IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA
DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE
CANNABINOIDES EN MARIHUANA POR HPTLC Y
CONFIRMACIÓN GC/MS
Katherinne Alcamán Pantoja
Perito Químico Sección Análisis de Ilícitos
Santiago, 19 de Mayo de 2015.
Droga ilícita de mayor consumo en
Chile.
Marihuana: Sumidad florida desprovista
de semillas y tallo de la cual no se ha
extraído la resina.
Aumento del consumo en 11 puntos
porcentuales (Decimo estudio nacional
de consumo de drogas en población
escolar, SENDA 2013)
Marco ley 20.000 que sanciona el tráfico
de estupefacientes y psicotrópicos.
Esquema de planta Cannabis sativa L.
Fuente:www.botanical-online.com/florcannabis.htm
Toxicodinamia:
Receptores: CB1 (SNC) y CB2 (Periféricos).
Principales cannabinoides: Delta-9-tetrahidrocannabinol (Δ-9-THC),
cannabidiol (CBD) y cannabinol (CBN).
Estructuras químicas de delta-9-tetrahidrocannabinol, cannabinol y cannabidiol.
Fuente: Manual para el análisis de productos de cannabis, ONU 2009.
Efectos y Riesgos asociados a su consumo:
- Alteraciones al SNC
- Sistema Respiratorio
- Sistema Cardiovascular
- Sistema Reproductor
Percepción de la
realidad y tiempo
Ansiedad, psicosis
Cuadro amotivacional
Bloqueo impulsos
nerviosos
Neurodegeneración
Técnicas de Screening
Prueba colorimétrica Fast Blue
Análisis Microscópico
Pelos glandulares y cistólicos con cannabinoides
Análisis Cualitativo y Cuantitativo
- Cromatografía (GC/FID; GC/MS; TLC; HPTLC)
- Espectroscopía (UV; FT-IR)
Prueba Fast Blue positiva para cannabinoides
Fuente: Gentileza Laboratorio Sección Análisis de
Drogas, ISPCH.
Esquema pelo cistolico de cannabis
Fuente: Toxicología de la Drogadicción, Manuel
Repetto, 1985.
Esquema de un HPTLC marca Camag ®
Fuente: http://www.camag.com
Análisis de varias
muestras simultáneamente.
Impurezas de la muestra
quedan retenidas en la
placa.
Bajo costo.
Ventajas
Dependiente de los insumos.
Desventajas
Parámetros:
Selectividad
Linealidad y rango
Limite de Detección (LOD)
Limite de Cuantificación (LOQ)
Precisión
Exactitud
Robustez
Incertidumbre
Equipos:
HPTLC: Aplicador de muestra automático, Cámara de Desarrollo Múltiple
Automático (AMD), Revelador por inmersión y Espectrofotodensitómetro.
Todos los equipos marca Camag®.
GC/MS: Cromatógrafo de Gas, con detector de espectrómetro de masas tipo
cuadropolo y autosampler. Todos los equipos indicados de marca Agilent®
“Manual de Métodos Recomendados para el Análisis de Cannabis en Laboratorios
de Drogas”, ONU 2009.
Material de referencia:
Material de referencia de cannabinol y cannabidiol de pureza mayor al 98%
marca Sigma Aldrich® y delta-9-tetrahidrocannabinol en ampolla disuelto en
etanol de pureza mayor al 98% marca Cerilliant ®.
Fase Estacionaria:
Placa sílica gel F 254 20x10 cm
Fase Móvil:
n-Hexano/Éter dietílico (80:20)
Longitud de onda de Detección: 206 nm
Ancho de Banda: 6 mm
Volumen de Inyección
Distancia recorrida: 6 cm
Activación de la placa: Sumergida en metanol y 30 minutos a 80°C
1 µL muestra real
3 µL pool
estándares
5 µL spike
Placa Sílica Gel
Elección de la Matriz:
- Compuesto llamado RIMONABANT.
- Antagonista de los receptores cannabinoides CB1, que actúa sobre el centro
regulador del apetito.
- Falso positivo para Fast Blue.
- Pelos glandulares similares a cannabis.
- No posee cannabinoides y tampoco genera absorbancia a la misma longitud
de onda que los analitos en estudio.
Té Chino Adelgazante
Método de extracción
100 mg de muestra
Aforo a 10 mL con acetonitrilo
Sonicar durante 30 minutos
Extracción sólido -líquido
Selectividad
Densitograma muestra fortificada concentración 1,5% (p/v) y
volumen de inyección 5 µL
Densitograma de un blanco, utilizando como matriz té
adelgazante.
Espectros UV superpuestos para cada analito
Densitograma en 3 dimensiones, en color lila y verde la curva de calibración en
duplicado y de color anaranjado las muestras fortificadas
Linealidad y rango
- Curva de calibrado de 8 puntos.
- Concentraciones: 0,5% p/v; 0,75% p/v; 1% p/v; 1,5% p/v; 3,5% p/v; 5,5% p/v; 7,5%
p/v; y 9,5% p/v.
-Análisis de varianza por regresión lineal.
THC CBD CBN
Linealidad
Curvas de calibración de 8 puntos para THC, CBN y CBD
Superposición de Curvas de Calibrado
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Área Promedio CBD
Área Promedio CBN
Área Promedio THC
Robustez
- Degradación de los analitos: Analizando la misma placa durante
3 días.
-Uso de 3 placas diferentes:
Merck GLP elaboración 2008
Merck fecha elaboración 2013
Distinto proveedor y tamaño Placas de silica gel marca MERCK
Fuente: http://www.merck
Robustez
-Uso de 3 placas diferentes:
- Fase móvil en distinta proporción:
Conc. Prom.
en % p/v
CBN (%p/v) CBD (%p/v) ∆9-THC
(%p/v)
Merck 1 GLP
1,657 1,426 1,718
Merck 2
1,631 1,289 1,617
Otro
proveedor
0,080 0,045 0,048
n-Hexano/ Éter dietílico 90:10 n-Hexano/ Éter dietílico 70:30 n-Hexano/ Éter dietílico 80:20
Parámetro
LOD/LOQ THC 0,7 / 2,3 %p/v
CBN 0,3 / 1,2 %p/v
CBD 0,3 / 0,9 %p/v
Repetibilidad
C.V = 0,1%
Reproducibilidad
C.V = 3,8%
Exactitud
Recuperación de 99,5%
Totalidad de las
muestras presenta
cannabinoides.
- Tiempo retención THC 5,4 min
- Tiempo retención CBN 6,5 min
Té adelgazante no
presenta
cannabinoides.
Se analizó un total de 15 muestras reales provenientes de
decomisos de distintas lugares.
Según Naciones Unidas el año 2009, la hierba de cannabis
contaba con un porcentaje de THC entre el 0,5 y 5%.
Un tercio de las muestras analizadas supera el porcentaje de
THC estimado por la ONU.
Promedio: 4,7 % THC
Código Muestra
CBN (%p/v)
CBD (%p/v)
∆9-THC (% p/v)
16328-2012-M1-2 7,339 N/D 3,061
2632-2012-M1-1 3,124 N/D 0,828
10693-2013-M1-1 0,791 N/D 6,244
16047-2013-M1-1 N/D N/D 4,389
18979-2013-M1-1 0,529 N/D 5,565
19339-2013-M1-2 N/D N/D 1,009
19735-2013-M1-1 0,848 N/D 3,784
5416-2013-M3-3 N/D N/D 1,334
5416-2013-M2-3 0,984 N/D 3,698
31131-2012-M1-3 3,015 N/D 2,760
20519-2013-M1-1 3,178 N/D 3,114
20751-2012-M1-1 1,537 N/D 1,075
21526-2013-M1-1 5,098 N/D 10,689
18295-2012-M1-1 N/D N/D 9,822
22109-2013-M1-1 2,740 N/D 12,557
Muestra Control 3,5%
p/v 3,482 3,399 3,301
Recuento 15
Promedio 4,66
Desviación Estándar 3,69
Coeficiente de Variación 79,25%
Mínimo 0,82
Máximo 12,55
Se implementó una metodología analítica para la identificación y cuantificación de cannabinoides: THC, CBD y CBN mediante cromatografía en capa fina de alto rendimiento con posterior confirmación mediante cromatografía gaseosa con detector masas.
Se determinó que la metodología analítica es precisa, exacta y robusta para los factores estudiados, además presenta límites de detección y cuantificación adecuados para los análisis requeridos.
Se determinó un método de extracción óptimo para las muestras de marihuana obtenidas por decomisos, tratándose de un método sencillo y reproducible.
Se estableció un método cromatográfico que permite la confirmación de los analitos estudiados en las muestras analizadas, obteniendo una corrida cromatográfica de 24 minutos que separa a los 3 compuestos de interés.
Se estableció que en Chile es posible encontrar marihuana que supera las concentraciones de THC estimadas por la ONU el año 2009, encontrándose una incautación que supera el 12% de dicho cannabinoide.
Herramienta esencial para el análisis de preparados de cannabis con potencial efecto terapéutico.
Gracias