TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamentoModena 18-19 novembre 2010
Varianti genomiche di significato incerto: criteri per la caratterizzazione e
l’identificazione delle classi di rischio
V. Calò, A. Russo
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Analisi genetica per la sindrome HBOC
Storia familiare
Paziente con una forte storia familiare
Counseling Oncogenetico
Valutazione del rischio e counseling
• valutazione psicosociale e supporto
• Rischi del counseling
• Educazione
• Discussione del test genetico
IC
Test genetico
Esito test INDETERMINATO INCONCLUSIVO
IC DIAGNOSTICO
POSITIVO
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
CaOv25
50
75
85%
56%50%
20%
15%
10%
40%
1,6%
Moderato(Familiare)
Alto(Ereditario)
Medio (Sporadico)
CaOv
BRCA1
BRCA2
BRCA1
&
BRCA2
Range di Rischio
Rischio cumulativo di CaM e CaOv a 80 aa
CaM
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
ANALISI MUTAZIONALE
Campione di sangue periferico
Estrazione del DNA
Amplificazione genica di tutti gli esoni codificanti e delle zone di confine
esone- introne
dHPLC
Sequenziamento
automatico
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
ANALISI MUTAZIONALE
Campione di sangue periferico
Estrazione del DNA
Amplificazione genica di tutti gli esoni codificanti e delle zone di confine
esone- introne
dHPLC
Sequenziamento
automatico
dHPLC
WT
mutation
polymorphism
DS CAA TAA
Gln Lys
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Affected
Female
Male
Death
BC 45
BC 39BC 40BC 50BC 53
BRCA2-R2034C
Esito del test Genetico : risultato INCONCLUSIVO
Famiglia
277Si
risultato INCONCLUSIVO
Variante di significato sconosciuto “incerto”(VUS)
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Esito del test genetico: risultato INCONCLUSIVO
INCONCLUSIVOVUS identificata
TEST DIAGNOSTICO probando con forte
storia familiare (criteri HBOC)
Significato clinico
• Predisposizione genetica al CaM/CaO non confermata
• Rischio stimato sulla base della storia personale e familiare
• tutti i membri delle famiglie a rischio potrebbero essere inseriti nei programmi di sorveglianza
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
• 20-30% dei tests BRCA riportano una VUS;
• Di solito mutazioni missenso ma anche delezioni/inserzioni in-frame emutazioni silenti con possibile effetto sullo splicing;
• Non è prevedibile l’effetto sulla funzione della proteina;
• VUS nuove o rare da interpretare;
• Nella regione codificante del gene o nella regione intronica oppure nelleregioni 5’UTR o 3’UTR;
•Non sono state identificate VUS in entrambi i geni.
Risultato “Criptico”
Esito del test genetico:
risultato INCONCLUSIVO
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Missense
Deletions/Insertion in frame
IVS
VUS20-30%
Frameshift
Nonsense
Splice (7%)
Missense (5%)
Rearrangement
Deleterius70/80%
Synonimus
Neutral 5%
Missense
25-30%
Small Insertions/
Deletions 1%
Rearrangements
3-5%
Synonim
3%
IVS
15%
Frameshift
30-40%Nonsense
15-20%
Tipo e frequenza delle mutazioni nei geni BRCA
Significato funzionale
Database BIC (Breast Cancer Information Core), 2007
Walsh et al.JAMA, March 22/29, 2006—Vol 295, No. 12
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Una VUS può complicare più che migliorare il processo di valutazione del rischio.
Numero e tipi di parametri utili a studiarle.
Classificazione dei livelli di rischio dei portatori di VUS.
Interpretazione clinica delle VUS
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Linee guida per lo studio delle VUS
http://cmgsweb.shared.hosting.zen.co.uk/BPGs/pdfs%20current%20bpgs/UV%20GUIDELINES%20ratified.pdf
Forniscono un set di standards stabiliti per assistere iricercatori nella determinazione del significato clinicodelle VUS nei test genetici
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Linee guida per lo studio delle VUS
Greenblatt MS, Hum Mut, 2008
I database locus specifici (LSDB) sono collezioni accurate delle varianti di sequenza in un gene specifico che causa un disordine mendeliano o un cambio fenotipico. (Cotton , 2008)
Lo IARC (Unclassified Genetic Variants Working Group) ha individuato nel BIC database (http://research.nhgri.nih.gov/bic) il catalogo più adeguato per l’interpretazione delle VUS dei geni BRCA.
Dati genetici, epidemiologici, patologici, in vitro e computazionali contribuiscono all’interpretazione delle VUS.(Couch et al., 2008, Goldgard et al., 2008, Hosfra et al., Spurdle et al., 2008, Tavtigian et al., 2008).
Un nuovo progetto di supporto è lo Human Variome Project (HVP).
Obiettivi : 1) standard per costruire i LSDB database,2) validazione, quantizzazione e interpretazione dei dati,3) trasparenza dei dati riportati
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Classe Descrizione Strategie di Sorveglianza
1 Non patogenica (nessun significato clinico) p< 0.001
Sorveglianza come da risultato negativo
2 Bassa patogenicicità (Basso significato clinico)0.001< p > 0.049
Sorveglianza come da risultato negativo
3 Significato clinico incerto0.05 < p > 0.949
Strategia scelta in base alla storia familiare ed altri fattori di rischio
4Potenzialmente patogenica
0.95 < p > 0.99
Sorveglianza per pazienti ad alto rischio
5Alta Patogenicità
p>0.99Sorveglianza per
pazienti ad alto rischio
Sistema di classificazione proposto per le VUS
Plon SE , Hum Mut, 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Standard di qualità
Lo staff di lavoro dovrebbe avere i requisiti minimi di standard a livello internazionale (ISO 17025 e 15189).
Validazione dell’esecuzione del test di diagnostica molecolare.
Approccio oggettivo alla nomenclatura di tutte le varianti.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Nomenclatura della mutazione
Prima tappa per una corretta interpretazione della variante è la sequenza di riferimento da GeneBank secondo le linee guida della Human Genome Variation Society (HGVS). http://www.hgvs.org/mutnomen/
Nomenclatura stabile, significativa e inequivocabile.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Linee di evidenza
• Letteratura, database di mutazione e di SNPs
• Localizzazione della mutazione all’interno del gene
• Analisi della variante in un gruppo controllo
• Co-presenza di una mutazione deleteria
• Co-segregazione della variante e della malattia all’interno della famiglia
• Presenza varianti de-novo
• Predizione in silico- missenso e effetti di splicing
• Perdita di eterozigosità e dati patologici
• RNA/splicing studies
• Analisi biochimico/funzionale
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Letteratura, database di mutazione e di SNP
Database dedicati: HGMD, OMIM, dbSNP/Ensembl, masoprattutto BIC database e per la letteratura PubMED, GoogleScholar oppure Web of Science.
HGMD studia malattie ereditarie. Ogni variante si presenta una sola volta.
OMIM include le varianti di sequenza identificate nel gene di interesse riportando l’autore chela identificata per la prima volta, la frequenza nelle popolazioni, il significato storico, ecc..
dbSNP/Ensemb è un catalogo generale della variazione del genoma in alcune specie e parte delgenoma. Le varianti includono SNP, inserzioni e delezioni, regioni che non variano.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Localizzazione della mutazione all’interno del gene
1 2 3 45 6 7 89 10 11 1415161718 2724
1920 21 22
23 25 26
BRCA1
BRCA2
Solo il 5% delle missenso nel dominio "ring finger" del gene BRCA1 sono patogene.
C
C
C
C
C
HC
C
znzn
III
I
II
C
N
19 20 21
241615131187652
17
18 2223
12 143 9 10
1
Ring domain BRCT domains
P
N C
P P
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Analisi della variante in un gruppo controllo
Consente di escludere la patogenicità: se la variante ha una frequenza allelica superiore al 1% può essere considerata una variante polimorfica con significato clinico neutro.
- Omogeneità etnica e numerica della stratificazione del gruppo controllo. Tang TS., 1999
Judkins et al.,Mut Res., 2 005
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Co-presenza in trans con una mutazione deleteria
Le VUS identificate in trans con mutazioni patologiche riducono in parte il rischio di malattia.(Hohenstein, 2001)
Tali dati sono relativamente disponibili.
41 VUS del gene BRCA1 furono escluse perché in trans con mutazioni patogene e vennero considerati SNPs di significato clinico neutro.
(Judkins et al.,C anRes, 2005)
Tavtigian S.V. et al, Fam Cancer 2006
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Co-segregazione della variante all’interno della famiglia
• Provenienza etnica• Tempo lungo per l’analisi• Eredità poligenica• Penetranza/ espressivià/ fenocopie• Perdita di informazione clinica• Misura piccola della famiglia
Easton D.F. et al Am. J.Hum. Genet 2007Goldgar D.E. et al Am. J.Hum. Genet 2004
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Conservazione degli aa tra le specie:varianti missenso
Programmi disponibili di analisi in silico; Clustal, SIFT, Polyphen, Align GVGD etc..
Tavtigian S.V. et al, Hum. Mutat. 2008 Fleming, M.A et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003Ramirez, C.J et al, Oncogene 2004 Abkevich, V. et al, J. Med. Genet. 2004 Spearman, A.D. et al, J. Clin. Oncol. 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Effetti di predizione in silico dello splicing
Programmi disponibili dell’analisi in silico: Splicing sequences finder; EMBL
alternative splicing site; Fruitfly etc
www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2 www.genet.sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html www.umd.be/SSF
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Considerazioni sulle IVS
• Tessuto valido e appropiato per lo studio dell’RNA.
• L’espressione biallelica confermata dagli studi in vitro di RNA ne esclude la patogenicità.
• Pochi programmi consentono in base al sito intronico di analizzare la sequenza consensus.
AGGURAGU CTRAYY YYYYYYYYYYYYNCAG5’ 3’
EX1 INTRONE EX2
EX1 EX2 Porzione di un mRNA
SITO DI SPLICING 5’
SITO DI SPLICING 3’
Sito donatore GU
Sito accettore GU
Punto di ramificazione A
Bonatti et al., 2006,Spurdle S. et al., 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Perdita di eterozigosità (LOH)
I tumori BRCA-pos. presentano LOH più frequentemente delleforme sporadiche.(Chenevix-Trench, G. et al .,Can Res. 2006; Osorio A. et al., Int.J. Cancer 2002; Osorio A. et al Hum Mut.,2007)
LOH può sostenere la patogenicità della VUS identificata.
Svantaggio: disponibilità del tessuto e incosistenza dell’assenza diLOH.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Dati patologici: tumori BRCA1- e BRCA2-correlati
CaM associato a BRCA1 è spesso ER, PgR e HER2 neg., più spesso basal like, con conte mitotiche alte e alto grado istologico.(Hofstra R.M. et al Hum. Mutat. 2008;; Foulkes W.D. et al J.N.C.I 2003; Turner N. et al Nat. Rev. Cancer 2004)
CaM associati a BRCA2 sono di alto grado, hanno fenotipi luminali e raramente overesprimono HER2.(Spearman A.D. et al J.C.O. 2008; Bane A.L. et al ,Am J. Surg. Pathol. 2007)
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Valutazione dei metodi funzionali
I metodi biochimico-funzionali valutano l’impatto dei cambiamentiamminoacidici nelle proteine BRCA1 e BRCA2.
E’ stato necessario sviluppare metodi multipli in funzione dispecifiche funzioni delle proteine in specifici domini.
Svantaggio:
- E’ raro che il laboratorio di diagnostica si occupi di analisi in vitro.
- Sensibilità e specifità dei metodi variano nei studi in vitro.
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Metodo funzionale per BRCA1/BRCA2
BRCA1• Metodo dell’attività trascrizionale
• Attività di ubiquitina ligasi BARD1 correlata
BRCA2• Metodo di riparo per ricombinazione omologa
• Amplificazione del centrosoma
Carvalho MA et al., 2007; Couch FJ et al.,2008; Farrugia S et al., 2008)
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Valutazione degli effetti funzionali delle VUS
Couch F.J. Et al., Human Mutation, 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Sito di allineamento Align-GVGD
Variazione di Grantham (GV)GV=0: posizione è invarianteGV> ~60: sostituzione non conservativa è tollerata
Deviazione di Grantham (GD)GD=0: sostituzione è all’interno del range osservato di variazioneGD> ~60: sostituzione è non-conservativa all’interno del range divariazione
Website http://agvd.iarc.fr
Modelli integrati: Allineamento GVGD
Grantham, R. et al, Science 1974 Tavtigian, S.V. et al, Fam. Cancer 2006Tavtigian, S.V. et al, Hum. Mutat. 2008
Easton, D.F. et al, Am. J. Hum. Genet. 2007
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamentoTavtigian et al., 2008
Modelli integrati: Allineamento GVGD
o Metodo alternativo e multifattoriale esteso per la classificazione delle VUS (GVGD+AR+ERS)
o migliore stima del rischio genetico
AR= ascertainment ratio Misura del rischio genetico strettamente correlata ad un’ ODDS RATIO ma applicata a varianti rare
ERS= enrichment ratio Correlata a misure della variazione dei codoni, legata a pressione evolutiva selettiva
Tavtigian, S.V. et al, Fam. Cancer 2006Tavtigian, S.V. et al, Hum. Mutat. 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Modelli integrati basati sulla combinazione di variabili differenti
Osservazioni epidemiologiche dirette: analisi di cosegregazione,analisi di casi-controllo, storia personale e familiare, copresenza dimalattia e mutazione.
Misure indirette: conservazione dell’aa, severità del cambio aa,evidenze dei metodi funzionali.
Goldgard D.E. et al, Am.J.Hum.Genet. 2004
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Modello integrato: VUS Predict
• Allineamento GVGD
• VUS Predict (storia personale, dati patologici, genotipo)
VUS
L22ST37KK45Q Non conservata Neutra
PatogenicaAltamente conservata
Cambi aa patogeni
C39R, C61G, C44S e C44Y
A-GVGD conferma che la sostituzione missenso è patogena
VUS Predict assegna una percentuale in favore dell’effetto deleterio
Sweet K., Senter L. et al , Breast Cancer Res Treat 2010
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Il problema delle mutazioni VUS
Non sempre è possibile effettuare tutti gli step per ogni variante.
Tutte le analisi riassumono i risultati e decidono la probabilepatogenicità.
OBIETTIVO: offrire a tutti i pazienti la stessa
qualità di cura!
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Giannini G. et al JCO 2008
• Sostituzione non riportata nel BIC;• Allineamento con 9 sequenze ortologhe;• LOH (probando, zie affette da CaM e CaO); non riscontrata nelcampione controllo ;• Tutte queste osservazioni supportano la possibilità che lavariante H1686Q è …... patogena.
BRCA1 5177 T>A; H1686Q
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Y179C, F486L, N550H
C. Augello, Ann Oncol. 2006, Judkins ea lMutation Research, 2005, Judkins et al. Cancer Res,2005
VARIANTE
NON
CLASSIFICATA
Aminoacido
WT
Variazione
Aminoacidica
Y179C
F486L
N550Hc
c
c
Caligo M.A. Hum. Mut, 2008
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VARIANTI DI SIGNIFICATO CLINICO INCERTO
Variante di
sequenzaEsone NT Codone
Sostituzione
di base
Sostituzione
aminoacidica
Tipo di
Mutazione
N°
Pts
N° volte
in BIC
Y179C 8 655 179 A to G Tyr/Cys M 1 54
A622V 10 2093 622 C to T Ala/Val M 1 1
A521T 11 1680 521 G to A Ala/Thr M 2 2
V740L 11 2337 740 G to C Val/Leu M 1 1
Variante di
sequenza
Eson
eNT Codone
Sostituzione
di base
Sostituzione
aminoacidica
Tipo di
Mutazione
N°
Pts
N° volte
in BIC
A22T 2 292 22 G to A Ala/Thr M 1 0
IVS2-7T>A 3 296-7 - T To A - IVS 1 2
Y42C 3 353 42 A to G Tyr/Cys M 1 141
T200I 7 827 200 C to T Thr/Ile M 1 0
A2466V 14 7625 2466 C to T Ala/Val M 1 48
T3013I 23 9266 3013 C to T Thr/Ile M 1 53
IVS24-16T>C 25 9485 - T to C - IVS 2 6
IVS25-12T>G 26 9484 - T to C - IVS 1 1
BRCA1
BRCA2
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Rappresentazione dell’approccio multi-determinanteper la classificazione clinica delle BRCA-VUS
Calò V., et al ., Cancers 2010
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Rappresentazione schematica di un possibile metodo di analisi multi-parametrica suggerito
Calò V., et al . Cancers 2010