Relatore
Prof. Luciana Avigliano
Candidata
Laura Masciullo
EFFETTI APOPTOTICI DI ORIGANUM VULGARE IN CELLULE
TUMORALI DEL COLON
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA “TOR VERGATA”
CANCRO DEL COLON
FATTORI GENETICI
DIETA MEDITERRANEA: BASSO RISCHIOElevato consumo ortaggi, frutta, spezie, legumi, cereali
DIETA OCCIDENTALE: ALTO RISCHIObasso consumo di prodotti di origine vegetale
FATTORI AMBIENTALI
L’origano è ampiamente utilizzato in tutti i paesi del bacino
mediterraneo
Effetti chemiopreventivi dell’Origanum vulgare:
SCOPO DELLO STUDIO
proliferazione cellulare
stato redox
apoptosi
MODELLO SPERIMENTALE:CELLULE UMANE Cancerose: cellule di adenocarcinoma del colon (Caco2) Normali: colture primarie di fibroblasti e colonociti (FHC)
FOGLIE E FIORI ESSICCATI FRANTUMATI FINEMENTE
ESTRAZIONE CON ETANOLO 70% PER 24 ORE A 4°C, AL BUIO
FILTRAZIONE SU CARTA WHATMAN NO. 1
CENTRIFUGAZIONE A 2500 RPM PER 20 MIN
CONCENTRAZIONE DEL SUPERNATANTE SOTTO FLUSSO D’AZOTO
ESTRATTO DI ORIGANO LIOFILIZZATO
PREPARAZIONE DELL’ESTRATTO DI ORIGANO
Resa: 20 % (2.5 gr di origano essiccato = 0.5 gr estratto secco)
Capacità Antiossidante Totale: 2.4 ± 0.2 mmol di Trolox equivalenti/g di estratto secco
Caratterizzazione dell’estratto origano
Contenuto Totale Fenolico (Metodo Colorimetrico Folin-Ciocalteu):
150 mg di acido gallico equivalenti/gr di estratto secco
Composti fenoliciflavonoidi acidi fenolici
lignani monoterpeni
flavoni
flavonoli
flavanoni
antocianine
flavanoli
isoflavoni
stilbeni
ANALISI COMPOSTI FENOLICI (HPLC con rivelatore a fotodiodi = 310 nm)
0.00
100.00
200.00
300.00
400.00
500.00
600.00
700.00
800.00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
minuti
Acido caffeico
Acido rosmarinico
Acido ferulico Daidzeina
Esperetina
Composti fenolici identificati mediante analisi cromatografica (HPLC-DAD)
FENOLI CLASSE TEMPO DI RITENZIONE
(min)
CONCENTRAZIONE(mg/g di estratto secco)
% FENOLI
Ac. rosmarinico Acidi fenolici 26.7 55.20±6.00 31.80
Naringenina Flavononi 30.0 34.32±1.00 19.82
Esperetina Flavononi 34.1 2.35±0.11 1.36
Ac. cumarico Acidi fenolici 21.0 1.40±0.12 0.81
Carvacrolo Terpeni 42.0 1.30±0.09 0.75
Ac. gallico Acidi fenolici 2.1 0.61±0.06 0.34
Acido caffeico Acidi fenolici 15.0 0.81±0.08 0.46
Ac.clorogenico Acidi fenolici 13.1 0.72±0.08 0.41
(+) Catechina Flavanoli 11.2 0.21±0.02 0.11
Diosmetina Flavoni 40.5 0.33±0.03 0.20
Ac.protocatecuico Acidi fenolici 6.8 0.32±0.02 0.17
Ac. ferulico Acidi fenolici 24.3 0.15±0.01 0.08
Daidzeina Isoflavoni 31.2 0.07±0.007 0.04
Altri fenoli --- --- 71.24±10.0 41.18
FENOLI TOTALI 173±12.00 100
02040
60
80100
12 24 48 72
0
2040
60
80
100
12 24 48 72
% del controllo
% del controllo
#
##
#**
# #*
300 g/ml
500 g/ml
ore
ore
120
120
L’origano esercita differenti effetti sulle cellule normali e cancerose
FIBROBLASTIFHC
CaCo2
* p<0,05 # p<0,001
0
70
140
210
280
350
Eve
nti
100 101 102 103 104
FL2-H
0
70
140
210
280
350
Eve
nti
100 101 102 103 104
FL2-H
origano
Ipodiploide 24% G0/G1 31%G2/M 30%S 39%
Ctrl
Ipodiploide 10% G0/G1 49%G2/M 14%S 37%
L’origano promuove l’arresto della crescita nella fase G2 prevenendo
l’entrata in mitosi e inducendo morte cellulare
Analisi al citofluorimetro
L’origano induce sia la necrosi sia l’apoptosi
Colorazione con ioduro di propidio ed analisi al FACS
Normale
Apoptosi
Necrosi
Normale
Apoptosi
Necrosi
origanoCtrl
13 %
12 % 18 %
30 %
L’origano attiva le caspasi esecutrici
Ctrl origano
PARP (89 kDa)
caspasi 3 (17 kDa)
PARP0
2
1
3
Vol
te s
u co
ntro
llo
Casp-3
Ctrl origano
* *
* p<0,001
Via recettoriale
Via mitocondriale
pro-apoptotico
anti-apoptotico
tubulina
caspasi 8 (18 kDa)
APAF-1 (130 kDa)
Bak (25 kDa)
pro-caspasi 9 (47 kDa)
Bcl-xL (30 kDa)
L’origano attiva la via intrinseca e la via estrinseca dell’apoptosi
Bcl-xLBak
#
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0
2
4
1
3
5#
#
*
Vol
te s
u co
ntro
llo
Casp-8 APAF-1 Pro casp-9
Ctrlorigano
*
* p<0,05 # p<0,001
L’origano promuove una perturbazione nel potenziale di
membrana mitocondrialeColorazione con JC-1 ed analisi al FACS
origanoCtrl
Ctrl origano
Flu
ore
scen
za (
un
ità
arb
itra
rie)
L’origano riduce il glutatione totale ed incrementa il GSSG
Glutatione totale Glutatione ossidato
Livelli di ROSCapacità antiossidante totale
Ctrl origano
Ctrl origano
Ctrl origano
Glu
tati
on
e to
tale
(nm
oli/
mg
pro
tein
a)
nm
oli
Tro
lox
eq./m
g p
rote
ina
GS
SG
/GS
H x
100
Origano 36%Ctrl 32%
L’estratto di origano promuove:
Arresto della crescita e morte cellulare
Alterazione dello stato
redox
Attivazione delle vie apoptotiche
Tali effetti non sono ascrivibili ad un singolo componente, ma all’alimento “in toto”
I colonociti sono le cellule che “in vivo” entrano a direttocontatto con la spezia
La diffusione dell’origano potrebbe essere correlata a questi effetti benefici
Gli effetti anti-tumorali si ottengono con quantità di origano raggiungibili con la dieta Mediterranea
CONCLUSIONI
100 mg
Gli effetti protettivi dipendono dall’estratto “in toto” e non dai singoli
componenti
volte su controllo
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
CTRL
A. ROSMARINICO
A. CAFFEICO
A. CLOROGENICO
A. COUMARICO
A.GALLICO
CARVACROLO
(+) CATECHINA
A. PROTOCATECUICO
DAIDZEINA
A. FERULICO
ESPERETINA
NARINGENINA
DIOSMETINA
volte su controllo
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
CTRL ORI 500 MIX 13
**
* p<0,001