LA GESTIONE DEGLI ALLERGENI IN AUTOCONTROLLO
Enrico PavoniIstituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna-Brescia
Roma 25/09/2013
Ruolo degli IIZZSS
Supporto agli organi di controllo (es: ASL, SIAN, UVAC, PIF), alle imprese (autocontrollo), ai consumatori (informazione e comunicazione)
Sviluppo di nuove metodiche (sempre più sensibili)
E.L.I.S.A.
CARATTERISTICHE DEI METODI DI ANALISI
1) MASSIMA SENSIBILITA’
2) ELEVATA SPECIFICITA’
3) STANDARDIZZABILI
DETECTION ALLERGENI
RICERCA DIRETTA DELLE PROTEINE ALLERGENICHE(E.L.I.S.A)
RICERCA DEL GENE CODIFICANTE (Real Time PCR)
Soluzioni di estrazione(ß-mercaptoetanolo, guanidina cloridrato,etanolo, PBS, Extraction additives®)
L’omogeneizzazione fondamentale buona riuscita analisi: minimo 50 g di matrice da omogeneizzare per processarne 0,25 – 1 g
Attraverso la rottura dei legami S-S, possono essere distrutte sia la struttura terziaria che la struttura quaternaria della proteina. L’etanolo denatura le proteine e le disidrata.
ANALISI IN AUTOCONTROLLO (ELISA):
GliadinaPARTICOLE, SUPERALCOLICI, DENTIFRICI, INSACCATI, SFARINATI DI SORGO, QUINOA, MAIS, AVENA
Gliadina, uovoPASTA, FARINE (materie prime), PRODOTTI DA FORNO, IMPASTI, PIATTI MENSE
ß-lattoglobuline, INSACCATI, PRODOTTI DELLA PASTICCERIA, SORBETTI
arachide, nocciola, mandorlaPASTE, BISCOTTI, CIOCCOLATA
CASI CLINICI
NON CONFORMITA’ e OSSERVAZIONI EVIDENZIATE ACCREDEIA
NC:Non sono stati effettuati controlli per la verifica dell' accettabilità della prova:
OSS:Non risultano evidenti registrazioni delle validazioni dei fogli di calcolo come previsto al p.to 13.3 del MQ
Pesce
Soia
Crostacei
Molluschi
Pistacchio
Sesamo
Sedano
Lupino*
Arachide*
*Allergia crociata anche grave (30-60% allergici all’arachide)
REAL TIME PCR
ESTRAZIONE DEL DNAbiglie magnetiche
ERBE PER ARROSTI, SPEZIE (sedano, soia)
MORTADELLASENZA PISTACCHIO(pistacchio)
IMPASTI PIZZE (farina di lupino)
ALIMENTI SOSPETTI PER CASI CLINICI(tutto il pannello)
REAL TIME PCRqualitativa
PCR: 2n filamenti n= numero cicliDopo 30 cicli:230= 1,07x109 > 1 miliardo di molecole identiche
PCR:PolymeraseChain Reaction
REAL TIME PCRChimica della TaqMan:
La Pol trova come ostacolola sonda TaqMan: R vicino a Q,non c’è emissione
La Pol comincia a rimuovere lasonda TaqMan (5’esonucleasi)
Rottura della sonda: R si allontana da Q ed emette fluor.
La Pol completa la polimerizzazione: il DNA è raddoppiato
Esperienze di laboratorio: pistacchio
Cross reattività con Anacardiaceae (es. Pepe, mango), noci e nocciole
PEPE
Flavonoidi!
SPEZIE ED ERBE AROMATICHEcontengono inibitori PCR
Diluendo il DNA diluisco gli inibitori
DNA t.q. DNA 1:5 - 1:10Soluzione:
Finalità N° Matrice
Autocontrollo 3225
2696 PASTA ALIMENTARE SECCA
108 CAMPIONI AMBIENTALI
86 ALTRE PREPARAZIONI ALIMENTARI
70 CARNE E INSACCATI
27 ALTRI ADDITIVI
9 ALIMENTI PRONTI COTTI
4 ADDITIVI
4 AMIDO
4 ALTRE CARNI
4 CAFFE'
2 PRODOTTI DELLA PASTICCERIA E BISCOTTERIA
1 SPEZIE
1 ACQUA
209 ALTRE MATRICI
CampionamentoAutocontrollogiugno 2012
÷giugno 2013
Trabatto 2 minuti di esposizione
Raffraddatore 5 minuti di esposizione
Silos carico pasta gluten free 10 minuti di esposizione
Glutine: CAMPIONI AMBIENTALI (piastre Petri per apposizione)
Pastificio in autocontrollo:Pasta “normale”Pasta gluten freePasta senza uovoPasta con uovo
STESSE LINEE DI PRODUZIONE MA IN PERIODI DIVERSIPulizia accurata ambienti di lavoro nei cambi di produzione
Uscita silos stoccaggio gluten free 15 minuti
Nastro trasporto 30 minuti – 9 ore
Stenditrice 50 secondi
Ponte esposizione 60 sec
FINALITA’
AUTOCONTROLLO
ALLERGENENon
rilevato* Rilevato* TOTALEGLUTINE 3020 132 3152 ß-LATTOGLOBULINE 19 0 19 UOVO 51 3 54 TOTALE 3090 135 3225
*Limite di quantificazione glutine = 5ppm. Limite di quantificazione ß-latto = 0.5 ppm. Limite di quantificazione uovo = 2.5 ppm.
Risultati autocontrollo
Finalità N° Matrice Attività di conferma per altro Ente
6
2 SOGLIOLA
1 ALTRE PREPARAZIONI ALIMENTARI
1 CALAMARI
1 ROMBO/HALIBUT
1 FILETTO DI ORATA Attività di controllo NAS 58
9 PASTA ALIMENTARE SECCA
7 BISCOTTI
4 FARINA
3 OMOGENEIZZATI DI FRUTTA PER LO SVEZZAMENTO
3 ALTRI INTEGRATORI
3 RAGU'
3 PREPARAZIONI PER ZUPPE, MINESTRE O BRODI
3 ERBE INFUSIONALI
2 ARROSTO DI TACCHINO
2 PASTICCERIA ARTIGIANALE DA FORNO
2 PRODOTTI PRIVI DI GLUTINE
1 OMOGENEIZZATI DI FRUTTA PER LO SVEZZAMENTO
1 PANE GRATTUGIATO
1 CRACKERS
1 AMIDO
1 ZUCCHERO BIANCO
1 FETTE BISCOTTATE, CRACKERS, GALLETTE ED AFFINI
1 TORTELLINI
1 PASTA CRUDA
1 SUGO
1 SPECK ALTO ADIGE IGP
1 ALTRI PRODOTTI PER DIETE SPECIALI 1 PASTICCERIA INDUSTRIALE DA FORNO A PASTA MOLLE 1 PASTA SECCA DI SEMOLA GRANO DURO
1 CACAO
1 OMOGENEIZZATI DI ORTAGGI PER LO SVEZZAMENTO
1 LATTE SOIA
1 GELATO
Totale 64
CampionamentoUfficiali
giugno 2012÷
giugno 2013
Finalità N° Matrice Piano Regionale Alimenti (Emilia Romagna)
169
74 PRODOTTI DA FORNO
71 ALIMENTI PRONTI COTTI
16 CARNE E SALUMI
8 PRODOTTI ITTICI Prelievo con finalità non definita
24
10 PRODOTTI PRIVI DI GLUTINE
3 PANE
2 DOLCI
2 PASTA ALIMENTARE SECCA
2 FETTE BISCOTTATE, CRACKERS, GALLETTE ED AFFINI
2 PREPARAZIONI GASTRONOMICHE
1 CRACKERS
1 PASTA COTTA
1 BISCOTTI
Tossinfezioni 1 1 CRACKERS
Totale 194
258 analisi
CampionamentoUfficiali/nongiugno 2012
÷giugno 2013
Risultati generali
glutine giugno 2012 – giugno 2013.
N° ANALISI
MATRICE <5ppm 5ppm<valore<20ppm 20ppm≤valore<80ppm TOTALEPASTA ALIMENTARE SECCA 2587 66 25 2678
PRODOTTI DA FORNO O PASTICCERIA 150 6 13 169
TAMPONI / PIASTRE PER APPOSIZIONE 98 2 5 105ALIMENTI PRONTI COTTI 73 1 74PREPARAZIONI ALIMENTARI 82 5 8 95
PREPARAZIONI GASTRONOMICHE 73 1 1 75SALSE 1 1INTEGRATORI 3 3PRODOTTI DIETETICI 2 2CAFFE' 4 4AMIDO 5 5CIOCCOLATO 2 2INSACCATI 79 79PRODOTTI ITTICI 22 22CARNE E DERIVATI 13 13ADDITIVI 7 7VERDURA, FRUTTA, CEREALI 39 39FORMAGGI 4 4ALTRO 24 3 1 28
TOTALE 3270 84 (2,5%) 51 (1,5%) 3405
GLUTINE mg/70cm2 TEMPO ESPOSIZIONE (h)
SILO PASTA LUNGA > 80 416SILO PASTA LUNGA 15,7 24SILO PASTA LUNGA 37,9 48SILO PASTA LUNGA 28,8 72SILO PASTA LUNGA 43,3 96SILO PASTA LUNGA 47,4 116
SCARICA SEMOLA* 5,9 6
*Contaminazione volontaria
Glutine: PIASTRE PER APPOSIZIONELavaggio 10 ml Et-OH 60%
• No cocktail solution (Mendez)• 980 µl sample diluent 1X + 20 µl sample• ELISA
N° ANALISI
MATRICENon rilevate (<0,5ppm)
Rilevate (≥0,5ppm) TOTALE
ACQUA 1 0 1ALTRI MATERIALI 8 0 8SALUMI 7 0 7PASTICCERIA E BISCOTTERIA 6 0 6TAMPONE 5 0 5 TOTALE 27 0 27
Risultati generali
ß-Lattoglobuline giugno 2012 – giugno 2013.
N° ANALISI
MATRICENon rilevate (<2,5ppm) Rilevate (≥2,5ppm) TOTALE
ALTRE SPEZIE 1 0 1PASTICCERIA E BISCOTTERIA 8 0 8FARINA 4 2 6FORMAGGIO GRATUGGIATO 5 0 5PASTA ALIMENTARE SECCA 31 1 32INSACCATI 2 0 2TAMPONE DA ATTREZZATURA 3 0 3 TOTALE 54 3 (5,2%) 57
Risultati generali
proteine dell’uovo giugno 2012 – giugno 2013.
Conclusioni
Glutine: 5 mg/kg < 2,5% < 20 mg/kg20 mg/kg < 1,5% < 80 mg/kgProteine uovo:5,2% > 2,5 mg/kg ß-Lattoglobuline: /
I prodotti alimentari italiani possono essere considerati “safe”