1
Sviluppo di metodi per la conferma di
additivi vietati in alimenti ad uso
zootecnico
PASQUALE GALLO
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno
Roma 16 novembre 2010
I Workshop Laboratorio Nazionale di Riferimento per gli
additivi nei mangimi
2
L’EVOLUZIONE DEI CONTROLLI
1999Parametri merceologici (umidità, ceneri, proteine,
grassi,fibra grezza )
Micotossine (AF B/G, OTA, ZEA)
Metalli pesanti (Pb, Cd, Hg, As)
Farmaci veterinari/additivi
Pesticidi / PCB
Prodotti di origine nazionale
2010Micotossine (AF B/G, OTA, ZEA, DON, FUM B, T2/HT-2,
ergotine)
Metalli pesanti (Pb, Cd, Hg, As, Sn, Zn, Cu, Cr, Mn, Mg, Fe)
Farmaci veterinari/additivi
Pesticidi / PCB
Diossine / PCB-dl
Prodotti nazionali, comunitari e di importazione extra-
comunitaria
3
L’EVOLUZIONE DEI CONTROLLI
METALLI
358
22%
MICOTOSSINE
412
26%
PESTICIDI e
PCB-ndl
59
4%
ALTRE PROVE
784
48%
METALLI
PESTICIDI e PCB
MICOTOSINE MANGIMI
ALTRE PROVE
2008
ALTRE PROVE
381
40%
PESTICIDI e
PCB
58
6%
MICOTOSSINE
319
33%
METALLI
205
21%
2009
4
L’EVOLUZIONE DEI CONTROLLI
Il Piano Nazionale Alimentazione Animale (PNAA)
il PNAA è finalizzato al raggiungimento di una maggiore
tutela della sanità pubblica ed a fornire ai consumatori
garanzie di salubrità, sicurezza e qualità dei prodotti di
origine animale
dal 2005
Indicazioni della Commissione Europea
Raccomandazioni delle missioni DG SANCO e FVO in
Italia
Aggiornamento normativo
Nuovi sviluppi scientifici
Emergenze sanitarie ed allerta comunitari
Monitoraggio
Analisi dei rischi
5
LA NORMATIVA DI RIFERIMENTO
Legge 15.02.1963 n. 281 e s.m.i. – Disciplina della
preparazione e del commercio dei mangimi
DM 20 aprile 1978 – modalità di prelevamento dei
campioni per il controllo ufficiale degli alimenti per gli
animali
DPR n. 433 del 2 novembre 2001 – Regolamento di
attuazione delle direttive 96/51/CE, 98/51/CE e
1999/20/CE in materia di additivi nell’alimentazione degli
animali
Regolamento 1831/2003/CE del 22 settembre 2003 sugli
additivi destinati all'alimentazione animale
6
LA NORMATIVA DI RIFERIMENTO
Regolamento (CE) n. 178/2002 stabilisce i principi generali e i
requisiti per la normativa degli alimenti, istituisce EFSA, definisce i
meccanismi del sistema di allerta rapido per gli alimenti e i
mangimi
Regolamento (CE) n. 882/2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a
verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di
alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali
i controlli siano periodici, con frequenza appropriata, in base alla
valutazione dei rischi e della specie animale di destinazione del
mangime, del numero e della tipologia delle aziende del settore
dei mangimi, delle caratteristiche e dell’uso del mangime o di
qualsiasi trasformazione, attività, operazione che possa influire
sulla sicurezza dei mangimi.
Regolamento (CE) n. 183/2005 che stabilisce requisiti per l’igiene
dei mangimi
sistema di “autorizzazione” degli operatori, compresi quelli della
produzione primaria, la programmazione dei controlli è funzione
dall’anagrafe degli operatori del settore dei mangimi
7
Regolamento 152/2009/CE del 27 gennaio 2009 che fissa i
metodi di campionamento e d'analisi per i controlli ufficiali
degli alimenti per gli animali
Direttiva 2009/8/CE della Commissione del 10 febbraio 2009
che modifica l'allegato I della direttiva 2002/32/CE del
Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda i
tenori massimi di coccidiostatici o istomonostatici presenti
per effetto di carry-over inevitabile in mangimi destinati a
specie non bersaglio
LA NORMATIVA DI RIFERIMENTO
8
ALTRI CONTAMINANTI AMBIENTALI
Pesticidi organoclorurati, pesticidi organofosforati, toxafene
Diossine, PCB-ndl e PCB-dl
Radionuclidi (137Cs, 134Cs)
Ferro, Mercurio, Piombo, Cadmio, Arsenico
METALLI PESANTI e ADDITIVI
Rame, Zinco, Cromo, Selenio, Ferro
Melamina
Nitrati/nitriti
MICOTOSSINE
Aflatossine B/G, Ocratossina A, Zearalenone, Deossinivalenolo,
Fumonisine B, Tossine T2 e HT-2
ALTRE ANALISI
Istamina
BHA, BHT, Formaldeide, Solfiti, EDTA
Le prove chimiche per il controllo degli alimenti ad uso
zootecnico
9
FARMACI VIETATI e ADDITIVI
CAF, Decochinato, Diclauzuril, Nitrofurani,
Tetracicline, Avermectine, Avilamicina, Beta-agonisti,
Carbadox, Olaquindox, Chinolonici, Corticosteroidi,
AINS, Acido acetisalicilico, Flavomicina, Ionofori,
Macrolidi, Melamina, Metilclopidolo, Nicarbazina,
Robenidina, Alofuginone, Nifursol, Nitroimidazoli,
Penicilline, Sulfamidici, Levamisolo, Virginiamicina,
Zincobacitracina A, Amprolium
Le prove chimiche per il controllo degli alimenti ad
uso zootecnico
10
Gli additivi per alimenti ad uso zootecnico
Commission - List of authorised additives in feedingstuffs
published in application of article 97 (b) of Council
Directive 70/524/EEC concerning additives in feedingstuffs
(2004/C 50/01)
Antiossidanti (sorbati, acido ascorbico e ascorbati,
tocoferoli, gallati)
Emulsionanti (saccarina, lecitine, acido alginico e alginati,
gomma di guar, cellulosa)
Carotenoidi e xantofille
Coloranti
Vitamine
Iodio, cobalto, molibdeno
Enzimi (fitasi, xylanasi, galattosidasi)
microrganismi
11
Le prove chimiche per il controllo degli alimenti
ad uso zootecnico:
caratteristiche, limiti e criticità
Circa 50 metodi di prova
e 150 sostanze
Validazione intra-laboratorio
(Regolamento 882/2004/CE)
Controllo qualità interno
processo analitico
(carte di controllo)
Circuiti inter-laboratorio
Accreditamento
12
LO SVILUPPO DI UN METODO DI PROVA
OBIETTIVOMetodo di screening o conferma
Tipo di rischio associato
REQUISITI
APPLICABILITÀ
Livelli di contaminazione
Limiti di legge
Metodi ufficiali
Piani di controllo
Disponibilità di materiali e di
strumentazione adatta
Disponibilità di personale adeguato
Costi
Rilevanza ai fini dell’utenza
13
Le prove chimiche per il controllo degli alimenti
ad uso zootecnico:
caratteristiche, limiti e criticità
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Estrazione con solventi
Ripartizione liquido-liquido
Cromatografia SPE
Cromatografia IAF
Derivatizzazione chimica o fotochimica
Mineralizzazione
SEPARAZIONE
Cromatografia in fase liquida
Cromatografia in fase gassosa
14
METODI DI SCREENING (qualitativi)
ELISA
TLC
colorimetria
METODI DI CONFERMA (quantitativi)
Spettrofotometria di assorbimento atomico (AAS)
HPLC-DAD, HPLC-FLD
GC-ECD, GC-NPD
GC/MS, GC/MS/MS
LC-MS/MS
L’analisi degli additivi in alimenti ad uso zootecnico:
caratteristiche, limiti e criticità
15
L’analisi degli additivi in alimenti ad uso zootecnico:
caratteristiche, limiti e criticità
Farmaci e additivi sono presenti a concentrazioni non
residuali
I limiti massimi sono in genere più alti che negli alimenti
Le acque di abbeveraggio non richiedono, in genere,
processo di estrazione/purificazione
VANTAGGI
Possibilità di ridurre gli interferenti di matrice per
diluizione
Metodi multi-residuo
16
Matrici molto variabili in composizione
Difficoltà di reperire i materiali di riferimento (es.
avoparcina)
Elevata sensibilità di alcune tecniche analitiche (LC-MS,
HPLC-FLD)PUNTI CRITICI
Necessità di metodi robusti
Impossibilità di sviluppare il metodo di prova
Possibilità di rivelazione di piccole quantità (contaminazioni
crociate)
Problema dei livelli farmacologicamente significativi di
farmaci/additivi
Tolleranze ammesse per i tenori di additivi consentiti
Limiti di quantificazione dei metodi per la revisione di analisi
L’analisi degli additivi in alimenti ad uso zootecnico:
caratteristiche, limiti e criticità
17
Alcuni metodi sono gli stessi pubblicati 10 anni
fa (amprolium, diclauzuril, carbadox,
olaquindox)
Alcune colonne HPLC non sono in produzione
Alcuni metodi possono essere più semplici,
rapidi, economici
Non è prevista la spettrometria di massa
Regolamento 152/2009/CE
Oligoelementi
Non è previsto l’uso di mineralizzazione a microonde
I Metodi prova della EU - limiti e criticità
Alofuginone LOQ = 1 mg/kg
Robenidina LOQ = 5 mg/kg
Diclauzuril LOQ = 0.5 mg/kg
Lasalocid A LOQ = 10 mg/kg
altri ionofori Non previsti
Nicarbazina Non prevista
Inadeguati
Anacronistici
Inapplicabili
18
DIRETTIVA 2009/8/CE DELLA COMMISSIONE
che modifica l'allegato I della direttiva 2002/32/CE del Parlamento
europeo e del Consiglio per quanto riguarda i tenori massimi di
coccidiostatici o istomonostatici presenti per effetto di carry-over
inevitabile in mangimi destinati a specie non bersaglio
coccidiostatici e istomonostatici sono additivi consentiti per alcuni
alimenti ad uso zootecnico
possibilità di contaminazione crociata (carry-over) in altri mangimi
per uso delle stesse linee di produzione
si può verificare nelle fasi di produzione, stoccaggio e trasporto
sono stabiliti i tenori massimi di coccidiostatici e istomonostatici
presenti, per effetto di carry-over inevitabile, in mangimi destinati
a specie non bersaglio
coccidiostatici e istomonostatici presenti per effetto di carry-over
inevitabile in mangimi destinati a specie non bersaglio sono
considerati sostanze indesiderabili (Direttiva 2002/32/CE)
la loro presenza non deve costituire un rischio per la salute degli
animali, la salute umana o l'ambiente.
19
Regolamento 152/2009/CE
I Metodi prova della EU - limiti e criticità
Regolamento 152/2009/CE Direttiva 2009/8/CE
(27.01.2009) (10.02.2009)
Alofuginone LOQ = 1 mg/kg LOQ < 0.030 – 0.090 mg/kg
Robenidina LOQ = 5 mg/kg LOQ < 0.7 – 2.1 mg/kg
Diclauzuril LOQ = 0.5 mg/kg LOQ < 0.01 – 0.03 mg/kg
Lasalocid A LOQ = 10 mg/kg LOQ < 1.25 – 0.090 mg/kg
altri ionofori Non previsti LOQ < 0.050 – 3.75 mg/kg
Nicarbazina Non prevista LOQ < 0.5 – 1.5 mg/kg
CONTAMINAZIONI CROCIATE
20
DIRETTIVA 2009/8/CE DELLA COMMISSIONE
Ionofori (lasalocid A, narasin, salinomicina, monensin,
semiduramicina, maduramicina )
< 0.05 – 3.75 mg/kg al 12% umidità
Robenidina < 0.7 – 2.1 mg/kg al 12% umidità
Decochinato < 0.4 – 1.2 mg/kg al 12% umidità
Alofuginone < 0.03 – 0.09 mg/kg al 12% umidità
Nicarbazina < 0.5 – 1.5 mg/kg al 12% umidità
Diclauzuril < 0.01 – 0.03 mg/kg al 12% umidità
Reperire i materiali di riferimento
Sviluppare nuovi metodi di prova
Ri-validare i metodi di prova esistenti
Usare tecniche di rivelazione MS
21
METODI DI PROVA PER COCCIDIOSTATICI ED
ISTOMONOSTATICI
Robenidina
Nicarbazina
HPLC-DAD
LC-MS/MS
Ionofori
Decochinato
Alofuginone
Diclauzuril
LC-MS/MS
MIGLIORAMENTO DELLE PRESTAZIONI
Colonne mid-bore (id 2.1 e 3.0 mm)
Colonne con particelle di 1.7 e 2.6 m
Nuove fasi stazionarie
22
VALIDAZIONE DEI METODI DI PROVAAllegato III Regolamento 882/2004/CE
1. I metodi di analisi devono essere caratterizzati dai seguenti criteri
a) Esattezza
b) Applicabilità (matrice e gamma di concentrazione)
c) Limite di rivelazione
d) Limite di determinazione
e) Precisione
f) Ripetibilità
g) Riproducibilità
h) Recupero
i) Selettività
j) Sensibilità
k) Linearità
l) Incertezza delle misurazioni
m) Altri criteri a scelta
2. I valori di precisione di cui al punto 1 lettera e) sono ottenuti in seguito ad
una prova inter-laboratorio conforme ad un protocollo internazionalmente
riconosciuto, oppure, qualora siano stati stabiliti criteri di efficienza per i
metodi analitici, sono basati su criteri di conformità ai criteri. I valori di
ripetibilità e riproducibilità sono espressi in forma internazionalmente
riconosciuta (per esempio intervalli di confidenza del 95%)
23
VALIDAZIONE DEI METODI DI PROVA
E CONTROLLO DEL PROCESSO
Ripetibilità Recupero
Alofuginone 0.5 mg/kg 80%
Robenidina ≤ 10% 85%
Diclauzuril ≤ 15-30%, 0.75 mg/kg 80%
Lasalocid A ≤7.5-15%, 15 mg/kg 90%
LOQ, LOD
Parametri del regolamento 152/2009/CE
Criteri non omogenei
Nessuna indicazione circa l’incertezza di misura e la
specificità, correzione per il recupero
Identificazione basata su spettro DAD e co-cromatografia
24
VALIDAZIONE DEI METODI DI PROVA
E CONTROLLO DEL PROCESSO
Criteri di prestazione simili a quanto riportato nelle linee
guida degli IIZZSS per i residui di farmaci veterinari negli
alimenti
Criteri di identificazione MS e MS/MS come da Decisione
2002/657/CE
Ampio intervallo di validazione
Carte di controllo
Correzione per il recupero
Calcolo dell’incertezza di misura come da linea guida
degli IIZZSS
25
L’ANALISI DI CONFERMA DEGLI IONOFORI
0 10 20
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 9.89MA: 11183316SN: 96
400 500 600
m/z
0
50
100
Rela
tive A
bundance 595.1
613.1577.1
0 10 20 30
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 9.88MA: 22244233SN: 496
17.36 24.74
400 500 600
m/z
0
50
100
Rela
tive A
bundance 595.1
577.1
0 10 20
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 11.96MA: 370840881SN: 743
660 680
m/z
0
50
100
Rela
tive A
bundance 675.2
693.2657.1
0 10 20 30
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 12.31MA: 701243981SN: 1199
22.169.07
660 680
m/z
0
50
100
Rela
tive A
bundance 675.2
693.1657.2
0 10 20
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 15.22MA: 161991453SN: 459
600 700
m/z
0
50
100R
ela
tive A
bundance 755.2
773.1
0 10 20 30
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 15.49MA: 307987097SN: 503
600 700
m/z
0
50
100
Rela
tive A
bundance 755.2
0 10 20
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 14.85MA: 84314398SN: 96
860 870
m/z
0
50
100
Rela
tive A
bundance 859.3
860.1 877.3
0 10 20 30
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 14.97MA: 173195733SN: 114
860 870
m/z
0
50
100
Rela
tive A
bundance 859.3
860.0 877.4
0 10 20
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 16.82MA: 126510078SN: 447
500 600 700
m/z
0
50
100
Rela
tive A
bundance 769.2
531.1
0 10 20 30
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 17.27MA: 253095532SN: 541
500 600 700
m/z
0
50
100
Rela
tive A
bundance 769.2
531.0
613.1
773.1
SALINOMICINA
MADURAMICINA
NARASIN
MONENSIN
LASALOCID A
Standard mix a 0.010 mg/kg Mangime a 5 mg/kg dil 1:20
377.0 377.0
531.1 531.1
431.0 431.0787.4 787.4
26
L’ANALISI DI CONFERMA DEGLI IONOFORI
Omogenazione
Estrazione con solvente
Diluizione 1:20 oppure 1:100
Analisi ion trap LC/ESI-MS/MS, eluizione isocratica
Intervallo di validazione fino a 150 – 200 mg/kg (monensin)
LOQ
- Narasin 0.50 mg/kg
- Monensin 1.0 mg/kg
- Maduramicina 0.050 mg/kg
- Lasalocid A 1.0 mg/kg
- Salinomicina 0.50 mg/kg
27
L’ANALISI DI CONFERMA DELLA FLAVOMICINA
Additivo e promotore di crescita
Usato per polli, tacchini, suini, bovini (1 – 25 mg/kg)
Vietato dal 2006 nella UE
È disponibile solo metodo di screening microbiologico (LOQ
0.5 -1.0 ppm)
Cooperazione LNR
Dipartimento di
Chimica IZS ME
Reperimento MR
Informazioni sulla disponibilità di MP
Sviluppo metodo di conferma LC-
MS/MS
Validazione del MP
Esecuzione delle prove per la rete
degli II.ZZ.SS.
28
Studio dello spettro ion trap
ESI-MS e ESI-MS/MS della
flavomicina
tune positivo LC-MS-MS-MS FLAVO 10 ppm in LC flowNL:4.43E5
+ c ESI Full ms [155.00-2000.00]
1300 1320 1340 1360 1380 1400 1420 1440 1460 1480 1500 1520 1540 1560 1580m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive A
bundance
[M+H] +
1581.91
1421.32
1436.82
1404.271389.89
1503.82 1567.761443.371497.821458.291332.80 1517.611361.71 1494.321310.06 1475.47 1535.451550.841337.70
LC-MS-MS FLAVO 10 ppm in LC flowNL 2.21E6T:
- c ESI Full ms [215.00-850.00]
500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive A
bundance
[M-H] 2-
789.90
701.12782.98694.13
797.89709.44 736.39 768.48 820.78666.27528.57 577.55 842.05551.19502.79 626.08651.53607.89
12 13 14 15 16 17 18
Time (min)
0
50
100
Rela
tive A
bundance
RT: 15.54
MA: 1811519
SN: 663
17.15
NL: 5.35E4
m/z= 575.30-576.30 F: - c ESI
SRM ms2 [email protected]
[553.40-555.40, 574.90-576.90]
MS 22-10-09std125ppb
554 556 558 560 562 564 566 568 570 572 574 576
m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive A
bundance
575.72
576.39554.23
12 13 14 15 16 17 18
Time (min)
0
50
100R
ela
tive A
bundance
RT: 15.59
AA: 696287
SN: 295
NL: 1.97E4
m/z= 1151.70-1152.70 F: - c ESI SRM
[1108.40-1110.40, 1151.30-1153.30]
MS ICIS 22-10-09std250ppb
1110 1115 1120 1125 1130 1135 1140 1145 1150
m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive A
bundance
1152.17
1109.01
1110.05
Ion trap LC-MS/MS IONI NEGATIVI
STD 100 ppb m/z 790 575.8
STD 100 ppb SRM m/z 1580.9 1152.2
L’ANALISI DI CONFERMA DELLA FLAVOMICINA
29
Analisi di conferma della FLAVOMICINA
STUDIO DELLE CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE E MOLECOLARI
PURIFICAZIONE DA MANGIME
Estrazione con solvente
Purificazione SPE
Analisi ion trap LC-MS/MS
livello,
mg/kg
Recupero
medio %
(n = 12),
riproducibilità
intermedia
(n = 12), RSD
Ripetibilità
(n = 6), RSD
I II
0.50 83.9 15.5 13.8 18.2
1.0 94.2 16.0 12.0 20.5
30.0 88.4 20.0 22.4 19.3
ACQUA DI ABBEVERAGGIO
Filtrazione, centrifugazione
Analisi ion trap LC-MS/MS
LOQ = 0.050 g/ml (acqua)
LOQ = 0.20 mg/kg
(mangime)
3 IP (conferma)
Linearità 0.050–1.0 g/ml
Comunicazione al LNR
Comunicazione alla rete degli
IIZZSS
Analisi di controllo in routine
L’ANALISI DI CONFERMA DELLA FLAVOMICINA
30
Indagine NAS per uso di un additivo incognito (2008)
Mangime composto contenente una polvere grigia
(Umbria)
Sospetto di uso illecito di un additivo
Nessuna indicazione sull’identità della sostanza
Arricchimento del miscuglio nella frazione additivata
Prove di solubilità (acqua, metanolo, acetonitrile, TBME,
soluzione acida e basica)
Analisi UV-visibile (cromofori caratteristici)
Prove mediante spettrometria di massa ION TRAP ESI / MS
31
Studio dello spettro ion trap ESI-MS full scan, ioni positivi
Studio dello spettro ion
trap ESI-MS /MS ioni positivi
0.07-0.28 AV: 13
NL:2.48E6T: + c ESI Full ms [50.00-430.00]
50 100 150 200 250 300 350 400
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive A
bund
ance
205.2
178.2
206.3391.3 146.3207.30103.29 117.34 179.29
150.2477.19 409.28309.28 331.39285.07233.26 393.28355.90265.0961.03
0.91-1.92 AV: 72
NL:3.49E3T: + c ESI Full ms [400.00-430.00]
400 402 404 406 408 410 412 414 416 418 420 422 424 426 428 430
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive A
bund
ance
428.9
409.2418.7
407.3
411.28
425.29
429.61427.28
410.37
405.28415.13
412.34408.36420.90 424.48416.14 426.37417.17
423.11401.22 406.35
402.26 414.15 428.28404.21
LEVAMISOLO C11H12N2S
204.28 g/mol
0.43-0.62 AV: 10
NL: 1.84E5T: + c ESI Full ms2 [email protected] [55.00-430.00]
100 150 200 250 300 350 400
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive A
bundance
178.14
145.33
188.3088.21
205.20129.25117.46 162.2587.41 385.49248.70
Indagine NAS per uso di un additivo incognito (2008)
32
29-07-08prmangime100ppmextractdil1-10 7/29/2008 12:37:12 PM
RT: 2.44 - 6.48 SM: 15G
3 4 5 6
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Ab
un
da
nce
RT: 5.21
MA: 19407071
SN122
RT: 3.87
AA: 2715170
SN : 26 RMS
NL: 6.52E5m/z= 177.60-178.60 F: + c ESI SRM
[144.00-146.00, 177.00-179.00,
204.00-206.00] MS
29-07-
Prova recupero
100 ppm
Dil 1-10
RT: 3.30 - 6.66 SM: 15G
4 5 6
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Ab
un
da
nce
RT: 5.11
AA: 25491167
SN: 901
RT: 3.89
AA: 4853556
SN : 197
NL: 1.31E6
m/z= 177.60-178.60 F: + c ESI SRM
[144.00-146.00, 177.00-179.00,
204.00-206.00] MS ICIS
Std levamisolo
1 ppm
RT: 2.76 - 7.29 SM: 15G
3 4 5 6 7
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Ab
un
da
nce
RT: 5.19AA: 25866896
SN
:
627
RT: 3.90
AA: 4862277
SN : 183RT: 6.87
AA: 593880
SN : 16
NL: 1.06E6m/z= 177.50-178.50 F: + c ESI SRM
[144.00-146.00, 177.00-179.00,
204.00-206.00] MS ICIS
Campione
Dil 1-20.0000
29-07-08prmangime100ppmextractdil1-10 # 136-151 RT: 5.03-5.30 AV: 16 NL:
F: + c ESI SRM ms2 [email protected] [144.00-146.00, 177.00-179.00, 204. ...
150 160 170 180 190 200
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Ab
un
da
nce
178.00
145.06
178.80145.81 204.84
177.29
29-07-08stdlevamextract1-0ppm # 137-150 RT: 4.95-5.16 AV: 14 NL: 1.22E6
F: + c ESI SRM ms2 [email protected] [144.00-146.00, 177.00-179.00, 204. ...
150 160 170 180 190 200
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Ab
un
da
nce
178.01
145.01
178.81145.80
205.13177.29
29-07-08mangimedil1-200000 # 141-161 RT: 5.01-5.34 AV: 21 NL: 9.96E5
F: + c ESI SRM ms2 [email protected] [144.00-146.00, 177.00-179.00, 204. ...
150 160 170 180 190 200
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Ab
un
da
nce
178.00
145.01
178.80145.80
204.99177.32
Analisi IT LC/ESI-MS/MS
LEVAMISOLO C11H12N2S
(tetramisolo) circa
3000 ppm nel miscuglio
5 g di miscuglio sciolti in
MeOH
Centrifugare
Diluire con fase mobile
HPLC
Colonna Synergi MAX
SRM m/z 205 178 m/z 205 145
Indagine NAS per uso di un additivo incognito (2008)
33
Il supporto all’azione giudiziaria
Indagine NAS su uso illecito di promotori di crescita
Esame di 2 campioni di acqua di abbeveraggio
Analisi HPLC-DAD con metodo validato e riconosciuto ORL (LOQ =
5 ppm)
Presenza e conferma del promotore di crescita a 15 ppm
(campione 1) e 32 ppm (campione 2)
Revisione di analisi (ISS) :
solo campione 2 confermato
a 29 ppm
Comunicazione
all’autorità
giudiziaria
34
Conclusioni
Settore in evoluzione (normativa, controlli)
Normativa recente ma a volte inadeguata
Tutelare la sicurezza degli alimenti e il benessere animale
Protezione delle specie non target di trattamenti
farmacologici
Estensione del campo dei controlli (nuovi contaminanti
ambientali e additivi)
Potenziamento tecnico e scientifico dei laboratori di
controllo
Uso delle tecniche con rivelazione MS
Scarso supporto tecnico e scientifico dai CRLs
35