecc.Tropismo d’organo
* sangue e linfa portano nutrimenti e allontanano scorie
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Capsula
Contrasta gli effetti potenzialmente nocivi dell’interazione adesine-recettore fagocitaMaschera le adesine, varia la carica di superficie battericaOstacola la deposizione di C3b e l’ancoraggio di AbStrategia + comune nei G+Nei G- mancata produzione di fimbrie
Colonizzazione delle mucose
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Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi
Una volta all’interno di fagociti professionali, alcuni batteri patogeni sono in grado di evadere dal fagosoma (prima della fusione con i lisosomi), mentre altri sono in grado di moltiplicarsi all’interno del fagosoma alterando la membrana impedendo la fusione con il lisosoma, oppure produzione di catalasi e SOD per contrastare i meccanismi di killing ossigeno-dipendenti, eliminado i derivati dell’ossigeno molecolare provvisti di azione microbicida (perossido di idrogeno, anione superossido etc).
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Le shigelle non essendo in grado di accedere all’interno degli enterociti della mucosa del colon, attraverso la membrana apicale di tali cellule, guadagnano l’accesso alla sottomucosa attraverso le cellule M per transcitosi. I pochi batteri che arrivano alla sottomucosa vengono prontamente fagocitati dai macrofagi residenti nella sottomucosa.
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Produzione di metaboliti
Sono costituiti da prodotti originati dalla crescita batterica in seguito alla demolizione di composti complessi, molti di questi, come l’acido lattico, alcoli, acetone o aldeidi o comunque composti organici possono esercitare un effetto tossico sulle cellule.
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Potere aggressivo dei batteri
Sostanze non tossiche: capsula, coagulasi, catalasi (H2O2)
SOD (O2-), collagenasi, ialuronidasi
ecc.Sostanze tossiche:Esotossine: esocitate, proteicheEndotossine: legate al batterio LPSDivisione non netta i.e. endotossine proteiche: V. cholerae 74
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Differenze tra esotossine ed endotossine
ESOTOSSINE
Escrete da cellule viventi e ritrovate ad elevate concentrazioni nei terreniPolipeptidi PM 10.000-900.000Relativamente instabili: tossicità spesso rapidamente distrutta col calore>60°Altamente antigeniche, stimolano la formazione di alti titoli di antitossina che neutralizza la tossinaConvertibile in antigene (anatossina) da formalina, acidi, calore ecc.Altamente tossiche, fatali per animali da laboratorio in mg o menoNon producono febbre nell’ospite
75
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Differenze tra esotossine ed endotossine
ENDOTOSSINE
Parte integrante della parete dei gram-negativiComplesso lipopolisaccaridico (LPS), il lipide A è la porzione responsabile della tossicitàStabile al calore>60° per ore senza perdere tossicitàNon stimola la formazione di antitossinaLa parte polisaccaridica (molto variabile) stimola la produzione di anticorpi (Antigene somatico O)Non è convertibile in anatossinaDebolmente tossico per animali anche a dosi di mgSpesso causa febbre
76
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Classificazione delle esotossine
TOSSINE CITOLITICHE Attive sulla membrana delle cellule
TOSSINE NEUROTROPE Attive sulle cellule del sistema nervoso
TOSSINE ENTEROTOSSICHE Attive sulle cellule della mucosa intestinale
TOSSINE PANTROPE Attive su tutte le cellule, inibiscono la sintesi proteica
77
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Tossine emoliticheFormazione di pori attraverso la membrana
Attività fosfolipasica che idrolizza la fosforilcolina della membrana
Fig 7.3 LA placa
78
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Esotossine che agiscono a livello delle strutture della superficie
cellulare
Tossina esfoliativa sindrome cute ustionata
Tossine emolitiche (emolisine o citolisine)79
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TOSSINE ENTEROTOSSICHE
Citotossiche che causano danni evidenti alle celluleCitotoniche danni non evidenti
Colerica è il prototipo (80.000 daltons)Subunità A 29.000 e 5-6 subunità B identiche 10.500Le sub. B si legano al recettore sulla membrana e facilitano l’ingresso della ALa A induce una ADP-ribosilante NAD-dipendente sul GTP che attiva in modo permanente l’adenilciclasiquesto provoca un perturbazione nel passaggio di acqua ed elettroliti(perdita di acqua attraverso il lume intestinale)
Con meccanismo simile si ritrova in E. coli, K. pneumoniae, S. typhimurium e S. enteritidis
80
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Epidemiologia
Tossina pertossica
82
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L’esotossina dissenterica è prodotta dalla Shigella dysenteriae di tipo 1.Neurotossica ed enterotossica. L’inibizione della sintesi proteica avviene con unmeccanismo non ancora noto. Si osserva un’inibizione del trasferimento degliamminoacidi sulla catena peptidica nascente.
Tossina della pertosse. Proteina (100.000 D) composta da 5 subunità.La produzione di cAMP è regolata da due proteine situate all’interno dellamembrana cellulare: Gs che ha funzione stimolante e Gi che svolgeattività inibente. La tossina colerica ha come bersaglio finale la Gsmantenendola in uno stato attivo permanente, mentre la tossina della pertosseinteragisce con Gi impedendo qualsiasi attività inibente.
83
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TOSSINE PANTROPE
Tossina difterica (prototipo), catena polipeptidica di 62.000 D unita da 2 ponti S-S, la molecola è tagliata da proteasi in due frammenti A e B che restano uniti da S-S. Il frammento B riconosce il bersaglio cellulare, mediante la sua parte COOH terminale, sulla superficie della cellula. Si lega alla parte idrofoba della membrana e crea un canale attraverso il quale il frammento A penetra all’interno. Il glutatione (presente all’interno della cellula) libera il frammento A, enzimaticamente attivo (ADP-ribosilante). Agisce sul NAD staccando ADP-riboso che interagisce con il fattore EF2 bloccando la traslocazione sul ribosoma. Il complesso EF2-ADP potrebbe ancora reagire con il ribosoma e il GTP (che fornisce energia), tuttavia è bloccata l’idrolisi del GTP, non si ha quindi energia e la sintesi proteica è interrotta.
84
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Esotossine che inibiscono la sintesi proteica cellulare
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Esotossine citotossiche per azione sul citoscheletro
Sono tutte tossine binarie, formate cioè da due distinti componenti A e B che sono secreti separatamente e si riuniscono solo alla superficie della cellula bersaglio, possiedono tutte un attività catalitica ADP-ribosiltransferasica ed hanno come specifico bersaglio l’actina.C2 di C. botulinum, fattore citotossico necrotizzante prodotto da molti stipiti di E. coli uropatogeni nell’uomo e animali e la tossina dermonecrotica di Bordetella spp.Tossine sono denominate CDT (cytolethal distending toxins) dimostrate in in E.coli, Shigella e Salmonella. induce danni nel DNA che innescano i sistemi di riparo e il blocco del ciclo cellulare Le cellule bersaglio principali sono monociti- macrofagi. 86
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TOSSINE NEUROTROPE
Tetanica e del carbonchio attive sulle cellule del SNCBotulinica attiva sulle cellule del sistema periferico
La botulinica blocca la liberazione di acetilcolina nella giunzione neuromuscolare si ha quindi paralisi flacida (meccanismo non noto)
La tetanica blocca l’inibitore del riflesso si ha quindi contrazione, diffonde attraverso il midollo spinale e giunge ai centri nervosi, blocca i mediatori (glicina, acido gamma-aminobutirrico, nucleotidi ciclici) si fissa sui recettori gangliosidici della membrana dei motoneuroni a livello presinaptico (paralisi spastica)
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GABA
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89
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Tossina botulinica
Sulla base del valore di LD50 di circa 1 ng/kg [3], poche centinaia di grammi di questa tossina potrebbero teoricamente uccidere ogni essere umano presente sulla Terra (a scopo comparativo, la stricnina richiederebbe 400 tonnellate per uccidere ogni essere umano). Generalmente le dosi letali orali risultano comprese fra 0,5 e 5 mg/kg di alimento ingerito.
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Endotossina
Glucosamina fosforilata ed esterificata con acidi grassi saturi
Ripetizione di unità diverse nelle diverse specie
Contribuisce alla tossicità del Lipide A influenzandone l’idrosolubilità e la struttura
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Endotossina
In passato si riteneva che LPS agisse direttamente sulle membrane biologicheOggi si sa che: stimola i macrofagi al rilascio di sostanze che sono le reali effettrici dell’attività tossicaAttiva la cascata del complementoAttiva la cascata della coagulazione
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Epidemiologia
Effetti dell'endotossina
- febbre (attivazione di IL-l)- neutropenia: adesivita' delle cellule ai vasi, granulocitosi
- ipoglicemia: intensa attività metabolica cellulare glicolisi
- ipotensione: vasodilatazione, permeabilità, stagnazione di liquidi
- anormale perfusione di organi essenziali- attivazione del complemento-disseminata coagulazione intravascolare
- reazioni di Schwartzman (locale e generalizzata)
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Superantigene
Alcune tossine particolari liberate da alcuni patogeni attivano le cellule T senza richiesta di antigene, si legano al recettore di queste cellule sia a quello del complesso maggiore di istocompatibilità che può scatenare una risposta immune nei confronti delle stesse cellule, quindi molto rischioso. Esempi di queste tossine sono quelle dello shock tossico di S.aureus e quelle eritrogeniche di S.pyogenes.
98
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superantigeni
Enterotossine stafilococcicheTSST (Tossina dello Shock Tossico)T. pirogeniche streptococcicheDevono parte della loro tossicità a:Specifica attività enzimatica (es. attivazione interleuchinaSono fortemente pirogene
Interagiscono con i LT, attivazione e moltiplicazione in % amplificata (2-20% vs 0.0001-0.01% normale Ag)
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Epidemiologia
A. L’antigene convenzionale, internalizzato ed elaborato dalla cellula viene esposto nel contesto del MHC II al riconoscimento del TCR con specifica capacità combinatoria
A. Il superantigene lega direttamente, senza precedente internaliz. ed elaboraz., le proteine del MHC II e il TCR
100
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Infiammazione
Si ha in risposta di infezione batterica, ma in particolare per i virus, si ha un eccesso di risposta immune in proporzione al processo infettivo. Chlamydia, Borrelia e sifilide, ma anche streptococchi (febbre reumatica)
101
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102
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Epidemiologia
103
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IgALe IgA o immunoglobuline secretorie si trovano in tutti gli epiteli in contatto con l’esterno. Si formano, attraverso la cattura, da parte delle cellule M (microfold) che sono localizzate nei pressi delle placche del Peyer, di corpi estranei, virus, batteri, tossine, ecc. Queste cellule non hanno attività fagocitaria, presentano quindi l’antigene ai macrofagi sottostanti che lo digeriscono e lo presentano alle cellule T che elaborano le IgA specifiche, in questo modo l’organismo ha immunoglobuline per contrastare l’invasione dei microorganismi più frequentemente presenti.
104
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105
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106
IgA
La mucosa intestinale secerne Ig, in particolare IgA. Si calcola che ne siano prodotte dai 40 ai 60 mg al giorno per ogni kg di peso corporeo. Nelle placche del Peyer vengono prodotte anche IgM. Le IgA sono considerate l’elemento primario per la risposta immunitaria verso gli antigeni microbici. Le IgG fanno parte della risposta immunitaria innata della mucosa.
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INTERAZIONI TRA BATTERI Infezioni polimicrobiche
Possono essere più gravi di quellecausate da un singolo patogeno
quando le interazioni tra le singolespecie
trasformano un’infezione mista inuna
INFEZIONE SINERGICA
107
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INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico
E’ un fenomeno comune eimportante nella produzione di
infezioni miste diaerobi ed anaerobi
specie in tessuti a lento ricambio odrenaggio o dove l’eliminazione
dei patogeni è rallentato
108
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INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico
E’ un fenomeno ben documentatonelle infezioni sperimentali
intraddominalitessuti mollisetticemiedentaliginecologiche
109
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INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico
E’ un fenomeno ben documentatonelle infezioni sperimentali
Da peritoniti sono stati isolati i varimicroorganismi in coltura pura:
Rinoculati in animaliSingola specie: innocua
Coltura mista: palese infezione
110
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INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico (ipotesi)
Favorevoli modifiche dell’ambienteProvvedere a nutrienti essenzialiProvvedere a fattori di virulenzaModulare la risposta immunitariaProtezione reciproca nei confronti degli agenti antibatterici
111
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INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Favorevoli modifiche all’ambiente
Il consumo di O2 da parte dei batteri aerobi nella popolazione mista produce condizioni favorevoli alla proliferazione degli anaerobi, i quali a loro volta proteggono i batteri aerobi dalla fagocitosiIl basso pH dovuto al metabolismo di molti aerobi e acidogeni crea situazioni favorevoli per lo sviluppo di anaerobi e acidofili
112
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INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Favorevoli modifiche all’ambiente
Molte specie aerobie che producono capsula
(E.coli, K.pneumoniae, S.pneumoniae)raramente producono ascessi seagiscono come unico patogenomentre il Bacteroides fragilis
(anaerobio)produce una capsula che è in grado dipromuovere la formazione di ascessi113
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INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Favorevoli modifiche all’ambiente
ASCESSO: UN AMBIENTE PROTETTOLa formazione sinergistica di un ascesso provvede:una barriera alla diffusione degli agenti antibattericiuna barriera ai fattori dell’immunità dell’ospiteallo sviluppo di più specie batteriche che:>elaborano enzimi inattivanti gli antibiotici (β-lattamasi, cinasi anti aminoglicosidi ecc.)>causano strette condizioni di anaerobiosi che compromettono l’attività di di aminoglicosidi e chinoloni così come la fagocitosi 114
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INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Provvedere a nutrienti essenziali(commensalismo)
Veillonelle e difteroidi sintetizzano vit. K (naftaquinone) che è richiesto da B.melaninogenicus per crescere e per esprimere la virulenzaS.mutans produce PAB utilizzato da S.sanguisI treponemi fanno uso di acidi grassi (butirrico e succinico) liberato da anaerobi (fusobatteri, batteroidi)Le Veillonelle metabolizzano ac. lattico liberato dalla popolazione microbica normale (PMN)Molti batteri della cavità orale usano ac. lattico liberato dagli altri commensali
115
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INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Provvedere a fattori di virulenza
Fusobacterium necrophorum elabora una leucocidina che protegge Corynebacterium pyogenes dall’attività battericida dei leucociti. (C.pyogenes produce un fattore di crescita per F.necrophorum)
S.aureus produce ialuronidasi che esalta l’attività necrotica degli streptococchi anaerobi e conduce alla distruzione dei tessuti
116
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INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Modulazione della risposta immunitariaNelle infezioni miste gli anaerobi inibiscono la fagocitosi degli aerobi mediante disturbi o indebolimenti delle attività di:opsonizzazionechemiotassi dei neutrofiliproduzione di ossigenobatteriocidiaAttraverso il meccanismo di:diminuzione delle opsonine del sieroproduzione di acidi grassi volatili (butirrico e succinico) tossici per la fagocitosiproduzione di leucocidine
117
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INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Protezione reciproca nei confronti degli agenti antimicrobici
B.fragilis e altre specie anaerobie producono β-lattamasiNelle infezioni miste questi enzimi proteggono le specie sensibili ai β-lattamici inattivando questi antibiotici (patogenicità indiretta)B.fragilis e vari Clostridi possono aminofenilare il cloramfenicolo rendendolo inefficace sulla restante popolazione batterica mista
118
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INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Strategie terapeutiche
L’eliminazione selettiva di un componente della popolazione mista fa fallire il sinergismo battericoFarmaci a spettro ristretto
Eliminazione di tutti i patogeni in causaAntibiotici ad ampio spettrousualmente β-lattamiciin caso di allergie: macrolidi o altri agenti
119
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Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite
Capsula: per mascherare le cellule opsonizzate ostacola la fagocitosi (S.pneumoniae, K.pneumoniae, H.influenzae)Coagulasi: il germe si annida nel coagulo per proteggersi dalle difese in generale S.aureusFibrinasi, jaluronidasi, collagenasi: distruggere l’integrità dei tessuti con penetrazione all’interno (molti opportunisti)Compromettere la funzionalità dei fagociti e delle cellule ciliate: BordetelleProduzione di enzimi citotossici: S.aureus, S.pyogenes, Pseudomonas spp.A livello di fagocitosi: blocco dei processi ossidativi (Salmonella, Legionella) impedire la fusione tra fagosoma e lisozima (Gonococchi, Micobatteri)
120
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Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite
Cattura del ferro (siderofori) in competizione con lattoferrinaSfuggire alla risposta immunitaria: liberare la capsula (pneumococchi)Variazioni di antigenicità (Borrelia e gonococchi) E.coli KI nella meningite infantileCattura di materiale dell’ospite e distribuirlo sulla superficie esterna per confondere la risposta immunitaria (Treponema pallidum)Liberare la proteina A che si lega alla porzione Fc delle Ig che provoca l’inversione dell’anticorpo (S.aureus)
121
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Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite
Fase aerobia (aerobi, >>>ATP)
Fase anaerobia (aerobi, <<<ATP) Fase planctonica Fase sessile Ridotta tossicità di LPS P.aeruginosa, Aggregatibacter actinomycetemcomitansMorte cellulare programmata (PCD) 123
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Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite
Biofilm: Ig, macrofagi, antibiotici, replicazione lentaFase intracellulare, per sfuggire ai macrofagi, Ig e a molti antibiotici, tasso di crescitaInduzione di forme filamentoseQuorum sensing, attivazione di alcune funzioni cellulari mediate da ferormoni (in funzione del numero)Attivazione di uno stato vitale ma non coltivabile
124
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125
S. pneumoniae
S. pneumoniae is known for its ability to enter into a state of genetic competence under conditions of high cell density in response to a secreted signaling peptide (QS). Only a fraction of the S. pneumoniae cells become competent in response to the peptide autoinducer and elaborate a bacteriocin that causes the lysis of noncompetent cells.
The lysed cells release not only transforming DNA and nutrients but also pneumolysin and other factors important for virulence.
S. pneumoniae sacrifices some its relatives for this purpose which facilitates invasion of its host.
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Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
La vita dei microorganismi è prevalentemente sessile e solo una frazione minima (<0,1 %) mantiene uno stato planctonico
126
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Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
La semplice adesione ad una superficie, attiva nel microorganismo l’espressione di molti geni che codificano sia per tutti i prodotti deputati alla vita sessile sia quelli che sono coinvolti nei meccanismi di patogenicità e virulenza 127
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Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Una volta che i batteri sono adesi, essi si organizzano in microcolonie. Questo fenomeno implica la presenza di un biofilm, ove i microorganismi sono immersi, costituito da polisaccaridi e prodotti metabolici che, come già detto, mediano adesività tra i microorganismi e gli epiteli e tra i batteri stessi.
128
Biofilm : una resistenza fenotipica
Dunne WM Jr . Clin Microbiol Rev 2002;15:155-166 129
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Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Il biofilm rappresenta un nido di microorganismi anche quando tutte le forme planctoniche sono state uccise. Questo spiega perché i cateteri colonizzati sono sorgenti di gravi infezioni con scarse possibilità di successo terapeutico.
132
Biofilm batterici e Infezioni recidivanti
• Endocarditi: valvole naturali o artificiali • Quadri legati a inserzione di cateteri, protesi, lenti,tubi endotracheali • Otiti,sinusiti • Prostatiti, uretriti ,cistiti • infezioni vie biliari•Fibrosi cistica
Riacutizzazioni di BPCOCosterton JW e al :science 1999;284 :1318-22134
Sethi et al. N Engl J Med 2002; 347: 465-471
• Prevenire la formazione di biofilm
• Disgregare biofilm, già esistenti
• Eradicare i microrganismi negli strati più profondi del biofilm
Attacco al Biofilm
137
Creson M. Focus: Bacterial Cities TimesDispatch.com 13 Gennaio 2003
La strategia terapeutica deve tener conto che gli antibiotici
attualmente in uso sono stati sviluppati e studiati
per agire contro batteri planctonici e non organizzati
in biofilm
Attacco al Biofilm
138
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Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Nel loro insieme queste osservazioni indicano che la fase planctonica è quella che favorisce la disseminazione della vita microbica, mentre la fase sessile all’interno del biofilm è favorevole alla sopravvivenza.
140
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Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Lo sviluppo del biofilm è condizionato dalla presenza nell’ambiente di un fattore prodotto dagli stessi microorganismi autoinducente che a sua volta dipende dal numero dei batteri, il fenomeno è noto come quorum sensing
141
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Quorum Sensing
142
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Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri
Quorum sensing
E’ stato identificato nel 1970 su un batterio luminescente il Vibrio fischeri che colonizza un cefalopodo. Il microorganismo è presente in mare ad una concentrazione di circa 100 cell/ml. Mentre sull’organo luminoso del pesce raggiunge 1010 cell/ml e diviene luminescente.
143
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Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri
Quorum sensing
I batteri elaborano un prodotto specie specifico (omoserinalattone) diffusibile nell’ambiente ove permane e si accumula.Quando la concentrazione raggiunge un limite condizionato dal numero dei batteri presenti si ha induzione del gene bersaglio.
144
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Quorum sensing
Il sistema detto luxI~luxR è stato identificato in molte specie ed è tutto da valorizzare.E’ un sistema molto economico per rivelare la propria presenza solo quando il numero è sufficientemente alto per avere tutti i vantaggi (nutrimenti, trasferimento di geni, fattori di patogenicità e virulenza, ecc.)
145
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Quorum sensingApplicazioni
E’ stato dimostrato che se in P.aeruginosa si inattiva il gene las il microorganismo perde i suoi caratteri di patogenicità.
Si possono rendere innocui i patogeni eliminando il loro sistema quorum sensing?
146
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Quorum sensingApplicazioni
Trovare composti che funzionano come gli autoinduttori ma bloccano il gene
Furanone è stato trovato in un’algaha dimostrato di interferire con il quorum sensing di Serratia liquefaciens.
147
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148I Gram-positivi causano effetti simili ma usano mediatori diversi
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La scoperta dei sistemi quorum sensing nei batteri gram-negativi ha non solo approfondito le nostre conoscenze sulla patogenesi delle infezioni causate da questi organismi ma potrebbe anche provvedere ai mezzi per il trattamento di queste comuni ed importanti infezioni
Hartman and Wise 2001 149
E’ noto che in natura i batteri si presentano con caratteristiche molto diverse da quelle che mostrano in coltura in laboratorio
L’ambiente naturale può essere sfavorevole alla crescita e alla sopravvivenza di molti batteri, specialmente di quelli adattati a moltiplicarsi nell’uomo o negli animali
Questi microorganismi hanno sviluppato risposte sofisticate alle variazioni ambientali
150
Quando le condizioni ambientali non sono idonee alla crescita, i batteri entrano in una fase programmata di
sviluppo che risulta in uno stato metabolico meno attivo e rende il batterio più resistente.
•Aumento della resistenza agli agenti antimicrobici
•Cambiamenti nell’idrofobicità di superficie e nelle capacità adesive
•Cambiamenti a carico degli acidi grassi di membrana, degli aa della parete
•Cambiamento di forma
•Topologia del cromosoma
151
152
I BATTERI SI ADATTANO ALLE VARIAZIONI AMBIENTALI MEDIANTE
•Induzione della sintesi di sistemi di cattura dei nutrienti presenti in concentrazioni ridotte
•Modificazione della sintesi di alcuni enzimi allo scopo di utilizzare efficientemente i nutrienti presenti in
concentrazioni ridotte
•Modulazione del tasso di incorporazione dei nutrienti presenti in eccesso
•Riorganizzazione di alcune vie metaboliche allo scopo di evitare possibili blocchi
Coordinamento dei tassi di sintesi per mantenere la crescita bilanciata
153
VBNCviable but non culturable
(Xu et al. 1982)
I batteri in stato VBNC sono metabolicamente attivi ma non sono in
grado di attuare i processi divisionali che portano alla formazione di colonia sui
terreni di coltura normalmente utilizzati per il loro rilevamento
154
FATTORI CHE INFLUENZANO L’ATTIVAZIONE DELLO STATO
VBNC
Scarsità di nutrienti
Temperatura
Luce
Salinità
Pressione idrostatica
Ossigeno
155
ELENCO DI ALCUNI BATTERI CHE POSSONO ATTIVARE LO STATO
VBNC
Aeromonas
Agrobacterium
Alcaligenes
Campylobacter
Enterobacter
Pseudomonas
Rhizobium
Salmonella
Shigella
Vibrio
Yersinia
Enterococcus
Escherichia
Helicobacter
Klebsiella
Legionella
Micrococcus
156
SAGGI UTILIZZATI PER LA DIMOSTRAZIONE DELLA VITALITA’ BATTERICA
•Conta Vitale Diretta (DVC)
•Immunofluorescenza - Conta Vitale Diretta (DFA-DVC)
•Colorazione con cloruro di tetrazolio (CTC)
•Colorazione con “Live/Dead bacLight Viability kit”
•Ricerca di RNA messaggero (RT-PCR)
•Ricerca di antigeni specifici dello stato VBNC
157
Le cellule non coltivabili (VBNC, stressate) possono rappresentare un problema
per la salute pubblica se non rilevate con saggi
adeguati
158
159
160
161
162
163
a | Innate immune cues. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) reside intracellularly within bladder epithelial cells. A small number of intracellular bacteria respond to the activation of host immune effectors by filamentation. Epithelial-cell death accompanies bacterial growth, thereby resulting in the exposure of filamentous and bacillary organisms on the surface. The filamentous form is resistant to neutrophil phagocytosis. The recovery from filamentation results in the invasion of naive epithelial cells to begin the process again.
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
164
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
b | Predator sensing cues. Marine bacterial populations are made up of multiple species, including the prototypical Flectobacillus spp. Protist grazing on all species stimulates filamentation in Flectobacillus spp. Filamentous forms cannot be grazed by marine protists. Recovery from filamentation results in an alteration in the diversity of bacteria in the environment and the depletion of non-Flectobacillus species 165
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
c | Quorum sensing cues. Proteus mirabilis grows as a bacillary form that can count the number of similar species in the vicinity by quorum sensing. If a quorum of organisms is verified, the bacteria respond by initiating the differential gene expression that leads to filamentation. Although a mechanistic reason for filamentation in Proteus spp. Is under debate, the evidence suggests that this morphology leads to enhanced invasion of the urothelium, thereby providing protection from the host immune response. Dissemination into the tissue disperses the swarming filaments. Cell division is restored owing to low levels of quorumsensing molecules in the tissue.
166
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
d | Antimicrobial cues. Filamentation occurs if bacteria are exposed to certain β‑lactam antibiotics in vitro and in vivo. Filamentation allows for survival until the antibiotic is diluted or becomes inactive. The restoration of cell division occurs once the antibiotic activity is lost. In some cases, for example, Burkholderia pseudomallei, cell-division capacity is maintained even in the presence of antibiotics of similar and dissimilar classes, which indicates that protection has been conferred to daughter cells. The
mechanisms and consequences of this response have not yet been explored.167
168
INVASIONE CELLULARE da parte di batteri enteropatogeni
169
Cos‘è un batterio enteropatogeno invasivo?
• I batteri invasivi sono capaci di promuovere il loro ingresso in
cellule che non sono fagociti professionisti.
• I batteri enteroinvasivi raggiungono il lume intestinale,
aderiscono alle cellule dell’ospite e superano la barriera naturale,
estremamente impermeabile, rappresentata dalle cellule epiteliali
Esempi:
Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis
Shigella spp.
Salmonella spp.
Listeria monocytogenes 170
Barriere all‘infezione batterica nel tratto gastro-intestinale
171
La barriera dell‘epitelio intestinale
172
Cellule M: il punto debole, il tallone d‘Achille
Le placche del Peyer (formate da un centro germinativo di linfociti B circondato da linfociti T) si trovano nella sottomucosa dell’intestino tenue. L’epitelio sovrastante le placche presenta cellule M, cellule epiteliali specializzate nel consentire il passaggio di particelle nel tessuto linfoide sottostante.La superficie basolaterale invaginata forma una superficie dove migrano linfociti e macrofagi. Molecole e particelle vangono trasportate nella tasca.
173
Fattori che determinano se il batterio sarà internalizzato o no:
• Natura del recettore sulla cellula ospite
• Forza dell’interazione
• Capacità del batterio di inviare segnali che stimolano o antagonizzano l’internalizzazione
174
STUDI IN VITRO E IN VIVO
Colture cellulari
Diverse linee cellulari sono state usate per studiare l’invasione batterica: sistema eccellente, riproducibile e non complicato, ma con diverse limitazioni
Modelli animali
Dopo che i dettagli molecolari sono stati determinati in vitro, possono essere poi verificati in modelli animali
175
Meccanismi di invasione cellulare
TriggerZipper
Yersinia, Listeria Salmonella, Shigella
176
Ingresso di Listeria monocytogenes in fagociti non professionisti in vitro
Sono coinvolte almeno due proteine di superficie: • Internalina (InlA): proteina di superficie che è ancorata covalentemente alla parete
• InlB: proteina di superficie legata debolmente alla parete
177
in vivo
• I topi non sviluppano una malattia letale dopo infezione per os con Listeria: scarsa traslocazione dei batteri attraverso l’intestino•Risultati simili con Listeria wt o mutanti inlA
Listeria wt causa una malattia sistemica in topi transgenici che esprimono caderina E umana negli enterociti, mentre mutanti InlA sono incapaci di attraversare la barriera intestinale efficientemente
• Cellule che esprimono E-cadherin di topo, al contrario di cellule che esprimono E-cadherina umana, non permettono ingresso di Listeria via inlA
•la specie specificità è dovuta a differenze in un singolo aa
178
Model of invasion of the intestinal epithelium by Listeria
179
180
Motilità dipendente dalla polimerizzazione
di actina• Polimerizzazione dell’actina con
formazione di code• Si muove nel citoplasma• Invade le cellule adiacenti• ActA: proteina di 90 kDa,
determina il reclutamento e l’assemblaggio dei filamenti Localizzata ad una estremità del batterio
Velocità: 1um/sec
181
• I batteri a contatto con la membrana plasmatica continuano a muoversi
• Producono protusioni che si estendono nella cellula adiacente: listeriopodi
• Si forma una vescicola con due membrane e la cellula si libera nel citoplasma
• Listeriolisina• PC- PLC: proteina extracellulare 28 kDa fosfolipasi
a largo spettro, idrolizza la fosfatidil colina (PC)• Metallo proteasi: trasforma il precursore di PC-
PLC (33 kDa) in forma attiva (28 kDa)• Le due fosfolipasi determinano la lisi di entrambe le
membrane cellulari. Non è noto se svolgano ruoli diversi nei due compartimenti che formano il vacuolo Pseudopodi: 40 um
Ingresso nella cellula adiacente e fuoriuscita dal vacuolo secondario
Per la fuoriuscita dai vacuoli:
182
plcBhlyA
actA
hlyA plcA
inlA/B
inlA: internalina; hly: listeriolisina; plcA: PI- PLC (una fosfolipasi);
actA: polimerizzazione actina; plcB: PC- PLC (una fosfolipasi) 183
184
The invasive phenotype of Shigella is dependent on a type III secretion system encoded by a 30 kb region of a 200 kb virulence plasmid
VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidicaVirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa.
Ipa B e C, si integrano nella membrana dell’ospite e promuovono la formazione degli pseudopodi
IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite favorisce la depolimerizzazione dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del batterio. Le proteine IpaA servono anche per la lisi del vacuolo
mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes spa surface presentation of invasion plasmid antigensspa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattivo Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula
IcsA (VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica.
IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta
185
IPa (Invasion-Plasmid-Antigens)-ABCD
Ipa B e C, si integrano nella membrana
dell’ospite e promuovono la formazione degli
pseudopodi
FATTORI DI VIRULENZA plasmidici
IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite
favorisce la depolimerizzazione
dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del
batterio. Le proteine IpaA
servono anche per la lisi del vacuolo
IpaA (30 kDa) IpaB (62 kDa), IpaC (42 kDa), e
IpaD (35 kDa) in condizioni non secretorie sono accumulate nel
citoplasma legate ad una proteina di 18 kDa
(IpgC) che ne impedisce
l’aggregazione e la digestione
VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidicaVirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa.
186
IcsA (VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula
batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica.
IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta
FATTORI DI VIRULENZA
spa surface presentation of invasion plasmid antigens
mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes.
spa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattiva Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula
187
Preinvasion step in the pathogenesis of Shigella spp. Ipa: invasion plasmid antigens; Mxi-Spa: membrane expression of Ipa proteins and surface presentation of antigens
A 37°C, VIRF e VIRB attivano operon spa, mxi e ipa
invasion plasmid antigens ipa, surface presentation of invasion plasmid antigens spa, membrane excretion of Ipa mxi, virulence vir genes.
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Early steps in the invasion of Shigella spp into M cells. Ipa: invasion plasmid antigen; Spa: surface presentation of antigens
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Cytoskeletal rearrangements induced during Shigella invasion of epithelial cells. Shigella secretes the effector proteins, such as IpaB, IpaC, IpaA and VirA, into host cells. IpaB and IpaC are integrated into the host membrane, and IpaC modulates Cdc42-dependent filopodial formation which, in turn, may cause activation of Rac1 and lamellipodial formation. IpaA binds vinculin, and the resulting IpaA−vinculin complex promotes depolymerization of actin filaments, which is thought to be required for modulation of lamellipodial formation. VirA binds / -tubulin heterodimers and induces MT destabilization. VirA-induced MT destabilization would in turn lead to MT growth and stimulation of the Rac1 activity, and thus evoke the local membrane ruffling.
192